丁 婷，李 勇

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191）

益生菌是一類對(duì)人體有益的活性微生物，主要定居于腸道、生殖道內(nèi)。益生菌具有多種生理功能，不僅可以調(diào)節(jié)腸道功能，維持腸道菌群的平衡，還可以促進(jìn)鈣、磷等微量元素的吸收，而且在治療腹脹、腹瀉、哮喘、痛風(fēng)、糖尿病等疾病時(shí)發(fā)揮著重要作用[1-3]。然而，益生菌產(chǎn)品也具有一定的應(yīng)用局限性，如對(duì)外界環(huán)境及胃環(huán)境敏感，或營(yíng)養(yǎng)條件要求高而易失活，起不到對(duì)人體的有益作用。現(xiàn)有能提高益生菌活性的物質(zhì)有低聚果糖、低聚半乳糖、葡聚糖等，但這些快速發(fā)酵性寡糖能引起人體腹瀉和脹氣等缺點(diǎn)[4]。因此，尋找對(duì)人體安全且能促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)亟待解決。

核苷酸是生物體內(nèi)極重要的低分子化合物，是DNA和RNA的基本組成單位，作為細(xì)胞的主要成分，在細(xì)胞代謝、能量和功能調(diào)節(jié)等方面起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸具有多種生理功能，如免疫調(diào)節(jié)[5]、腸道菌群調(diào)節(jié)[6-7]、腸道修復(fù)[8]、抗感染[9]、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育[10-11]、延長(zhǎng)壽命[12]等。由于機(jī)體從頭合成核苷酸的能力有限，在一些特殊情況下內(nèi)源合成的核苷酸不能滿足機(jī)體需要，因此補(bǔ)充外源核苷酸則尤為重要。核苷酸也由“非必需營(yíng)養(yǎng)素”轉(zhuǎn)變?yōu)椤鞍氡匦锠I(yíng)養(yǎng)素”和“條件營(yíng)養(yǎng)素”。由于其安全性，目前已添加到嬰幼兒配方奶粉中使用。

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）是在食品中應(yīng)用廣泛的一種益生菌，具有降血壓、降膽固醇、緩解乳糖不耐癥、調(diào)節(jié)腸道菌群等益生作用，逐漸成為研究、開發(fā)的焦點(diǎn)，因此尋找促進(jìn)干酪乳桿菌生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì)具有重要意義。研究表明，外源核苷酸是腸道菌群的重要益生元[13-15]。鑒于此，本研究以干酪乳桿菌為研究對(duì)象，探究外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌的益生效應(yīng)及機(jī)制，以期為提高干酪乳桿菌的存活率提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌Q1為從遼寧錦州酸菜中分離純化鑒定的菌株，保藏于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。菌株按1%比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。

外源核苷酸5’-單磷酸胞苷（cytidine 5’-monophosphate，5’-CMP）、5’-單磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，5’-AMP） 大連珍奧生物技術(shù)股份有限公司；N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL） 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀 法國(guó)HORIBA Scientific公司；LRH型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TCS-SP8激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國(guó)徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌生長(zhǎng)的影響

以MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，分別加入1%、2%、3%、4%的5’-CMP和5’-AMP，接種1%的干酪乳桿菌，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，每隔4 h取一次樣，采用二倍稀釋法對(duì)干酪乳桿菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 干酪乳桿菌生長(zhǎng)變化規(guī)律

微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型可以描述不同生長(zhǎng)環(huán)境和條件下微生物的數(shù)量與時(shí)間的關(guān)系。修正的Gompertz[16]和修正的Logistic模型[17]通常用于擬合微生物的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。分別用修正的Gompetz模型、修正的Logistic模型非線描述干酪乳桿菌的生長(zhǎng)變化規(guī)律。

修正的Gompertz模型：

式中：t為時(shí)間/h；Nt為時(shí)間t時(shí)的菌數(shù)/（CFU/mL）；Nmax為N0為最大和初始菌數(shù)/（CFU/mL）；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h-1；λ為生長(zhǎng)延滯時(shí)間/h。

修正的Logistic模型：

式中：Nt為時(shí)間t時(shí)的菌落數(shù)/（CFU/mL）；N0為初始菌落數(shù)/（CFU/mL）；A為擬合參數(shù)；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h-1；λ為生長(zhǎng)延滯時(shí)間/h。

1.3.3 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌生物被膜、胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）的影響

干酪乳桿菌（1%）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。按1∶100比例稀釋后，將100 μL菌液和4.0%的5’-CMP和5’-AMP分別加入孔板中，MRS肉湯作為對(duì)照?？字蟹湃霟o(wú)菌蓋玻片和打磨過(guò)的鋅片（0.5 mm×0.5 mm，0.3 mm），37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，用無(wú)菌水緩慢沖洗蓋玻片3 次，0.4%結(jié)晶紫溶液染色20 min，在顯微鏡下觀察細(xì)菌生物被膜的變化。將鋅片用無(wú)菌水緩慢沖洗除去未黏附的細(xì)菌。用2.5%的戊二醛溶液固定30 min后干燥30 min。用0.01 g/100 mL的吖啶橙溶液避光染色15 min后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 次，干燥30 min。加入10 μL的封片劑，用CLSM進(jìn)行觀察（發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm）。鋅片用無(wú)菌水緩慢沖洗后干燥，用拉曼光譜檢測(cè)外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌EPS含量和化學(xué)成分的影響。

1.3.4 外源核苷酸添加對(duì)干酪乳桿菌粗提物群體感應(yīng)抑制活性及抗生物被膜活性的影響

干酪乳桿菌（1%）接種于MRS肉湯中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。按1∶100比例稀釋后取1 mL菌液加入100 mL的MRS肉湯中，加入4.0%的5’-CMP和5’-AMP，MRS肉湯作為對(duì)照，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，將菌液于12 000 r/min離心4 min，取上清液。用同體積的乙酸乙酯（含0.1%冰醋酸）萃取2 次后靜置1 h。將萃取后的乙酸乙酯進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（35 ℃）去除溶劑，加入1 mL甲醇溶解粗提物并用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，貯藏于-20 ℃冰箱備用。

測(cè)定干酪乳桿菌粗提物的群體感應(yīng)抑制活性前，需測(cè)定粗提物的最小抑菌濃度，以排除抑菌性的干擾。粗提物的最小抑菌濃度參照文獻(xiàn)[18]所述方法進(jìn)行測(cè)定。在亞抑菌濃度下，粗提物的群體感應(yīng)抑制活性通過(guò)報(bào)告菌株紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026進(jìn)行驗(yàn)證。紫色色桿菌CV026培養(yǎng)至OD600nm為1.0。按1∶100的比例將培養(yǎng)物加入冷卻至50 ℃左右的LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入10 μL C6-HSL，混合均勻后倒平板（平板直徑90 mm）并用牛津杯打孔。將100 μL粗提物加入平板的孔中，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h并觀察平板顏色變化。每組3 個(gè)平行。為探究干酪乳桿菌粗提物抗生物被膜活性，將志賀菌（Shigella）按1%比例接種于LB肉湯培養(yǎng)基中28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，按1∶100比例稀釋后取100 μL菌液加入96 孔板中，分別加入不同培養(yǎng)條件的干酪乳桿菌粗提物，不加粗提物的肉湯作空白對(duì)照。將96 孔板放置于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h。培養(yǎng)后，用無(wú)菌PBS沖洗3 遍。將VK3（丙酮溶解，10 mmol/L）加入2,3-二-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-甲酰苯胺（2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）（0.5 mg/mL，PBS溶解）中達(dá)到1 μmol/L濃度。將200 μL XTT-VK3溶液加入96 孔板中，37 ℃避光放置2 h，在490 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)樣品重復(fù)4 次取平均值。

1.3.5 干酪乳桿菌粗提物群體感應(yīng)抑制活性的影響因素

為測(cè)定酶對(duì)干酪乳桿菌粗提物群體感應(yīng)抑制活性的影響，向干酪乳桿菌粗提物中分別加入最適pH值下的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶，使其最終質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，將上述溶液于37 ℃水浴鍋中放置4 h后用紫色色桿菌CV026平板測(cè)定其群體感應(yīng)抑制活性，其中未加酶的粗提物作為對(duì)照。為測(cè)定溫度對(duì)干酪乳桿菌粗提物的群體感應(yīng)抑制活性的影響，將干酪乳桿菌粗提物置于80 ℃和100 ℃水浴鍋中30 min，未處理的粗提物作為對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌生長(zhǎng)增殖的影響

圖1顯示，干酪乳桿菌在添加外源核苷酸的MRS培養(yǎng)基中較空白對(duì)照生長(zhǎng)快，菌體迅速繁殖，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)較不添加核苷酸的空白組明顯提高，外源核苷酸濃度越高促進(jìn)效果越顯著。其中，5’-AMP對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更明顯，表明外源核苷酸可以加速細(xì)菌的增殖。用微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果顯示，修正的Gompertz方程和修正的Logistic方程可以較好地描述微生物的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)（R2＞0.919 78）。修正的Gompertz方程和修正的Logistic方程擬合后所得相關(guān)參數(shù)如表1所示。添加5’-CMP和5’-AMP后，細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率（μmax）較空白對(duì)照明顯增加，而延滯期（λ）則明顯縮短。上述結(jié)果表明外源核苷酸5’-CMP和5’-AMP對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。

圖1 干酪乳桿菌生長(zhǎng)曲線用修正的Gompertz方程以及修正的Logistic方程擬合結(jié)果Fig.1 Growth curves of L.casei fitted with modified Gompertz and modified Logistic equation

表1 干酪乳桿菌用修正的Gompertz和修正的Logistic方程非線性擬合相關(guān)參數(shù)Table 1 Nonlinear parameters of L.casei fitted with modified Gompertz and modified Logistic equation

2.2 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌生物被膜的影響

圖2a～c顯示，干酪乳桿菌添加外源核苷酸后，細(xì)菌生物被膜分泌增多，細(xì)菌由較為分散的狀態(tài)變得聚集，5’-AMP對(duì)細(xì)菌生物被膜的刺激作用更加明顯。圖2d～f顯示，對(duì)照生物被膜厚度為30 μm，添加5’-CMP后生物被膜增加到55 μm，添加5’-AMP后生物被膜則增加到70 μm，結(jié)果表明外源核苷酸5’-CMP和5’-AMP促進(jìn)了干酪乳桿菌生物被膜的分泌。

圖2 光學(xué)顯微鏡及CLSM觀測(cè)外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌生物被膜的影響Fig.2 Effect of exogenous nucleotides on the biofilm of L.casei Q1observed by optical microscopy and CLSM

2.3 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌EPS的含量及化學(xué)成分的影響

由圖3可以看出，添加5’-CMP和5’-AMP后，EPS的拉曼光譜峰強(qiáng)度增加。通過(guò)比對(duì)拉曼光譜特征峰[19]可以看出，干酪乳桿菌所產(chǎn)EPS的主要成分為蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸以及脂質(zhì)。添加5’-CMP和5’-AMP后，由EPS拉曼光譜圖可以看出，在544～553 cm-1處對(duì)應(yīng)的碳水化合物分泌量增加；720～730 cm-1處對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為腺嘌呤、色氨酸，添加5’-CMP和5’-AMP后細(xì)菌產(chǎn)生的這些物質(zhì)含量也有所增加。在1 001～1 005 cm-1處的拉曼光譜條帶主要是苯丙氨酸；在1 200～1 290、1 300 cm-1的拉曼光譜峰顯示EPS中含有酰胺物質(zhì)，添加5’-CMP和5’-AMP后此處的拉曼光譜峰強(qiáng)度增加，表明這兩種物質(zhì)對(duì)EPS中酰胺III的產(chǎn)生具有刺激作用。1 605～1 620 cm-1和2 920～1 855 cm-1的拉曼光譜特征峰顯示，細(xì)菌所產(chǎn)的EPS中含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酰胺I、不飽和脂質(zhì)以及孢粉素等物質(zhì)，這些物質(zhì)的變形振動(dòng)主要由C＝C、CH2、CH3基團(tuán)引起。添加5’-CMP和5’-AMP后拉曼光譜顯示對(duì)應(yīng)的物質(zhì)分泌量明顯增加。因此，外源核苷酸可以明顯增加干酪乳桿菌分泌EPS的量。

圖3 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌EPS含量及化學(xué)成分的影響Fig.3 Effect of exogenous nucleotides on the content and chemical composition of EPS produced by L.casei

2.4 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌粗提物群體感應(yīng)抑制活性的影響

紫色色桿菌CV026是一種群體感應(yīng)報(bào)告菌株，此菌自身不能產(chǎn)生信號(hào)分子，但是遇到外源的短鏈信號(hào)分子時(shí)，能產(chǎn)生紫色桿菌素使平板變紫色[20]。干酪乳桿菌粗提物的最小抑菌濃度為2 mg/mL。從圖4可以看出，添加C6-HSL的平板呈現(xiàn)紫色，當(dāng)孔中注入亞抑菌濃度下的干酪乳桿菌粗提物時(shí)，孔周圍出現(xiàn)不透明的黃色暈圈，表明干酪乳桿菌粗提物具有群體感應(yīng)抑制活性。干酪乳桿菌的培養(yǎng)基添加外源核苷酸（5’-CMP和5’-AMP）后，不透明的黃色暈圈增大，表明細(xì)菌分泌的具有群體感應(yīng)抑制活性的物質(zhì)增多，尤其是5’-AMP的促進(jìn)作用更明顯，上述結(jié)果表明外源核苷酸具有刺激干酪乳桿菌產(chǎn)生群體感應(yīng)抑制劑的作用。

圖4 5’-CMP和5’-AMP對(duì)干酪乳桿菌粗提物的群體感應(yīng)抑制活性影響Fig.4 Effect of exogenous 5’-CMP and 5’-AMP on quorum sensing inhibitory activity of crude extract of L.casei Q1

2.5 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌粗提物抗生物被膜能力的影響

從圖5可以看出，添加亞抑菌濃度下的干酪乳桿菌粗提物后，志賀菌分泌的生物被膜含量減少。外源核苷酸加入干酪乳桿菌培養(yǎng)基后，其粗提物對(duì)志賀菌生物被膜的抑制作用明顯增加，5’-AMP的添加對(duì)粗提物抗生物被膜活性促進(jìn)作用更顯著。以上結(jié)果表明外源核苷酸的添加增加了干酪乳桿菌抗生物被膜物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖5 外源核苷酸對(duì)干酪乳桿菌粗提物抗生物被膜活性的影響Fig.5 Effect of exogenous nucleotides on anti-biofilm activity of crude extract of L.casei Q1

2.6 蛋白酶和溫度對(duì)干酪乳桿菌粗提物群體感應(yīng)抑制活性的影響

從圖6可以看出，干酪乳桿菌粗提物經(jīng)4 種酶處理后，群體感應(yīng)抑制活性消失，表明粗提物對(duì)蛋白酶敏感，因此粗提物中的群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)推測(cè)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。用高溫處理干酪乳桿菌粗提物后，其群體感應(yīng)抑制活性不變，表明粗提物中的群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 蛋白酶（A）和溫度（B）對(duì)干酪乳桿菌粗提物群體感應(yīng)抑制活性的影響Fig.6 Effects of protease (A) and temperature (B) on the quorum sensing inhibitory activity of crude extract of L.casei Q1

3 討 論

干酪乳桿菌具有的多種對(duì)人體有益的功效已被證實(shí)[21-23]。但是由于易失活的特點(diǎn)也限制了其應(yīng)用。因此，外源核苷酸這種安全性好且能促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)的物質(zhì)受到越來(lái)越多關(guān)注。本研究將外源核苷酸（5’-CMP和5’-AMP）添加到干酪乳桿菌的培養(yǎng)基后，細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率提高，延滯期縮短，表明這兩種外源核苷酸對(duì)細(xì)菌的增殖及生長(zhǎng)代謝具有促進(jìn)作用。

細(xì)菌產(chǎn)生的生物被膜是細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境，黏附于固體或有機(jī)腔道表面，形成微菌落，并分泌EPS將自身包裹其中而形成的膜狀物[24]。生物被膜和EPS均受到細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控[25-26]。群體感應(yīng)是一種細(xì)菌之間通過(guò)分泌信號(hào)分子而進(jìn)行通訊的機(jī)制。信號(hào)分子具有多種類型，大多數(shù)革蘭氏陰性菌由高絲氨酸內(nèi)酯類作為信號(hào)分子；革蘭氏陽(yáng)性菌由寡肽作為信號(hào)分子。此外，細(xì)菌種間（內(nèi)）信息交流則由呋喃硼酸二酯類介導(dǎo)[27-30]。添加外源核苷酸后，干酪乳桿菌分泌的生物被膜和EPS含量都明顯增加，表明外源核苷酸很可能促進(jìn)了干酪乳桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致生物被膜和EPS含量增加，使得細(xì)菌對(duì)外界不利環(huán)境的抵抗能力增加。對(duì)干酪乳桿菌粗提物的群體感應(yīng)抑制活性測(cè)定也表明，外源核苷酸的添加刺激了干酪乳桿菌分泌具有群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)的產(chǎn)生。干酪乳桿菌的粗提物對(duì)蛋白酶敏感，因此粗提物中的群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)推測(cè)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。用高溫處理干酪乳桿菌粗提物后，其群體感應(yīng)抑制活性不變，表明粗提物中的群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性，初步推斷此物質(zhì)為細(xì)菌素類物質(zhì)。Chahad等[31]發(fā)現(xiàn)，從海水魚中分離的乳酸菌對(duì)多種致病菌具有拮抗性，其粗提物熱處理后仍具有抑菌性，經(jīng)鑒定此物質(zhì)為II型乳酸菌素。Campos等[32]也發(fā)現(xiàn)分離于大菱鲆的乳酸菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素抑制多種病原微生物。

志賀菌屬即通稱的痢疾桿菌，細(xì)菌性痢疾是最常見的腸道傳染病，夏秋兩季患者最多[33-34]。傳染源主要為病人和帶菌者通過(guò)污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經(jīng)口感染。志賀菌侵入腸黏膜組織并釋放內(nèi)毒素引起癥狀，癥狀為劇烈腹痛、腹瀉、發(fā)熱，嚴(yán)重者出現(xiàn)痙攣和休克[35]。由于抗生素的濫用，造成志賀菌產(chǎn)生了耐藥性，因此，尋找新的抗菌靶點(diǎn)或開發(fā)新型抗菌藥物顯得十分重要和迫切。而以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源核苷酸可以刺激干酪乳桿菌分泌對(duì)抗志賀菌等食源致病菌的物質(zhì)，這一發(fā)現(xiàn)也表明外源核苷酸可作為優(yōu)質(zhì)益生元使用，對(duì)提高益生菌活力、減少腸道致病菌感染、調(diào)節(jié)腸道菌群具有巨大的潛力。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)外源核苷酸（5’-CMP和5’-AMP）對(duì)干酪乳桿菌的生長(zhǎng)、生物被膜、EPS產(chǎn)生、粗提物的群體感應(yīng)抑制活性、抗生物被膜活性均有明顯的促進(jìn)作用。2 種外源核苷酸很可能促進(jìn)了干酪乳桿菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)環(huán)境的抵抗力所致，因此5’-CMP和5’-AMP可作為優(yōu)質(zhì)益生元使用，對(duì)增強(qiáng)市售益生菌產(chǎn)品的存活率、調(diào)節(jié)腸道菌群、維護(hù)腸道健康具有重要意義。