武 勇，孟憲梅，江振宇，王 晶，張靜潔，周 怡，年嬡嬡

(包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

目前在世界范圍內(nèi)，宮頸癌的發(fā)生嚴(yán)重威脅著女性的健康。據(jù)了解全球每年新患宮頸癌的人數(shù)超過(guò)50萬(wàn)人，已成為繼乳腺癌之后危害廣大婦女健康的第二大殺手。經(jīng)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析及分子生物學(xué)證實(shí)，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPVs)感染尤其是高危型HPVs與宮頸癌的發(fā)生存在著密切的病因?qū)W關(guān)系。而高危型人HPVs 尤其是高危型HPVs 16 E6/E7 兩個(gè)癌基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)HPVs E6/E7在被HPVs感染的組織中持續(xù)保留并表達(dá)，并在使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化方面起著至關(guān)重要的作用，因此成為宮頸癌核酸治療的理想靶點(diǎn)。反義技術(shù)包括反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODNs)及核酶 (ribozymes， RZs)技術(shù)。應(yīng)用反義核酸技術(shù)抑制HPV16 和HPV18 E6/E7 轉(zhuǎn)錄，阻止目的基因表達(dá)從而消除HPVs致癌作用。而目前，具有基因敲除效應(yīng)的RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)，為宮頸癌治療的治療帶來(lái)了廣闊的前景。

1 人乳頭瘤病毒與宮頸癌

HPVs感染是最常見(jiàn)的肛門(mén)生殖器惡性腫瘤的病因。目前已克隆鑒定的HPVs亞型已超過(guò)100多種，根據(jù)致病力的大小，可將HPVs分為高危型HPVs(High risk-HPVs，HR-HPVs)和低危型HPVs(low risk-HPVs，LR-HPVs)。通過(guò)大量的流行病學(xué)和分子生物學(xué)統(tǒng)計(jì)研究表明，HR-HPVs特別是HPV16 及HPV 18與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的病因?qū)W關(guān)系。

HPVs為無(wú)包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬乳多空病毒科A亞群內(nèi)的一組病毒，有高度種屬特異性和特異的嗜上皮性。HPVs基因組不同區(qū)域基因與HPVs的功能存在著密切的關(guān)系，包括編碼區(qū)與非編碼區(qū)。編碼區(qū)基因可分為3個(gè)功能區(qū)：早期區(qū)(early region)、晚期區(qū)(late region)和長(zhǎng)控制區(qū)(long control region，LCR)。早期區(qū)編碼的E1、E2、E4和E5與病毒基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等有關(guān)，而早期區(qū)的E6和E7是感染細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡性表型維持的先決條件；晚期區(qū)基因編碼主要衣殼蛋白及次要衣殼蛋白，執(zhí)行著組裝成病毒樣顆粒的作用；長(zhǎng)控制區(qū)又稱(chēng)上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR區(qū))，含有很多與病毒DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及表達(dá)所必需的調(diào)控元件。由此可見(jiàn)病毒基因的表達(dá)受病毒及宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其中包括 E2 ，LCR 及細(xì)胞內(nèi)反式調(diào)節(jié)因子，它們的改變可使轉(zhuǎn)化蛋白過(guò)表達(dá)而致瘤[1-2]。

2 核酸治療的分子靶點(diǎn)

宮頸癌發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，E6/E7在被HPVs感染的組織中持續(xù)保留并表達(dá)，尤其在使被感染的組織發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化方面中起著重要的作用[3-4]。

HPV16 E6降解 p53是使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。抑癌蛋白p53，主要功能是參與細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制及損傷后的修復(fù)，從而能夠穩(wěn)定基因組和抑制突變細(xì)胞的產(chǎn)生，避免腫瘤的發(fā)生[4]。HPV16 E6蛋白可通過(guò) E6-AP 的介導(dǎo)，促使 p53 蛋白進(jìn)入泛素依賴(lài)降解途徑，p53 蛋白降解，使G1/S期G2/M期的調(diào)控點(diǎn)失控，此時(shí)被感染的細(xì)胞可以克服因遺傳物質(zhì)損傷引發(fā)的細(xì)胞周期停止，從而導(dǎo)致DNA完整性受損的細(xì)胞得以過(guò)度增殖，從而致使基因突變幾率增加和細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，另外還可使外源DNA整合到宿主染色體中的幾率升高，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。

端粒是真核細(xì)胞生物染色體末端DNA的一段富含C的重復(fù)序列與結(jié)合蛋白組成的復(fù)合體，端粒的功能是為染色體加“帽”及加“尾”，以防止染色體發(fā)生降解、融合、重組借以維持染色體的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生長(zhǎng)。端粒酶是自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復(fù)序列互補(bǔ)。而其蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3′端，以維持端粒長(zhǎng)度及功能。許多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性是增高的，除造血干細(xì)胞外，正常細(xì)胞的端粒酶幾乎沒(méi)有活性。端粒酶可以在多個(gè)水平進(jìn)行活性調(diào)控，其中包括hTR及hTERT基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA剪接和成熟、轉(zhuǎn)錄后修飾，各組分的移位和定位等[5]。E6則是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)激活端粒酶的癌基因[6]，可直接通過(guò)刺激啟動(dòng)子，誘導(dǎo)和維持高水平的hTERT，阻斷對(duì)p53抑制可導(dǎo)致端粒酶活性增高。從而使細(xì)胞賦有無(wú)限增殖的能力。

值得注意的是，E6還可通過(guò)其C-端PDZ基序(因最初發(fā)現(xiàn)于PSD95、DlgA和ZO-1這三個(gè)蛋白質(zhì)而得名)與調(diào)控細(xì)胞連接形成和細(xì)胞粘附等相關(guān)的PDZ蛋白[5]相互作用，使細(xì)胞間粘附性降低從而失去接觸性抑制，從而使癌細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。Chen[6]等的研究結(jié)果顯示：將HPV16的E6和E7基因轉(zhuǎn)染入小鼠無(wú)侵襲轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞后，可賦予細(xì)胞明顯的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

HPV16 E7在啟動(dòng)階段(細(xì)胞失控性增殖和凋亡抑制發(fā)揮重要作用階段)的作用強(qiáng)于E6，E7促使pRb蛋白進(jìn)入泛素依賴(lài)途徑，結(jié)合并降解pRb致使隨后發(fā)生的一系列遺傳事件發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞的失控性增殖。

因此，HR-HPVs，特別是HPV16的兩個(gè)病毒癌基因E6和E7持續(xù)表達(dá)不僅是引起感染細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、惡性表型維持及侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，而且為治療性核酸(如反義核苷酸、核酶和siRNA等)治療宮頸癌等HPVs相關(guān)腫瘤提供了理想靶點(diǎn)[7]。

3 反義寡聚脫氧核苷酸在治療宮頸癌中的應(yīng)用

3.1反義寡聚脫氧核苷酸(Antisense Oligodexynucleotides，AS-ODNs)基因技術(shù)特點(diǎn) AS-ODNs基因技術(shù)是通過(guò)特定靶基因mRNA相互補(bǔ)的DNA序列片斷，按照堿基互補(bǔ)原則，人工合成AS-ODNs與靶基因進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，從而阻斷靶基因的表達(dá)和翻譯，阻斷病程進(jìn)展達(dá)到治療的目的。

AS-ODNs的最佳長(zhǎng)度為16～20個(gè)堿基，既能與靶基因結(jié)合又能避免無(wú)意義的雜交。AS-ODNs是通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞自吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)的蛋白受體有79KD，80KD，90KD的蛋白受體具有CD4家族基因特異性使AS-ODNs易于進(jìn)入細(xì)胞。AS-ODNs應(yīng)用在腫瘤中的作用機(jī)制是：(1)AS-ODNs可以有選擇性和mRNA起始密碼子AUG結(jié)合，與氨酰tRNA直接競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止核糖體閱讀；(2)mRNA-DNA雜交鏈的形成，激活內(nèi)源性核糖核酸酶RnaseH，使mRNA降解；(3)mRNA-DNA雜交直接抑制蛋白質(zhì)的翻譯；(4)AS-ODNs與mRNA前體hnRNA結(jié)合，抑制正常成熟hnRNA拼接；(5)AS-ODNs與雙鏈DNA形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，可競(jìng)爭(zhēng)抑制激活轉(zhuǎn)錄蛋白與基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而干擾基因轉(zhuǎn)錄。

由于堿基互補(bǔ)原則使AS-ODNs具有高度靶特異性，從而設(shè)計(jì)容易、多樣且合成簡(jiǎn)單，高度針對(duì)性的優(yōu)點(diǎn)。

3.2AS-ODNs作用靶點(diǎn) E6和E7中作為分子靶點(diǎn)不但為宮頸癌的治療帶來(lái)了新的手段，同樣也為HPVs感染所致的其它腫瘤帶來(lái)新的思路。有研究報(bào)道，應(yīng)用設(shè)計(jì)覆蓋HPV E6 E7全長(zhǎng)的AS-RNA，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C4-1細(xì)胞，從成功而抑制抑制E6 E7表達(dá)。質(zhì)粒介導(dǎo)的AS-RNA能夠上調(diào)p53和釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中致使蛋白酶9和3的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。而以腺病毒作為載體將AS-RNA轉(zhuǎn)入CaSki細(xì)胞中，使HPV16 E7蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞周期停滯及RB蛋白表達(dá)增高，下調(diào)E2F和Bcl2，從而抑制CaSki細(xì)胞的增殖[9]。

因AS-ODNs其作用靶點(diǎn)序列定位準(zhǔn)確、容易設(shè)計(jì)和合成，所以被認(rèn)為是最具有潛力治療腫瘤的藥物，但是在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其用量大、抑制效率低及毒性大等特點(diǎn)，再加上成本過(guò)高又為臨床應(yīng)用帶來(lái)了難題。隨著現(xiàn)在生物技術(shù)的不斷發(fā)展，RNA干擾(RNA interference)除了具有AS-ODNs相同的優(yōu)點(diǎn)之外還具有專(zhuān)一性高、用量少、毒性小等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)為臨床應(yīng)用帶了新的廣闊前景。

4 RNA干擾技術(shù)在治療宮頸癌中的應(yīng)用

4.1RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)特點(diǎn) RNAi是已證實(shí)存在于線蟲(chóng)、植物、果蠅及哺乳動(dòng)物中的具有基因敲除效應(yīng)的dsRNA(double-stranded RNA)[10]。通過(guò)將與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，引起該mRNA特異性的降解，從而導(dǎo)致mRNA編碼的基因不能表達(dá)，發(fā)生基因沉默。

RNAi現(xiàn)象最早要追溯到90年代，在1998年確定并命名。在1990年Napoli[11]等在設(shè)計(jì)將苯基乙烯酮合成酶基因轉(zhuǎn)入矮牽牛屬植物來(lái)提高色素產(chǎn)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的花呈白色或雜色而不是原有的紫色這種效應(yīng)是其內(nèi)源性同源基因沉默或受抑制的結(jié)果，稱(chēng)之為共抑制(cosuppression)。在1995年，康奈爾大學(xué)的SuGuo教授[12]利用反義RNA技術(shù)研究秀麗新小桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)里的par-1基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，par-1基因可與目的基因mRNA互補(bǔ)的反義RNA導(dǎo)入線蟲(chóng)細(xì)胞，使目的基因沉默(gene silencing)。之后將與mRNA序列相同的正義RNA導(dǎo)入細(xì)胞，出現(xiàn)相同的結(jié)果。在1998年Fire和Mello教授[13]首次應(yīng)用秀麗新小桿線蟲(chóng)證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，因此發(fā)現(xiàn)正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，與過(guò)去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷都是由于體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA中污染了微量dsRNA而引起的。Fire教授將雙鏈RNA(double-strand RNA, dsRNA)注入到秀麗新小桿線蟲(chóng)時(shí)卻能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，該小組將這一現(xiàn)象稱(chēng)為RNAi。

4.2RNAi 作用機(jī)制 RNAi是一個(gè)由dsRNA誘導(dǎo)的呈多步驟、多因素參與的復(fù)雜的過(guò)程。dsRNA由核酸內(nèi)切酶Ⅲ(RNase Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA，siRNA與內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶結(jié)合最終形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC特異性地與目的mRNA同源區(qū)結(jié)合，通過(guò)酶的作用使mRNA降解，致使目的基因沉默。siRNA具有小分子質(zhì)量、低濃度、低沉默信號(hào)即可在細(xì)胞間傳遞甚至傳播至整個(gè)機(jī)體并可遺傳等特點(diǎn)。需要注意的是，與AS-ODNs相同，siRNA具有較高的序列特異性。

4.3RNAi的應(yīng)用 早先，用siRNA技術(shù)抑制HPV16 E6 E7的表達(dá)，以HPV 16 E6 E7 mRNA作為分子靶點(diǎn)特異性的沉默，發(fā)現(xiàn)E6沉默后p53蛋白表達(dá)增高，并且細(xì)胞周期調(diào)控基因p21活性增高從而使細(xì)胞增殖受到抑制，而E7沉默則直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在siRNA轉(zhuǎn)染的HPV陰性的對(duì)照組細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)p53及p21無(wú)變化。由此表明，具有高效性及高度的特異性siRNA的沉默效應(yīng)用于宮頸癌基因治療是非常有價(jià)值的[14]。

此外通過(guò)siRNA的特異性沉默效應(yīng)不但可以使靶基因失表達(dá)，同時(shí)還可以使失活的抑癌基因重新發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促使細(xì)胞向正常方向進(jìn)展[15]。未經(jīng)修飾的siRNA則非常不穩(wěn)定，在血清和細(xì)胞中很快被核酸酶降解，導(dǎo)致對(duì)靶基因的表達(dá)抑制只能持續(xù)數(shù)天或更短的時(shí)間[16]。當(dāng)具有兩個(gè)短反向重復(fù)序列及莖環(huán)(loop)組成的短發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA，shRNA)，經(jīng)介質(zhì)入轉(zhuǎn)到細(xì)胞后，通過(guò)RNA聚合酶Ⅲ的作用，可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。因此通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源性shRNA可以有高度特異性的持續(xù)表達(dá)從而沉默目標(biāo)mRNA,達(dá)到基因沉默的目的。

4.4靶向RNA 設(shè)計(jì) 與AS-ODNs相同，當(dāng)目的基因選定后，RNAi可根據(jù)堿基順序排列設(shè)計(jì)與靶向mRNA互補(bǔ)的序列，應(yīng)用所設(shè)計(jì)的序列進(jìn)入細(xì)胞后按Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶向序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)后續(xù)機(jī)制影響靶基因的表達(dá)。因此，所設(shè)計(jì)的序列必須是可以與目的mRNA相互補(bǔ)的序列。通常是通過(guò)“semi-rational design”原則[17-18]，對(duì)目的序列先進(jìn)行測(cè)序鑒定,選取含有AUG起始密碼的區(qū)域開(kāi)始，逐個(gè)尋找“AA”二連序列，標(biāo)記其3’端堿基序列作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。因非編碼區(qū)(untranslated regions,UTRs)含有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，因此需要避開(kāi)5’和3’端的UTRs[19]，通過(guò)將所選序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列同源的序列后選出合適的靶序列進(jìn)行合成。

基于以上原則利用計(jì)算機(jī)分析可以減少對(duì)合適序列挑選的計(jì)算。然而由于體內(nèi)微環(huán)境及蛋白、離子的作用，而使得所選定的序列不一定能正常地在體內(nèi)發(fā)揮作用，因此對(duì)于靶序列的選擇及序列的合成是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程。

4.5現(xiàn)狀與展望 隨著基因治療手段的不斷成熟，越來(lái)越多的基因靶點(diǎn)隨被發(fā)現(xiàn)， 加上藥物作用靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)，基因功能的研究以極快的速度向前發(fā)展，各種研究基因功能的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，所以RNAi逐步成為一種強(qiáng)有力的工具，具有巨大的應(yīng)用前景。RNAi的高效性、用量少、毒副作用小及序列特異性使它成在研究基因功能及基因治療手段上占有極大的優(yōu)勢(shì)[20-22]。但又是由于高度的序列特異性使得RNAi在臨床應(yīng)用方面有些待解決的問(wèn)題：(1)對(duì)靶點(diǎn)序列要求嚴(yán)格，1個(gè)堿基的錯(cuò)配都將大大降低目的基因表達(dá)的抑制作用；(2)通過(guò)載體和脂質(zhì)體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，因細(xì)胞來(lái)源的不同效果亦有所不同；(3)目前雖然已有研究利用RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)成功地抑制了某些特定基因的表達(dá)，但其方法尚不適合于人類(lèi)。隨著現(xiàn)在科技與醫(yī)學(xué)發(fā)展的不斷進(jìn)步，RNAi研究的不斷深入，所有困難均會(huì)迎刃而解，其應(yīng)用范圍也將會(huì)越來(lái)越廣。在不久的將來(lái)，RNAi作為一種強(qiáng)有力的基因治療手段應(yīng)用于臨床，在攻克人類(lèi)疾病方面將會(huì)發(fā)揮其巨大的作用[23]。