唐昊 馬洪霜 王昌吉 王明珺 甘曉鳳 孫燦 羅朝兵

(樂山師范學院，樂山，614000)

慈竹(Bambusaemeiensis)屬于禾本科慈竹屬，廣泛分布于四川、貴州、湖南等低丘、平原地區(qū)，是我國西南地區(qū)具有較高經(jīng)濟價值的竹種[1]。慈竹筍為慈竹的嫩芽部分，有著極高的食用、藥理價值，是夏季最受歡迎的時令筍之一。其鮮筍顏色潔白，口感清脆，可當作鮮菜或制成筍干、罐頭等多種食品[2]。然而，竹筍被加工成各種食用產(chǎn)品時會產(chǎn)生大量的竹筍廢棄物，對其處理不當將會造成較為嚴重的環(huán)境污染，給生活帶來不利影響。目前，我國雖然有著豐富的竹筍資源，但其總體利用率較低[3]。因此，如何高效地開發(fā)、利用竹筍廢棄物是當今竹產(chǎn)業(yè)中研究熱點之一[4]。

竹筍筍殼緊密地包裹著竹筍，隨著竹筍發(fā)育逐層掉落(圖1)。筍殼作為竹筍產(chǎn)業(yè)主要廢棄物之一，其應(yīng)用主要是將筍殼制成紡織纖維、動物飼料、液體燃料及工業(yè)原料，對其的研究主要是針對筍殼內(nèi)的活性酶[5]。楊樂等[6]利用樹脂法提取純化竹筍殼中的黃酮物質(zhì)。謝濤等[7]研究了竹筍殼中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的組合分離技術(shù)。Katsuzaki et al.[8]從竹筍殼中分離并鑒定出紫杉葉素(Taxifolin)、苜蓿素(Tricin)2種抗氧化物質(zhì)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，筍殼提取物具有抑菌活性。Park et al.[9]采用不同溶劑提取了毛竹、紫竹竹筍中的活性物質(zhì)，并測定了其抑菌作用、抗氧化能力及對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制效果。高雪娟等[3]通過超聲波輔助-有機溶劑提取法獲取毛竹筍殼的活性物質(zhì)，并探究其抑菌效果。Tanaka et al.[10]確定了竹筍皮中的甲醇提取物具有抑菌活性，分離出的活性成分鑒定為豆甾醇(Stigmasterol)、二氫菜子甾醇(Dihydrobrassicasterol)。許麗旋等[11]利用相似相溶原理提取毛竹筍殼中黃酮物質(zhì)并對其進行了抑菌活性測定。

為了更好的挖掘筍殼的價值，實現(xiàn)竹產(chǎn)業(yè)效益的最大化，以現(xiàn)有研究為基礎(chǔ)，本研究以慈竹筍殼作為試驗原料，利用索氏提取法提取慈竹筍殼的活性物質(zhì)，并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定其組分。通過K-B抑菌圈方法測定慈竹筍殼提取物的抑菌活性，同時探究其穩(wěn)定性是否受溫度、作用時間的影響。本研究為竹筍殼的高效利用及今后新型生物殺菌劑的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及供試菌種

2019年6月于四川省樂山市中區(qū)竹林(103°77′E，29°57′N)采集慈竹筍殼。置于陰涼環(huán)境通風，烘箱60 ℃烘干至恒質(zhì)量，研磨成粉，過40目篩[3]后封存待用。

供試菌種為大腸桿菌(Escherichiacoli)、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、海綿膠煤炱菌(Scoriasspongiosa)，以上菌種均由竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室提供。

1.2 慈竹筍殼提取物的制備

參照洪宏等[12]的方法制備慈竹筍殼提取物。將抽提預(yù)處理1 d的定性濾紙及棉線取出，稱取5～10 g的慈竹筍殼粉末放入半徑為2.5 cm，高為10 cm左右的圓柱形濾紙包(最上端不超過虹吸管上端)，放入提取瓶內(nèi)。添加120 mL的100%乙醇(2次虹吸的量)進行抽提，直至提取瓶中液體為無色或透明時停止抽提。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將收集瓶中綠色液體進行蒸發(fā)濃縮后得到1種膏狀物，裝存于瓶中，置冰箱4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌種活化及菌懸液制備

本試驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)分別作為真菌、細菌的培養(yǎng)基，相關(guān)配制比例參照沈萍等[13]的方法。于冰箱4 ℃拿出供試菌種后，放入無菌操作臺中解凍。待菌種恢復(fù)到室溫狀態(tài)，劃線接種到相應(yīng)培養(yǎng)基。細菌于37 ℃培養(yǎng)1 d，真菌于28 ℃培養(yǎng)2 d。挑選單菌落并轉(zhuǎn)接種到新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接2～3代，以充分活化菌株[14]。試驗前將菌種充分活化后，取6支無菌試管，4支試管中倒入LB培養(yǎng)基、2支試管中倒入PDA培養(yǎng)基(不超過試管的1/5)，制成斜面培養(yǎng)基。將4種細菌、2種真菌菌種分別通過接種環(huán)接種于LB、PDA斜面培養(yǎng)基，按上述條件進行培養(yǎng)。待培養(yǎng)完成，于無菌環(huán)境用接種環(huán)刮取供試菌種至無菌的2 mL離心管內(nèi)，加入無菌蒸餾水，選擇血細胞計數(shù)板法，得到濃度為5×106～5×107個/mL的菌懸液[14]，放置備用。

1.4 抑菌活性試驗

待培養(yǎng)基稍涼(未凝固)后進行倒平板操作，每個平板約20 mL。放置一旁等待20～30 min。使用200 μL移液槍吸出0.2 mL菌懸液，移至相應(yīng)培養(yǎng)皿中，迅速進行涂布操作，得到指示含菌平板[3]。各個菌株設(shè)置5次重復(fù)試驗，選擇未接種菌懸液的平板作為空白對照。

加無菌蒸餾水將慈竹筍殼提取物配成120 g·L-1的溶液用于試驗，采用K-B抑菌圈法研究抗菌活性。將濾紙借助打孔器制成6 mm小圓片，滅菌干燥，浸泡在足量(淹沒所有濾紙片)樣品溶液中處理1 h后取出，分別輕放于含菌平板中[15]，每個平板內(nèi)呈三角形放置3片，選擇無菌水處理濾紙片用于空白對照。真菌濾紙片28 ℃培養(yǎng)2 d，細菌濾紙片37 ℃培養(yǎng)1 d后，觀察抑菌圈，并測量抑菌圈(含濾紙片)直徑，以抑菌圈直徑為指標評價慈竹筍殼提取物抑菌活性大小[3]。每項抑菌試驗設(shè)置平行重復(fù)5次。

1.5 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)測定

測定最小抑菌質(zhì)量濃度參考高雪娟等[3]的方法。采用二倍稀釋法，將慈竹筍殼提取物用無菌蒸餾水對倍稀釋為質(zhì)量濃度為140.000、70.000、35.000、17.500、8.750、4.375 g·L-1的溶液，其余步驟均同于抑菌活性試驗，每個質(zhì)量濃度處理均設(shè)3次平行重復(fù)。將最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)定為無抑菌圈出現(xiàn)時的質(zhì)量濃度。

1.6 溫度影響試驗

用無菌蒸餾水配制120 g·L-1慈竹筍殼提取液備用。取2 mL溶液放入不同的滅菌試管內(nèi)，經(jīng)-20、50、100 ℃不同溫度條件處理30 min。選取大腸桿菌(革蘭氏陰性代表菌)、金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性代表菌)作為指示菌，重復(fù)抑菌活性試驗，比較高溫或低溫是否會對慈竹筍殼提取物抑菌活性產(chǎn)生影響。每個處理重復(fù)3次。

1.7 浸泡時間影響試驗

用無菌蒸餾水配制120 g·L-1慈竹筍殼提取液備用。選擇金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為試驗菌，將滅菌的6 mm圓形濾紙片浸透于一定量的樣品溶液中分別處理0.5、3.0、5.0 h后，重復(fù)抑菌試驗，比較不同處理時間對慈竹筍殼提取物抑菌作用是否產(chǎn)生影響。每個處理重復(fù)3次。

1.8 慈竹筍殼提取物成分測定

在樣本中加入1 mL 2-氯苯丙氨酸及溫度為-20 ℃甲醇，渦旋振蕩1 min。渦旋振蕩后，離心5 min(轉(zhuǎn)速為12 000 rpm·min-1，溫度為25 ℃)，傾出上清液后稀釋10倍，過0.22 μm濾膜，進行液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)檢測。然后各取20 μL待測樣本混合成校正樣本，用來校正混合樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤。最后用剩余待測樣本進行LC-MS/MS檢測。

色譜條件：儀器采用Thermo Ultimate 3000，選用T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，將自動進樣器溫度調(diào)整為8 ℃，柱溫為40 ℃，以0.25 mL·min-1的速度進樣2 μL，其中選擇正離子：0.1%甲酸水(D)、0.1%甲酸乙腈(C)及負離子：5 mmol·L-1甲酸銨水(B)、乙腈(A)作為流動相進行梯度洗脫，具體程序為0～1 min，V(A)∶V(C)=2%；1～9 min，V(A)∶V(C)=2%～50%；9～12 min，V(A)∶V(C)=50%～98%；12～13.5 min，V(A)∶V(C)=98%；13.5～14 min，V(A)∶V(C)=98%～2%；14～20 min，正模式V(C)=2%(14～17 min，負模式V(A)=2%)。

質(zhì)譜條件：儀器為Thermo Q Exactive Focus，質(zhì)譜電離方式為電噴霧電離(ESI)，其中正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV。鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb，毛細管溫度為325 ℃，使用70 000的分辨率進行全掃描，范圍為81～1 000 m·z-1，高能誘導(dǎo)裂解(HCD)二級裂解，碰撞電壓為30 eV，選用動態(tài)排除將無關(guān)的質(zhì)譜/質(zhì)譜(MS/MS)信息去除。

1.9 數(shù)據(jù)處理

LC-MS所獲得的原始數(shù)據(jù)通過Proteowizard軟件(v3.0.8789)轉(zhuǎn)換成mzXML格式，再利用R語言(v3.1.3)的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊的操作，最終得到含有峰面積、質(zhì)核比、保留時間等信息的數(shù)據(jù)矩陣。試驗所有數(shù)據(jù)的整理、分析均使用Excel 2010及SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 慈竹筍殼提取物成分組成

慈竹筍殼提取物共檢測鑒定出388種代謝物，按其初級代謝途徑共分為8類(表1)。其中與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物種類最多，有126種，占總鑒定代謝物種類的32.47%，其質(zhì)量占比為代謝物總質(zhì)量的16.65%；鑒定到脂質(zhì)代謝有104種，其質(zhì)量占比在8大類代謝物中最高，占代謝物總質(zhì)量的40.69%。

表1 慈竹筍殼提取物參與代謝途徑

按照代謝物特性，將這些代謝物分為49類(見表2)，其中有8類至少包含10種代謝物，分別是脂肪?；?56種)、羧酸及其衍生物類(47種)、有機氧化合物類(26種)、苯及取代并苯衍生物類(23種)、酚類化合物類(16種)、有機氮化合物類(11種)、黃酮類化合物類(10種)、孕烯醇酮脂類(10種)。

表2 慈竹筍殼提取物分類

續(xù)(表2)

我們對鑒定到的慈竹筍殼提取代謝物進行了進一步的分析，其中有20種代謝物的質(zhì)量占總質(zhì)量的比例超過了1%(表3)，包括脂肪?；?種(9,10-環(huán)氧十八烯酸，13.73%)；5’-脫氧核糖核苷類1種(5-硫代甲基酰苷，1.65%)；苯及取代并苯衍生物類2種(間羥基苯甲酸，5.89%、原兒茶酸，1.35%)；酚類化合物類3種(高香草酸，1.88%、對苯二酚，1.47%、3-甲氧酪胺，1.08%)；嘌呤核苷類1種(肌苷，1.01%)；羧酸及其衍生物4種(4-羥基肉桂酸，7.20%、γ-氨基丁酸，3.11%、間香豆酸，1.89%、4-羥基肉桂酰亞胺，1.35%)；有機氮化合物2種(植物鞘氨醇，4.33%、乙酰膽堿，2.11%)；脂肪?；?種(13-L-過氧化氫亞油酸，7.06%、9-羰基-反,順-共軛亞油酸，1.01%)；異喹啉及其衍生物1種(N-甲基烏藥堿，5.94%)；3種未知類(赤蘚糖醇，7.18%、12-氧植物二烯酸，1.23%、9(S)-羥基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸，1.04%)。

表3 慈竹筍殼提取物代謝物成分列表

2.2 慈竹筍殼提取物的抑菌活性

以無水乙醇為提取溶劑，將索式抽提法抽提得到的慈竹筍殼提取物用于真菌、細菌的抑菌試驗。測量對照組及試驗組抑菌圈大小，用來判斷慈竹筍殼提取物是否具有抑菌活性。如表4所示，桔青霉菌、海綿膠煤炱菌抑菌圈的大小在對照組與試驗組中均無差異，表明慈竹筍殼提取物對這2種真菌不具備抑制效果。對于供試的大腸桿菌等4種細菌，對照組與試驗組抑菌圈的大小存在顯著差異，表明慈竹筍殼提取物能抑制這4種細菌生長。同時，本試驗通過對比這4種細菌的抑菌圈大小發(fā)現(xiàn)，慈竹筍殼提取物對革蘭氏陰性菌的抑制效果強于革蘭氏陽性菌，如慈竹筍殼提取物對大腸桿菌的抑制效果最好，但慈竹筍殼提取物對大腸桿菌的抑菌效果與對肺炎克雷伯菌相比，無顯著優(yōu)勢；但與糞腸球菌、金黃色葡萄球菌相比，有顯著差異(P>0.05)。分析可得，慈竹筍殼提取物對真菌無抑制作用，而對細菌具有抑制效果，尤其是革蘭氏陰性菌。

表4 慈竹筍殼提取物的抑菌圈直徑

2.3 最小抑菌質(zhì)量濃度測定

為了定量研究慈竹筍殼提取物對常見細菌的抑制活性，本試驗測定了慈竹筍殼提取物的抑菌質(zhì)量濃度，結(jié)果見表5。慈竹筍殼提取物可有效抑制大腸桿菌、肺炎克雷伯菌，且抑菌活性隨提取液質(zhì)量濃度的增加而提高，其最小抑菌質(zhì)量濃度均為4.375 g·L-1；慈竹筍殼提取物對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌的抑制效果相對較弱，其最小抑菌質(zhì)量濃度均為8.750 g·L-1。

表5 慈竹筍殼提取物對供試菌種的最小抑菌質(zhì)量濃度

2.4 溫度對抑菌活性的影響

高溫或低溫對慈竹筍殼提取物抑菌活性產(chǎn)生的影響見表6。慈竹筍殼提取物經(jīng)-20 ℃低溫處理后，對4種細菌的抑菌活性有顯著性差異(P<0.05)；50 ℃高溫處理后，對4種細菌的抑菌活性顯著上升(P<0.05)；100 ℃高溫處理后，對4種細菌的抑菌活性顯著下降。溫度能夠影響慈竹筍殼提取物的抑菌效果，低溫處理會導(dǎo)致其對4種細菌的抑菌活性下降，而隨著溫度升高，抑制活性則上升，持續(xù)升高溫度后，抑制活性再次降低，但仍有抑菌活性。

表6 溫度對慈竹筍殼提取物抑菌作用的影響

2.5 浸泡時間對抑菌活性的影響

浸泡時間對慈竹筍殼提取物抑菌活性產(chǎn)生的影響見表7。隨著浸泡時間的增加，慈竹筍殼提取物對大腸桿菌的抑菌效果顯著上升(P<0.05)，浸泡5 h后，其抑菌圈直徑達到(17.02±0.30)mm。浸泡時間對肺炎克雷伯菌抑菌效果影響較大，但當浸泡時間從3 h增加到5 h，抑菌效果無顯著變化(P>0.05)。浸泡時間對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌抑菌效果影響較小，浸泡時間從3 h增加到5 h，抑菌效果無顯著變化(P>0.05)。由此說明，增加浸泡時間可增強慈竹筍殼提取物的抑菌效果。

表7 浸泡時間對慈竹筍殼提取物抑菌作用的影響

3 結(jié)論與討論

筍殼作為一種竹產(chǎn)業(yè)廢棄物，其提取物被證明具有抑菌效果[3,11]。本研究探究了慈竹筍殼乙醇提取物對4種細菌，包括2種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌)、2種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、糞腸球菌)，以及2種真菌(桔青霉菌、海綿膠煤炱菌)的抑菌效果。結(jié)果表明，慈竹筍殼提取物對真菌無抑制作用，對細菌具有抑制效果，與高雪娟等[3]研究結(jié)果一致。

已有研究表明，毛竹筍殼提取物在經(jīng)過80、100、121 ℃處理后，仍有著很好的抑菌活性，且具有較好的熱穩(wěn)定性[3]。本研究中，慈竹筍殼提取物經(jīng)過-20 ℃、50 ℃、100 ℃處理后，抑菌活性發(fā)生顯著變化，但均具有較強活性，表明慈竹筍殼提取物同樣具有較好的熱穩(wěn)定性。由于本試驗設(shè)置的溫度跨度較大，僅得出低溫或高溫對慈竹筍殼提取液的抑菌效果不會產(chǎn)生顯著影響。試驗數(shù)據(jù)顯示，慈竹筍殼提取物抑菌活性在50～100 ℃間出現(xiàn)了降低趨勢，推測在50～100 ℃存在1個抑菌活性拐點。毛竹筍殼提取物對部分細菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為8.750、4.375、35.000 g·L-1[3]，而本研究中，慈竹筍殼提取物對細菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為8.75 g·L-1或4.375 g·L-1，表明慈竹筍殼提取物與毛竹筍殼提取物在抑菌功能方面相似。

本研究運用LC-MS/MS分析了慈竹筍殼提取物成分組成。結(jié)果表明，慈竹筍殼提取物中含有大量酚酸類化合物，如苯酚、對苯二酚等，其化學結(jié)構(gòu)中具有1個苯核，是對羥基苯甲酸、羥基苯丙烯酸的衍生物[15]。且有研究證明，酚酸類化合物可以抑制微生物生長、清除自由基等多種生物活性[14]。慈竹筍殼提取物中質(zhì)量占比最高的是9,10-環(huán)氧十八烯酸，有研究表明，9,10-環(huán)氧十八烯酸具有較好的抑菌活性[16]。慈竹筍殼提取物中含有豐富的黃酮類化合物，研究表明，黃酮類化合物對細菌中的革蘭氏陰性菌、陽性菌均具有較好的抑菌效果[17-18]。慈竹筍殼提取物中含有8種甾體及其衍生物，而植物甾體化合物，如硫脲類化合物是具有抗菌生物活性的天然產(chǎn)物[19]。慈竹筍殼提取物具有豐富的抑菌活性物質(zhì)，可進一步通過分離提純的方法深入研究這些活性物質(zhì)的功能、機制。

本研究通過探究慈竹筍殼提取物的抑菌種類、最小抑菌質(zhì)量濃度、溫度及浸泡時間對抑菌活性的影響，探究了其抑菌潛能，同時通過LC-MS/MS技術(shù)分析其活性成分，為慈竹筍殼的綜合利用及新型殺菌劑的開發(fā)提供了參考。