王安然，張文凈，王朝夫

骨肉瘤是一種惡性骨腫瘤，發(fā)病人群以兒童及青少年為主，累及長骨干骺端、股骨遠端及腔骨近端等[1-2]。目前，骨肉瘤的診斷和臨床治療有了明顯的改善，但仍有50%的骨肉瘤患者在確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，外科手術(shù)的治愈率不足20%，隨著放、化療治療方案的不斷完善，治療效果有所提高，但骨肉瘤患者5年生存率仍較低[3]。

Wnt是一種具有生物調(diào)節(jié)作用的分泌蛋白，已知Wnt與多種腫瘤產(chǎn)生及進展存在相關(guān)性，如在乳腺腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、肝腫瘤及胰腺腫瘤等中均存在Wnt異常表達，Wnt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子加快整個通路異常活化，導(dǎo)致腫瘤細胞過度增殖。Wnt信號通路主要分為兩種形式發(fā)揮細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，一種是細胞間交流，另一種是自體細胞的交流。Wnt信號通路存在高度保守型，按照信號傳遞方式分為經(jīng)典及非經(jīng)典通路途徑，共同發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用[4]。以往文獻證實，Wnt信號通路表達上調(diào)能夠加快腫瘤形成，β-catenin是Wnt發(fā)生作用的關(guān)鍵因子，是信號從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)遞至細胞核內(nèi)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。正常細胞內(nèi)β-catenin含量較少，主要表達于細胞質(zhì)，另一部分主要與其他信號通路(如GSK-3p)形成復(fù)合體，大部分表達于細胞膜，具有調(diào)節(jié)細胞間黏附作用。β-catenin能夠在Wnt激活時進入細胞核，發(fā)揮啟動靶基因而增加腫瘤細胞生長及增殖等作用[6]。目前，關(guān)于Wnt/β-catenin信號通路與骨肉瘤的產(chǎn)生、治療的相關(guān)文獻較少。因此，探討Wnt/β-catenin在骨肉瘤中的作用對了解疾病發(fā)生、發(fā)展機制具有重要作用。本文針對Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤中的機制研究進展作一綜述。

1 Wnt信號通路及相關(guān)蛋白

Wnt是在乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的具有細胞生長發(fā)育調(diào)節(jié)作用的蛋白，能夠?qū)е鹿墴o翅，隨著分子生物技術(shù)的進步在人類器官中發(fā)現(xiàn)了Wnt基因。Wnt能夠結(jié)合自身細胞膜上的受體發(fā)揮生物作用，但是不同Wnt蛋白在不同生理病理中存在特異性[7-8]。Yun等[9]的研究結(jié)果證實Wnt蛋白中一個半胱氨酸能夠被棕櫚?；崾網(wǎng)nt蛋白受脂質(zhì)化調(diào)節(jié)。Frizzled1(FZD1)是FZD基因家族，是參與編碼Wnt受體蛋白的基因，F(xiàn)ZD1為反復(fù)7次跨膜蛋白，其是Wnt信號通路的受體蛋白，能夠參與Wnt經(jīng)典及非經(jīng)典通路途徑[10]。蓬亂蛋白(dishevelled, DVL)是Wnt信號調(diào)節(jié)蛋白，由670個氨基酸殘基組成，作為關(guān)鍵的中間信號分子介導(dǎo)不同Wnt信號通路的激活,其包括3個高度保守的結(jié)構(gòu)域DIX、PDZ和DEP，其中DIX結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)經(jīng)典Wnt信號，DEP結(jié)構(gòu)域在非經(jīng)典Wnt信號通路中起作用，而中間的PDZ結(jié)構(gòu)域在兩種通路中均起作用[11]。

2 β-catenin結(jié)構(gòu)及功能

β-catenin是由多肽鏈組成的位于人體染色體3p21-3p22的蛋白，因位置不同而存在兩部分功能：(1)β-catenin能夠在細胞膜上與E-cadherin結(jié)合后發(fā)揮細胞之間連接作用；(2)參與Wnt信號通路，可以作為下游因子在細胞核中激活核轉(zhuǎn)錄因子而啟動細胞轉(zhuǎn)錄作用[12-13]。正常情況下，β-catenin主要集中在細胞膜，少部分與GSK-3β及軸素形成多聚蛋白聚合物，導(dǎo)致β-catenin磷酸化，進一步被泛素蛋白所降解保持低水平狀態(tài)。但當Wnt活性升高時，F(xiàn)ZD1能夠連接其他信號蛋白形成復(fù)合物，抑制GSK-3β對β-catenin的降解能力，增加細胞質(zhì)中β-catenin的含量，當β-catenin含量達到一定水平時能夠從細胞質(zhì)中進入細胞核，發(fā)揮腫瘤信號傳導(dǎo)作用[14]。

3 Wnt/β-catenin信號通路的組成及調(diào)節(jié)因子

Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)分別在細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核等完成，Wnt啟動依賴于β-catenin進入細胞核而發(fā)揮作用。目前，關(guān)于Wnt/β-catenin信號通路的研究逐漸深入，其調(diào)節(jié)因子包含多種。RNF43和ZNRF3均是Wnt/β-catenin信號通路負性調(diào)節(jié)因子，能夠快速識別Wnt受體并能夠快速溶解酶破壞而特異性介導(dǎo)FZD受體多泛素化。R-脊椎蛋白1(R-spondin1, Rspo1)是位于人胚胎的腦cDNA的新基因，可在人胚胎及肌肉組織中亦被檢測到。Rspo1蛋白可以激活Wnt/β-catenin信號通路[15-16]。

4 Wnt/β-catenin信號通路與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展

常用的人骨肉瘤細胞株有SAOS-2、U2OS、143B等，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與多信號通路激活或沉默相關(guān)，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤產(chǎn)生具有相關(guān)性，Wnt3a和Wnt10b能夠增加骨肉瘤實驗中小鼠病灶的轉(zhuǎn)移，與激活β-catenin表達相關(guān)。相關(guān)實驗結(jié)果證實，Wnt信號能夠通過自分泌或旁分泌方式參與骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移而降低患者的生存率[17-18]。體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)[19]，激活Wnt5a、U2OS細胞株后細胞顯示出明顯的侵襲性，抑制Wnt5a會抑制骨肉瘤的侵襲力。Wnt5b能夠聯(lián)合酪氨酸激酶樣孤獨受體-2(ROR2)共同促進骨肉瘤細胞的增殖、生長及轉(zhuǎn)移，臨床認為可以通過干預(yù)該信號通路發(fā)揮治療骨肉瘤的作用。黏結(jié)蛋白聚糖2(syndecan-2, SDC2)為抗腫瘤效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，在骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路具有抑制SDC2的表達，反向調(diào)節(jié)能夠利用Wnt信號通路拮抗劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(SFRP1)而增加SDC2的表達，進而改善骨肉瘤疾病的進展[20]。RhoA信號通路是治療骨肉瘤的靶點指標，抑制RhoA表達能夠提高SDC2活性而改善疾病進展，為探索Wnt信號通路在骨肉瘤的發(fā)展中提供新的治療思路。

β-catenin在骨肉瘤組織中的陽性率為70%，與癌旁組織中的表達存在差異。骨肉瘤細胞發(fā)生侵襲作用的條件之一為β-catenin，在細胞核內(nèi)β-catenin含量增加能夠促進骨肉瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加干細胞形成，上述兩種能力均能夠增加骨肉瘤細胞的生長及擴散，加快腫瘤細胞的侵襲及遷移[21]。通過調(diào)控人骨肉瘤SAOS-2細胞株中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路和抑制氧化應(yīng)激可抑制腫瘤細胞的生長。β-catenin在骨肉瘤的表達與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在骨肉瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用，β-catenin可作為骨肉瘤診斷和預(yù)測轉(zhuǎn)移的指標。Yang等[22]的實驗結(jié)果證實，在骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路中的抑制因子-1(WIF-1)的表達水平顯著降低。WIF-1表達降低與Wnt/β-catenin信號通路激活相關(guān)，上述結(jié)論在眾多腫瘤細胞中得以證實，如WIF-1基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達下調(diào)，促進了β-catenin蛋白在細胞質(zhì)中的累積，導(dǎo)致靶基因Cyclin D1過度激活。WIF-1能夠通過抑制β-catenin表達上調(diào)Cyclin D1表達而加快甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移。在膽管癌中，WIF-1啟動子的甲基化導(dǎo)致其在膽管癌細胞中表達下降，進而不能抑制Wnt/β-catenin信號通路而發(fā)揮抑癌作用。WIF-1在膽管癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起極其重要的作用。在骨肉瘤細胞體外研究中，WIF-1表達降低，能夠?qū)е娄?catenin蛋白在細胞質(zhì)中異常積聚，從而使經(jīng)典Wnt信號通路過度激活，參與細胞的生長、增殖，促進疾病的發(fā)展。Wnt/β-catenin信號通路中存在多種致癌因子，研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP9)過表達對人骨肉瘤MG63細胞有正性調(diào)節(jié)作用，該調(diào)控作用可能與Wnt/β-catenin信號通路表達激活相關(guān)[23]。TIKI2基因在骨肉瘤組織中表達降低，過表達能夠減少骨肉瘤細胞的生長和侵襲，這與TIKI2能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路激活相關(guān)。在骨肉瘤中，F(xiàn)HL2作為一種致癌因子，沉默F(xiàn)HL2表達可明顯抑制骨肉瘤U2OS細胞增殖并促進細胞凋亡，使細胞阻滯于G0/G1期，F(xiàn)HL2介導(dǎo)了p53對Bax啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。相反，F(xiàn)HL2表達升高時能夠促進Wnt/β-catenin信號通路激活導(dǎo)致腫瘤形成。

國內(nèi)最新研究證實，Wnt/β-catenin通路也參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，促進細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)，使腫瘤細胞具有侵襲性，誘導(dǎo)腫瘤細胞的免疫耐受和血管生成，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移擴散的增加[24]。另外，骨肉瘤細胞中典型Wnt信號通路的異常激活似乎與細胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的誘導(dǎo)、骨肉瘤促腫瘤細胞干細胞特性的獲得以及轉(zhuǎn)移擴散密切相關(guān)[25]。在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細胞中Wnt/β-catenin信號表達活躍，是Wnt配體(Wnt2和Wnt8b)過度活化增加腫瘤細胞生物活性作用，在抑制Wnt2和Wnt8b表達后能夠抑制腫瘤細胞增殖及降低骨損傷，基于以上背景，通過給予白鮮堿干預(yù)后，β-catenin的核異位增加以及促進β-catenin抑癌作用的靶基因表達增加，癌細胞活性降低。但是部分研究者認為Wnt通路在骨肉瘤中失活，晚期Wnt通路活化促進腫瘤干細胞參與耐藥或轉(zhuǎn)移[18]。

最新國際研究[26]，骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin存在異常激活，在原發(fā)性或繼發(fā)性骨腫瘤中能夠發(fā)揮加快骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移等作用。Wnt/β-catenin信號通路能夠通過增加降低骨肉瘤細胞自噬而加快疾病發(fā)展。骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中相關(guān)信號生物學(xué)的改善與腫瘤化療抵抗性相關(guān)，因此針對性改變相關(guān)信號通路分子生物學(xué)能夠顯著升高患者的臨床療效。余湘等[27]的實驗結(jié)果證實，Wnt/β-catenin信號通路能夠沉默Beclin1基因而減少MG63骨肉瘤細胞的凋亡，提示W(wǎng)nt信號與骨肉瘤細胞化療藥物耐藥性存在相關(guān)性。

5 Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤防治中的研究

Wnt/β-catenin信號異?；罨瘏⑴c骨肉瘤的生物學(xué)行為，侵襲及遷移是骨肉瘤細胞最基本的特征，Wnt/β-catenin信號通路能夠通過增加骨肉瘤細胞的侵襲及遷移加快疾病的肺轉(zhuǎn)移，惡化病情。目前，臨床關(guān)于抑制Wnt/β-catenin信號通路阻礙下游信號通過的研發(fā)主要由藥物以及酶類抑制劑組成。

5.1 GSK-3β抑制藥物近些年，關(guān)于針對GSK-3β信號通路的抑制因子及藥物逐漸被發(fā)現(xiàn)，并已經(jīng)應(yīng)用于體外實驗研究中。青蒿素存在抗骨肉瘤的作用，雙氫青蒿素抑制人骨肉瘤細胞143B增殖及侵襲作用顯著，這與能夠減少腫瘤血管生成及抑制MMP-9的活性相關(guān)，但是青蒿素對骨肉瘤的抑制作用還能夠通過抑制其他因子而發(fā)揮作用，青蒿素能夠降低骨肉瘤細胞中GSK-3β的表達而抑制β-catenin水平，研究機制在于青蒿素能夠抑制GSK-3β下游因子Dvl蛋白，發(fā)揮Dvl蛋白對GSK-3β及復(fù)合物的降解作用而使其活性抑制，從而降低了Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)作用，能夠改善骨肉瘤。向雨晨等[28]的研究結(jié)果證實，重樓皂苷(PPI)能夠降低骨肉瘤活性的可能機制在于抑制Wnt/β-catenin活性，PPI主要是能夠靶向抑制GSK-3β活性，進一步下調(diào)β-catenin表達改善病情。

5.2 β-catenin抑制藥物夾竹桃苷能夠發(fā)揮抗骨肉瘤細胞活性作用，研究機制與夾竹桃苷能夠抑制β-catenin從細胞質(zhì)進入到細胞核，降低了Wnt/β-catenin合成及信號傳導(dǎo)作用而改善病情。Lee等[29]的熒光素酶報告顯示，抑制GSK-3β因子轉(zhuǎn)錄能夠下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路中的MMP-2和MMP-9，進而減少骨肉瘤細胞的侵襲及遷移。過表達β-catenin能夠增加骨肉瘤細胞系MG-63的體外增長，但是特異性抑制β-catenin基因后能夠抑制細胞侵襲及轉(zhuǎn)移，而淫羊藿苷與特異性抑制β-catenin基因作用相似，亦能夠降低細胞的生物活性，機制是能夠下調(diào)GSK-3β表達而間接抑制Wnt/β-catenin信號通路活性相關(guān)。

5.3 酶類抑制劑研究證實，酶類物質(zhì)環(huán)氧化酶COX2塞萊希布能夠通過激活GSK-3β信號通路減少β-catenin信號異常激活而降低細胞核中轉(zhuǎn)入，增加Wnt/β-catenin信號通路降解而減少骨肉瘤細胞的生長、侵襲及遷移等。TIKI2是抑制Wnt/β-catenin信號通路蛋白酶，在骨肉瘤細胞中表達降低，能夠通過抑制下游GSK-3β信號通路的活性，去除N-末端氨基酸而Wnt/β-catenin被寡聚化而失活。通過腺病毒轉(zhuǎn)染TIKI2恢復(fù)其表達后促進β-catenin的磷酸化GSK-3β表達，減少細胞核β-catenin水平，抑制了骨肉瘤細胞增殖[30]。

6 小結(jié)

Wnt/β-catenin屬于經(jīng)典信號通路，能夠調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的分化、增殖及凋亡。目前，靶向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路活性已為臨床干預(yù)骨肉瘤提供新思路。但是，現(xiàn)階段還處于研究及探索階段，臨床研究較少。關(guān)于此類的研究主要集中在細胞實驗及動物實驗，能夠證實干預(yù)Wnt/β-catenin信號通路對骨肉瘤細胞增殖有抑制作用。但是部分學(xué)者提出抑制Wnt/β-catenin信號通路對骨肉瘤疾病有改善作用的同時是否能夠?qū)е缕渌涣挤磻?yīng)的發(fā)生。因此，在后續(xù)的研究中應(yīng)加深對骨肉瘤研究機制的探討，觀察導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路激活的相關(guān)特異性標記因子，開發(fā)靶向抑制藥物，為臨床應(yīng)用提供強有力的實驗證據(jù)。