陸雅娜，王國(guó)強(qiáng)，張付全，殷嘉浚

精神分裂癥是一組病因未明的重性精神病，多在青壯年緩慢或亞急性起病，以陽(yáng)性癥狀、陰性癥狀和認(rèn)知缺陷為主要特征，影響患者感知覺(jué)、思維、情感和行為等多方面的功能[1-2]。該病不僅嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，還會(huì)給社會(huì)帶來(lái)負(fù)面的影響?？咕癫∷幨蔷穹至寻Y首選的治療措施。有研究[3]表明，大腦中mRNA和蛋白質(zhì)的異常水平可能與精神分裂癥病因有關(guān)。micro RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為21～23 NT的單鏈RNA分子[4]；通過(guò)降解mRNA或者直接阻斷翻譯過(guò)程，達(dá)到阻止蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞通路產(chǎn)生重大影響[5-8]。近期研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA-92a-3p在精神分裂癥的病因和病理生理學(xué)中起著重要作用。經(jīng)本中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本研究觀察抗精神病藥治療對(duì)精神分裂癥患者外周血單核細(xì)胞miRNA-92a-3p表達(dá)的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 患者組：為2017年4月至11月本中心門診和住院治療的精神分裂癥患者26例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)《精神障礙與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第5版(DSM-5) 精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②漢族，年齡18～60歲；③首發(fā)或者復(fù)發(fā)患者，入組前應(yīng)未曾服藥或已停藥≥4周，陽(yáng)性與陰性癥狀量表(PANSS)≥60分。④患者或監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神活性物質(zhì)濫用及其他重性精神疾病者； ②顱腦外傷及腦器質(zhì)性疾病者； ③患精神分裂癥以外的遺傳疾病者；④3個(gè)月內(nèi)曾行無(wú)抽搐電休克治療(MECT) 者；⑤孕期或哺乳期患者。其中男12例，女l4例；平均年齡 (36.0±10.1)歲。對(duì)照組：為同期招募的社會(huì)志愿者48名；18～60歲；與入組患者無(wú)血緣關(guān)系； 兩系三代內(nèi)無(wú)精神疾病家族史，無(wú)嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重軀體疾病者、嚴(yán)重腦外傷史者；近1個(gè)月內(nèi)無(wú)輸血史。受試者自愿參加，并簽署知情同意書。其中男17名，女31名；平均年齡(31.6±6.9)歲。組間性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 治療方法及量表評(píng)定 患者入組后即給予非典型抗精神病藥單藥治療，其中奧氮平6例，利培酮15例，氯氮平2例，喹硫平1例，齊拉西酮1例，阿立哌唑1例。在2～4 周里逐漸增加到有效劑量，療程12周。治療前后給予PANSS評(píng)定臨床癥狀。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞miRNA-92a-3p檢測(cè) 利用RT-qPCR法檢測(cè)患者組治療前后及對(duì)照組外周血單核細(xì)胞miRNA-92a-3p表達(dá)水平。使用BD靜脈真空采血管采集受試者靜脈全血2.5 ml，顛倒混勻，每50～100 mg組織樣品，加入1 ml TRIZOL試劑，用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿。收獲細(xì)胞 1～5×107，移入 1.5 ml離心管中，加入 1 ml TRIZOL，混勻，室溫靜置 5 min。離心后將所分離的單核細(xì)胞置于凍存管中-80℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄RNA與實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用TRIZOL(Invitrogen公司；美國(guó))試劑盒從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中分離總RNA，使用cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司；美國(guó))將高容量的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用補(bǔ)充數(shù)據(jù)表SXX和SYBRSelectMasterMix(Invitrogen；USA)中列出的引物進(jìn)行RT-qPCR。 使用7900HT實(shí)時(shí)PCR儀(Applied Biosystems；USA)對(duì)于3個(gè)獨(dú)立樣品中的每一個(gè)，RT-qPCR一式三份進(jìn)行。選擇內(nèi)參(小核RNA U6)分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。內(nèi)參U6雙向引物序列(5'-3')GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT(6-Forward)，CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(6-Reverse)；has-miR-92a-3p(5'-3')GGGTATTGCACTTGTCCCG (6-Forward)，GTGCGTGTCGTGGAGTCG(6-Reverse)。退火溫度均為60℃。 數(shù)據(jù)采用2- △△ CT法進(jìn)行分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)結(jié)果采用Data Assist 3.0和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以小核RNA U6為內(nèi)參，以對(duì)照組1號(hào)樣本為基準(zhǔn)，以所測(cè)miRNA與內(nèi)參小核RNA U6的閾值環(huán)(Ct)之差再與基準(zhǔn)(對(duì)照組1號(hào))miRNA與內(nèi)參U6之差的差值計(jì)算為△△Ct值，以2-△△Ct表示miRNA相對(duì)表達(dá)水平。采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)比較對(duì)照組與研究組用藥前miRNA表達(dá)水平的差異。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較研究組用藥前與用藥12周末miRNA表達(dá)水平的差異。Spearman相關(guān)分析miRNA表達(dá)與PANSS評(píng)分的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-92a-3p相對(duì)表達(dá)量比較 外周血單核細(xì)胞miR-92a-3p相對(duì)表達(dá)量患者組治療前后分別為(6.697±3.870)及(11.119±8.390)，明顯高于對(duì)照組(1.428±0.838)(P均<0.01)；患者組治療后表達(dá)較治療前明顯上調(diào)(Z=-2.172，P<0.05)。

2.2 外周血單核細(xì)胞miR-92a-3p表達(dá)與PANSS總分相關(guān)性分析 患者組外周血單核細(xì)胞miR-92a-3p表達(dá)水平變化與PANSS總分變化無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

Sempere等[10]發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者顳上回中micorRNA(miRNA)表達(dá)的升高對(duì)疾病具有廣泛的意義，而每一個(gè)miRNA分子能夠影響數(shù)百個(gè)靶基因的表達(dá)。在線獨(dú)立軟件程序(TargetScan和miRanda)預(yù)測(cè)了6000個(gè)靶基因,GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析后表明突觸后致密物(PSD)與精神分裂癥相關(guān)。研究[11]表明,PSD蛋白被認(rèn)為是治療精神分裂癥的潛在分子靶點(diǎn)。且miRNA靶向基因網(wǎng)絡(luò)確定了PSD3作為miR-92a-3p的靶基因[12]?；诖?，可將miR-92a-3p用作精神分裂癥疾病的生物標(biāo)志物，與本研究中患者組miRNA-92a-3p的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果是一致的。

有研究發(fā)現(xiàn)抗精神病藥能改變miRNA 的潛在網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)與BDNF、谷氨酸和5-HT等密切相關(guān)[13]。數(shù)據(jù)庫(kù)miRPathDB預(yù)測(cè)miR-92a-3p的另一靶基因?yàn)槟[瘤抑制因子PTEN，即磷酸酶和張力蛋白同源物，可通過(guò)PI3K / AKT / GSK3途徑，調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞增殖，遷移和凋亡[14-21]，參與精神分裂癥的病理生理過(guò)程[22-23]。其中GSK3已被證實(shí)作為幾種非典型抗精神病藥的共同靶點(diǎn)[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者組miR-92a-3p表達(dá)上調(diào)，經(jīng)藥物治療后表達(dá)仍顯著上調(diào)，由此推測(cè)精神分裂癥患者外周血單核細(xì)胞中miR-92a-3p存在異常表達(dá)，且在抗精神病藥物治療12周后，miR-92a-3p通過(guò)靶基因調(diào)控，阻斷蛋白分子的表達(dá)，參與神經(jīng)元通路，影響其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與谷氨酸等通路相互作用，表達(dá)量發(fā)生變化。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，患者組治療前后miRNA-92a-3p相對(duì)表達(dá)量變化與PANSS總分變化無(wú)相關(guān)性。提示miR-92a-3p的差異表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度無(wú)明顯相關(guān)性。關(guān)于miR-92a-3p與精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的研究不多，上述結(jié)果表明，miRNA-92a-3p可作為精神分裂癥疾病的生物標(biāo)志物，抗精神病藥對(duì)精神分裂癥的治療可能通過(guò)上調(diào)miR-92a-3p實(shí)現(xiàn)，但對(duì)預(yù)測(cè)疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后有待進(jìn)一步明確。本研究的局限是樣本量有限，在今后的研究中可以擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。