曹志威，申 杰，張司璽，張春陽

[1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科；3.包頭醫(yī)學院神經外科疾病研究所(轉化醫(yī)學)；4.內蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復工程技術中心]

Runx2是Runx轉錄因子家族中的一員，其家族基因還有Runx1和Runx3。Runx2在軟骨細胞、成骨細胞和多能間充質干細胞等多種形式的細胞中都有一定的表達[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺和胸腺中Runx2也有所表達。雖然Runx2不是T細胞發(fā)育所必需，但它是乳腺發(fā)育所必需[2]。P1和P2兩個啟動子對Runx2基因的轉錄起到調控作用。P1與P2轉錄過程中相對應的兩種異構體，均能夠在成骨細胞系和軟骨細胞中表達，但Runx2在這些系中的表達受增強子的調控，其中大部分仍有待鑒定[3]。

1 Runx2在軟骨細胞中的功能

Runx2在各時期的軟骨細胞中都有表達，但在各個階段表達量有所不同，前期增加，中期略有下降，終末期再次增加。Runx2實驗鼠除脛骨、腓骨、尺骨、橈骨外，在其他骨骼中，都未找到肥大軟骨細胞[4]。Runx3在早期肥大軟骨細胞中，也有一定表達。Runx3基因敲除實驗鼠軟骨細胞的成熟在胚胎階段存在相應的滯后性。Runx2與Runx3基因敲除實驗鼠的全部骨骼，均未發(fā)現(xiàn)肥大軟骨細胞。所以，Runx2和Runx3在軟骨細胞的發(fā)育形成中扮演著重要角色。Runx2發(fā)揮關鍵功能，而Runx3發(fā)揮輔助性功能。在早期肥大軟骨細胞中，Runx2影響Ihh的表達，進而加快軟骨細胞的增殖速度[5]。另外，在一些實驗中還觀察到，Ihh影響甲狀旁腺激素樣激素(Pthlh)的生成，而后者抑制Runx2，從而延緩軟骨細胞的成熟過程。Runx2-Ihh-Pthlh形成軟骨細胞發(fā)展過程中的負反饋環(huán)[6]。

Runx2在軟骨細胞中的過表達加速了整個軟骨細胞的成熟，從而損害關節(jié)的形成。細胞黏合素(Tenascin)在永久軟骨中表達，但在特異性的Runx2轉基因實驗小鼠中，其軟骨內并未表達。在特異性陰性的Runx2轉基因實驗鼠中，Tenascin在全部骨骼環(huán)境下均有分布[7]。它對軟骨細胞變成像生長板樣的軟骨細胞還是關節(jié)軟骨樣的永久性軟骨細胞具有決定性作用。Runx2基因敲除實驗鼠對骨關節(jié)炎的形成和發(fā)展，有明顯的延緩作用，而軟骨細胞特異性Runx2的不足推遲OA的變化，三苯氧胺誘導關節(jié)軟骨中Runx2表達加速實驗性OA小鼠的OA進展[8-9]。除Runx2表達外，Runx2調節(jié)的Ihh、Mmp13和Col10a1表達也增加[10]。導致骨性關節(jié)炎的一個原因是軟骨細胞的成熟，而Runx2轉錄因子在其中起著關鍵作用。

2 Runx2在成骨細胞中的功能

Ihh基因敲除小鼠的實驗中，在軟骨中沒有觀察到成骨細胞的分布，軟骨膜中出現(xiàn)的基因并未發(fā)現(xiàn)Runx2，說明軟骨內骨必須要Ihh才能表達Runx2[11]。Ihh與受體Patched(Ptch)結合解除Ptch對Smoothened(Smo)的抑制，Smo最終調節(jié)轉錄因子Gli[12]。在使用Col2a1-Cre的Smo因素敲除實驗鼠中，Cre在軟骨細胞和包含成骨細胞前體的軟骨膜細胞中都有一定的表達，相比之下Runx2在軟骨膜中并未表達，不過在軟骨膜外的細胞中，觀察到Runx2的存在[13]。然而，指導成骨前細胞表達Cre的Sp7Cre缺失Smo并不影響成骨細胞的分化[14]。所以，Hedgehog信號路徑調控Runx2表達與成骨細胞分化的作用，只是出現(xiàn)在軟骨內骨發(fā)育的骨祖細胞階段。

在使用Twist2Cre的條件性Ctnnb1基因敲除實驗鼠中，未觀察到成骨細胞的分布，但Runx2在軟骨膜內表達[15]。所以，Wnt信號路徑的功能實現(xiàn)，對成骨細胞分化過程十分關鍵，不過對Runx2在相應前體細胞中的表達，并非是不可或缺的。Sp7是成骨細胞分化所必需的另一種轉錄因子。Sp7基因敲除小鼠缺乏成骨細胞，但Runx2在骨祖細胞中表達[16]。Sp7在成骨前細胞和成骨細胞中都有表達，Runx2誘導Sp7表達[17]。因此，Runx2是Sp7的上游轉錄因子。在敲除Ctnnb1基因與SP7基因敲除的實驗鼠中，骨祖細胞能夠分化成軟骨細胞。所以，表達Runx2的成骨細胞一直具有朝軟骨細胞轉化的性能，Wnt信號和Sp7影響骨祖細胞的分化，同時抑制其向軟骨細胞的分化。

骨祖細胞和成骨前細胞弱表達I型膠原，這是一種異三聚體蛋白，由Col1a1和Col1a2分別編碼的兩條cyp1(I)鏈和一條cyp2(I)鏈組成。未成熟的成骨細胞上調Col1a1和Col1a2的表達，表達Spp1和Ibsp，成熟的成骨細胞表達有Bglap2和Bgap編碼的骨鈣素[18]。體外研究表明，Runx2上調這些基因的表達[19]。在Runx2基因敲除小鼠中缺乏成骨細胞系細胞表達這些基因。在丟失Runx2基因P1啟動子和外顯子I的Ⅱ型Runx2缺陷小鼠骨骼中，Spp1和Bglap2表達減少，但Col1a1表達增加[20]。成骨細胞中欠缺結構域丟失情況下，并不會造成骨骼表型的缺失，外顯子8的不足將會形成隱藏的Runx2蛋白，后者保留DNA結合能力，而轉錄激活性能不足，造成骨骼質量變差[21]。由于隱蔽的Runx2蛋白可能干擾Runx3的結合，而Runx3也參與骨形成[22]。所以Runx2是怎樣在機體內部調控相關蛋白基因的表達，后續(xù)還需要深入研究。

3 Runx2對成骨細胞系細胞增殖的調節(jié)功能

使用Prrx1啟動子過表達Runx2導致顱縫早閉和肢體缺損[23]。肢體缺損的具體狀態(tài)和轉基因的表達情況相關。肢體經過成纖維細胞生長因子(Fgfs)與相應受體形成的上皮-間充質相互作用環(huán)發(fā)育[24]。間充質中表達的Fgf10通過對和Fgf10具有高親和力的Fgfr2b誘導上皮中Fgf4和Fgf8的表達。Fgf4和Fgf8通過與Fgf4和Fgf8具有高親和力的Fgfr1c和Fgfr2c誘導間充質細胞增殖。在Runx2過表達的小鼠中，F(xiàn)gf4和Fgf8在上皮中的表達受損，頂端外胚層嵴(AER)的形成中斷。這些表型是由間充質中與Fgf10有高親和力的Fgfrs表達上調引起。Runx2通過直接調節(jié)Fgfr1、Fgfr2和Fgfr3的啟動子來誘導它們的表達[25]。

Ctnnb1基因敲除小鼠和SP7基因敲除小鼠都缺乏成骨細胞，但在假定的骨區(qū)域有豐富的骨祖細胞。雖然Runx2基因敲除實驗鼠同樣缺乏成骨細胞，不過骨祖細胞只在特定的范圍中有分布。在Sp7基因敲除小鼠體內的骨祖細胞表達Runx2并活躍增殖。Sp7基因敲除小鼠的脛骨和腓骨，因為內部骨祖細胞的充分積聚而彎曲，表明Runx2在骨祖細胞擴增中是必需的。事實上，Runx2誘導來源于野生型和SP7基因敲除小鼠的骨祖細胞的增殖，并增加Fgf2誘導的增殖。Fgfr2和Fgfr3參與增殖，F(xiàn)gfr2在顱骨中的表達水平遠高于Fgfr3，因此Fgfr2起主要作用。Sp7基因敲除Runx2基因敲除小鼠的骨祖細胞數(shù)量和增殖頻率只有SP7基因敲除小鼠的一半，提示骨祖細胞的增殖依賴于Runx2的基因劑量。因此，骨祖細胞增殖需要Runx2，是通過直接調節(jié)Fgfr2和Fgfr3誘導的[26]。

一些報道表明，Runx2在體外能夠抑制向成骨細胞系或間充質干細胞的增殖[26]。Runx2基因敲除顱骨細胞體外增殖快于野生型顱骨細胞。有研究顯示，在Runx2基因敲除小鼠的培養(yǎng)中，細胞周期相關基因在顱骨組織和顱骨來源的細胞之間表達不同[25]。雖然Runx2基因敲除顱骨細胞在體外獲得高增殖活性的原因尚不清楚，但Runx2在體內和體外都能促進成骨前體細胞的增殖。

4 Runx2在間充質細胞向成骨細胞分化中的作用

經過創(chuàng)建顱骨發(fā)育模型，可以較為理想地闡述間充質細胞向成骨細胞的分化過程和內在原理。Runx2基因敲除小鼠沒有顱骨，只有一層薄薄的間充質細胞[27]。Runx2基因敲除小鼠出現(xiàn)顱骨發(fā)育，但過程延遲且縫合線未閉合。在實驗鼠額后縫中，間充質在P7附近出現(xiàn)凝聚，間充質細胞逐漸完成分化，軟骨細胞成熟，軟骨由軟骨內成骨替代[28]。

在Runx2基因敲除小鼠中，額后縫未見軟骨細胞出現(xiàn)，并且所有縫線中的細胞密度都較低。在野生型和Runx2基因敲除小鼠中，縫合細胞同時表達Sox9和Runx2。Sox9在野生型和Runx2基因敲除小鼠中的表達水平相似。但是，Runx2基因敲除小鼠縫合細胞和成骨細胞中的Runx2-mRNA水平僅為野生型小鼠相應水平的一半。而在顱骨縫合細胞中Runx2-mRNA的表達水平只有成骨細胞的1/3～1/2。與野生型小鼠相比，Runx2基因敲除小鼠的縫合細胞增殖降低并且Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信號通路基因的表達降低。而且這些基因的表達直接受Runx2的調控。然而，與野生型小鼠相比，這些基因以及Sp7、Col1a1和Bglap2在Runx2基因敲除小鼠顱骨組織中的表達卻沒有降低。說明縫線間充質細胞的增殖及其向成骨細胞系細胞的轉化，以及對hedgehog、Wnt、Fgf和Phhlh信號通路基因的誘導需要半數(shù)以上的Runx2劑量。然而，半劑量的Runx2足以使成骨細胞誘導這些信號通路基因Sp7和骨基質基因的表達。Hedgehog激動劑、Wnt3a、Fgf2和Pthlh(1-34)可促進顱骨形成，拮抗劑能夠抑制骨形成以及縫合間充質細胞的生長。因此Runx2通過增加Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信號通路基因的表達來誘導縫合間充質細胞增殖并將其轉化為成骨細胞系細胞。在這些信號通路中，F(xiàn)gf信號通路可能在間充質細胞、骨祖細胞和成骨前細胞的增殖中起著最重要的作用[25，28]。

Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信號通路能夠誘導Runx2表達或激活Runx2。成骨細胞系細胞的生長與分化受Runx2和這些信號通路的影響，雖然Runx2蛋白的激活等機制已取得較為豐富的成果，但Runx2基因在軟骨細胞和成骨細胞系細胞中的轉錄調控仍有待研究。對Runx2、Sp7和Hedgehog、Wnt、Fgf、Pthlh信號通路之間相互作用的研究將進一步揭示骨骼發(fā)育的整個過程。