李 露 何 芬 楊鳳武 古 靜 徐亞麗

近年來，干細胞療法作為新型治療手段逐漸應用于多種疾病。其中，骨髓來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于其取材較為容易、免疫原性較弱且具有分化為多種細胞的能力，成為研究的熱點之一［1］，其治療效果與移植入體內(nèi)后到達靶組織的效率密切相關?；|細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是最重要的趨化與歸巢相關分子之一［2］，與其受體CXC趨化因子受體4一起作用，有助于MSCs向靶組織遷移歸巢［3］，而提高靶區(qū)SDF-1濃度可促進更多的MSCs歸巢。前期研究［4］表明，超聲輻照微泡可提高MSCs的移植效率及歸巢能力，其機制可能為微泡增強的超聲生物學效應可促使MSCs旁分泌SDF-1，使靶區(qū)組織SDF-1含量增高［5］。但關于超聲輻照微泡促MSCs分泌SDF-1的參數(shù)優(yōu)化方面的研究較少。本研究采用擬水平均勻實驗設計法，選取超聲輻照強度、超聲輻照時間及微泡濃度3個實驗參數(shù)，各設5個水平以篩選影響MSCs分泌SDF-1的最優(yōu)因素組合。

材料與方法

一、主要材料與儀器

人骨髓MSCs細胞株（美國Sciencell公司）；干細胞完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技公司）；0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；人SDF-1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）；CCK-8溶液（北京碧云天生物技術公司）；造影劑“脂氟顯”（陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院超聲科實驗室自制）為脂質膜包裹全氟丙烷氣體的微泡，粒徑2～10μm，其中98%小于8μm，微泡平均濃度約為（7～8）×109個/ml，使用前用生理鹽水稀釋至相應濃度；酶聯(lián)免疫分析儀（F039300，澳大利亞Tecan公司）；超聲治療儀（Accusonic Plus，澳大利亞Metro Medical公司），除輻照強度和輻照時間隨實驗調(diào)整外，超聲發(fā)射頻率固定為1 MHz，占空比設為10%。

二、主要實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：將人骨髓MSCs細胞株用含10%胎牛血清的干細胞完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每4～6天傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液后以每孔1×106的密度接種于六孔板中，每孔細胞懸液量約2 ml，放于孵箱靜置6～8 h，待細胞完全貼壁后即可用于不同影響因素條件下的超聲輻照。

2.實驗設計與分組：采用雙均數(shù)擬水平均勻實驗設計，選定超聲輻照強度、超聲輻照時間、微泡濃度3個常見影響因素，每因素設5個水平，分別為：①超聲輻照強度，即0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2；②超聲輻照時間，即0（對照）、20、30、40、60 s；③微泡濃度，即0（對照）、102、104、106、108個/ml。根據(jù)均勻設計表U15（155）安排的實驗分組進行超聲輻照，應用多元線性回歸及逐步回歸統(tǒng)計學方法分析，并綜合考慮各因素間的關系，以相對高的SDF-1分泌量（上清液中SDF-1濃度）和相對低的細胞死亡率（MSCs存活率）為目標，確定最優(yōu)影響因素組合。然后分別按照超聲輻照時間、超聲輻照強度、微泡濃度3個因素進行驗證，具體：①考察超聲輻照強度，分為0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2，此時超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml；②考察超聲輻照時間，分為0（對照）、20、30、40、60 s，此時超聲輻照強度0.6 W/cm2，微泡濃度106個/ml；③考察微泡濃度，分為0（對照）、102、104、106、108個/ml，此時超聲輻照時間30 s，超聲輻照強度0.6 W/cm2。

3.ELISA法檢測SDF-1含量：將人骨髓MSCs經(jīng)超聲輻照并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別吸取每孔上清液作為樣品。將不同濃度的SDF-1標準品和稀釋后的各個樣品加入酶標板內(nèi)，按照人SDF-1 ELISA試劑盒說明書步驟依次操作，最后使用酶聯(lián)免疫分析儀測定樣品于450 nm光譜處的吸光度值，根據(jù)樣品的吸光度值和稀釋倍數(shù)檢測樣品濃度。

4.CCK-8法評估細胞活性：將人骨髓MSCs經(jīng)超聲輻照并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組人骨髓MSCs制成單細胞懸液，以每孔2×103的密度接種于96孔板中，每孔100μl，將未被超聲輻照的人骨髓MSCs設為對照。將96孔板于孵箱靜置6～12 h待細胞全部貼壁后，每孔加入10μl CCK-8溶液。孵箱繼續(xù)放置2 h后，設僅含有100μl單純細胞培養(yǎng)基的孔為空白對照孔，采用酶聯(lián)免疫分析儀測量每個樣品孔于450 nm光譜處的吸光度值，細胞存活率（%）=樣品孔吸光度值/空白對照孔的吸光度值×100%。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，參數(shù)篩選采用雙指標擬水平均勻設計，應用多元線性回歸分析及逐步回歸分析篩選最優(yōu)影響因素組合。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、優(yōu)化SDF-1分泌的最優(yōu)影響因素組合

通過雙指標擬水平均勻實驗設計優(yōu)化超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的因素，按U15（155）均勻實驗設計表設計，見表1。

表1 超聲輻照參數(shù)篩選實驗擬水平均勻設計表及實驗結果

應用多元線性回歸分析，得到雙指標的回歸方程為：

兩個回歸方程對應的概率值P=0.003、0.014，均小于0.05，總回歸效果顯著。偏回歸效果檢驗顯示，因素B（微泡濃度）對SDF-1分泌量的偏回歸貢獻不顯著（P＜0.05），說明其對SDF-1分泌量的作用可由其他因素代替，故需進一步行逐步回歸分析，得逐步回歸方程為：

方程對應的概率值P＜0.05，總回歸效果顯著。采用方程（2）、（3）對實驗影響因素進行優(yōu)化，并綜合考慮各因素間關系后，最終確定最優(yōu)影響因素組合為超聲輻照強度0.6 W/cm2，超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml。

二、不同參數(shù)條件下SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細胞存活率結果

1.超聲輻照后即刻，光鏡下可見貼壁的人骨髓MSCs胞質回縮，細胞折光率增強，超聲輻照強度加大時部分細胞甚至漂浮起來。放于孵箱靜置培養(yǎng)24 h后，絕大部分人骨髓MSCs會重新貼壁生長，形態(tài)與正常細胞相比無明顯差別。見圖1。隨著超聲輻照強度增加，存活下來貼壁生長的人骨髓MSCs越來越少。

圖1 人骨髓MSCs在微泡濃度106個/ml、超聲輻照時間30 s即刻及輻照后24 h不同超聲輻照強度下的光鏡圖（×100）

2.對優(yōu)化篩選后的影響因素進行驗證，超聲輻照強度、微泡濃度和超聲輻照時間3個因素對SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細胞存活率的影響見圖2。圖2A顯示，隨著超聲輻照強度的增強，SDF-1濃度逐漸增大，輻照強度為0.6 W/cm2時，SDF-1濃度達到峰值（551.67±40.88）ρg/ml，當輻照強度繼續(xù)增大至0.8 W/cm2，SDF-1濃度反而下降；同時，細胞存活率隨著超聲輻照強度的增加顯著降低，輻照強度為0.6 W/cm2時，細胞存活率為（88.51±4.03）%，輻照強度繼續(xù)增加至0.8 W/cm2時，細胞存活率下降至（71.02±7.97）%。圖2B顯示，SDF-1濃度隨超聲輻照時間增加而增加，超聲輻照強度為0.6 W/cm2時SDF-1濃度達到峰值，超聲輻照時間＞30 s時，SDF-1濃度即開始下降，輻照時間為60 s時，SDF-1濃度降至（492.47±19.64）ρg/ml；另外，超聲輻照時間越長，細胞存活率越低，輻照時間為60 s時降至（65.67±6.04）%。圖2C顯示，隨著微泡濃度的增大，SDF-1濃度也逐漸增大，于微泡濃度為106個/ml時達到峰值，當微泡濃度增大至108個/ml，SDF-1濃度下降至（468.16±49.91）ρg/ml，同時細胞存活率也顯著下降至（62.26±7.27）%。結果顯示，當超聲輻照強度為0.6 W/cm2、超聲輻照時間為30 s、微泡濃度為106個/ml時，SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細胞存活率可達到相對匹配的數(shù)值。

圖2 不同影響因素條件下超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1和細胞存活情況

討論

在醫(yī)院臨床和基礎研究中經(jīng)常接觸到包含多因素、多水平雙指標的實驗，如交叉匹配各個因素和水平進行全面實驗，不僅要花費大量的人力、物力，還需相當長的時間，顯然是不實際的。正交設計法和均勻設計法均能在不影響實驗效果的前提下，盡可能減少實驗次數(shù)，前者的實驗次數(shù)是后者實驗次數(shù)的整數(shù)倍，故均勻設計法是一種更加高效、快速、經(jīng)濟的實驗設計方法。本研究采用擬水平均勻設計超聲輻照微泡后人骨髓MSCs SDF-1分泌量和MSCs細胞存活率的雙指標實驗，旨在探討超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的最優(yōu)條件。

方程（2）中，因素A（超聲輻照強度）、B（微泡濃度）、C（超聲輻照時間）系數(shù)均為負值，具有阻礙細胞存活的作用，說明取低值有利于細胞存活，適宜范圍內(nèi)應取下限值；方程（3）中，因素A、C系數(shù)均為正值，具有促進SDF-1分泌的作用，說明高值有利于SDF-1分泌，適宜范圍內(nèi)應取上限值，因素B不包含于方程（3）中，說明不同的因素B取值對SDF-1分泌無明顯的影響作用，可作為常量。綜合分析，因素A對促SDF-1分泌與細胞存活率有相反作用的影響，且對促SDF-1分泌的影響更大，故取較中間值大一點的數(shù)值，即0.6 W/cm2；因素C對促SDF-1分泌與細胞存活率也有相反作用的影響且影響力類似，故取中間值30 s；因素B對促SDF-1分泌無影響，對細胞存活率有影響，宜取低值，但由于方程（2）中因素B的系數(shù)為-1.791E-7，B的取值范圍為0～106個/ml，實際上對細胞存活的影響均微小，僅當因素B的取值達到108個/ml時，對細胞存活率才有顯著的阻礙作用，考慮到實際操作的準確性（微泡濃度越低操作誤差越大），因素B取106個/ml。所以，根據(jù)方程（2）、（3），綜合考慮促SDF-1分泌量和高的細胞存活率的最優(yōu)影響因素組合為：超聲輻照強度0.6 W/cm2，微泡濃度106個/ml，超聲輻照時間30 s。

研究［6-7］表明，超聲輻照微泡雖可促使人骨髓MSCs分泌SDF-1，但隨著超聲輻照強度、輻照時間的增加，其輻照能量也不斷增強，超過一定閾值后，細胞就會溶解和死亡。超聲微泡造影劑注入體內(nèi)后，作為空化核可以大大降低超聲生物學效應（主要是空化效應）的閾值，使空化效應強度顯著增加。在離體實驗［8］中，當細胞周圍存在大量空化核（如微泡造影劑）時，微泡增強的超聲空化效應也可對被輻照細胞造成不可逆的損傷。所以，需要找到超聲輻照時間、輻照強度和微泡數(shù)量/濃度的最優(yōu)組合，希望在保證較多的MSCs存活的前提下，超聲輻照微泡能有效促進其分泌更多的SDF-1。本研究結果提示，超聲輻照強度、超聲輻照時間或微泡濃度超過一定閾值后，大量的人骨髓MSCs會因輻照能量過高或空化核濃度過大而死亡，導致相應的SDF-1分泌量也減少。本研究采用均勻設計法和回歸分析的統(tǒng)計學方法篩選出體外超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的最優(yōu)影響因素組合，即超聲輻照強度0.6 W/cm2，超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml。使用該最優(yōu)組合時人骨髓MSCs的存活率為（88.51±4.03）%，同時SDF-1分泌量顯著增加，達（551.67±40.88）ρg/ml。當然，超聲輻照微泡作用于動物或人體時，涉及的相關超聲作用因素更多，優(yōu)化篩選過程也會更加復雜，需后續(xù)實驗研究的進一步探討。

綜上所述，采用擬水平均勻設計法篩選出超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1和細胞存活率達到相對匹配的最優(yōu)影響因素組合為：超聲輻照強度0.6 W/cm2，超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml。