李福興, 張自華, 李雪梅綜述, 趙衛(wèi)東審校

0 引 言

中性粒細(xì)胞是機(jī)體的免疫防御細(xì)胞，作為機(jī)體抵御外來(lái)病原體侵入的第一道防線，其有一種特殊的細(xì)胞死亡形式[1]，在某些細(xì)胞因子、病原體或某些化合物的刺激下，活化的中性粒細(xì)胞可向細(xì)胞外釋放去聚化的染色質(zhì)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)，而產(chǎn)生NETs的過(guò)程則被稱(chēng)為NETosis[2]。NETs不僅可包裹及殺傷外來(lái)入侵病原菌起到抗炎作用，還可作為一種自身抗原，發(fā)揮促炎作用，導(dǎo)致多種急慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3]。目前，大量研究表明NETs在腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病及感染性疾病等炎癥性疾病(inflammatory diseases, ID)中發(fā)揮了重要作用[4]。本文就NETs及其在ID發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NETs

早在2004年，Brinkmann等[5]提出了NETs的概念，這是一種新型中性粒細(xì)胞死亡形式，其與凋亡和壞死最大的不同是NETs細(xì)胞死亡的整個(gè)過(guò)程染色質(zhì)是完整連續(xù)的，并不出現(xiàn)染色質(zhì)固縮等現(xiàn)象[6]。活化的血小板、佛波酯、脂多糖、病原菌等均可促進(jìn)NETs的形成，這一系列細(xì)胞事件精細(xì)調(diào)控的結(jié)果即NETosis。在刺激因素作用下，中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)顆粒和核膜發(fā)生溶解，進(jìn)而失去其本來(lái)的分葉狀結(jié)構(gòu)，隨后中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PADI4)等在中性粒細(xì)胞核內(nèi)協(xié)調(diào)組蛋白高聚亞氨酸化及染色質(zhì)去皺，促成細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核含量?jī)?nèi)容物的融合。最終，中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜破裂，核酸和蛋白混合物釋放到胞外形成以核酸為骨架附著大量顆粒蛋白的NETs[7-8]。

2 NETs機(jī)制

2.1 經(jīng)典途徑在脂多糖和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)下，中性粒細(xì)胞內(nèi)容物被擠出，中性粒細(xì)胞發(fā)生核物質(zhì)擴(kuò)散，染色質(zhì)濃縮，核包膜崩解等過(guò)程，隨后細(xì)胞質(zhì)和核組分的混合，質(zhì)膜破裂，染色質(zhì)釋放。這一過(guò)程依賴(lài)Raf-MEK-ERK途徑激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生活性氧(ROS)，進(jìn)而激活受體相互作用蛋白激酶-3—混合譜系激酶樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而這種類(lèi)型的NETs形成是由補(bǔ)體系統(tǒng)，TLR2和(或)纖維連接蛋白啟動(dòng)的，染色質(zhì)以胞內(nèi)囊泡的方式，以完整的質(zhì)膜從細(xì)胞釋放[9]。

2.2 Gasdermin D途徑最新研究發(fā)現(xiàn)，Gasdermin D蛋白可引發(fā)細(xì)胞焦亡和NETs[10]。在正常細(xì)胞條件下，Gasdermin D蛋白保持全場(chǎng)的無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到脂多糖等刺激后，Gaspermin D則被半胱氨酸蛋白酶或中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶切，然后，新釋放的Gasdermin D的N端部分發(fā)生寡聚反應(yīng)，在細(xì)胞膜上形成一個(gè)裂解孔，靶向和溶解中性粒細(xì)胞顆粒膜，釋放出NE和MPO。這些顆粒蛋白的釋放引發(fā)核分離、DNA擴(kuò)散、組蛋白降解、染色質(zhì)濃縮和核膜滲透。

3 NETs與炎癥

中性粒細(xì)胞可通過(guò)吞噬、釋放溶菌酶和形成NETs進(jìn)而殺滅感染的細(xì)菌、真菌，但有研究證實(shí)，在機(jī)體感染時(shí)，NETs也會(huì)與細(xì)胞毒性、促炎癥、促血栓形成等不良事件密切相關(guān)[11]；而在血管炎的患者中存在專(zhuān)門(mén)針對(duì)NETs的抗體[12]；一項(xiàng)針對(duì)SARS-Cov-2的大型研究表明NETs會(huì)增加患者的器官損傷，甚至死亡[13-14]；在腫瘤患者中，NETs可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[15]。綜上，NETs在機(jī)體內(nèi)猶如一把雙刃劍，既對(duì)病原體起到防御作用，但其也會(huì)對(duì)宿主造成嚴(yán)重?fù)p害，其過(guò)度浸潤(rùn)和不受控制的激活可能導(dǎo)致正常組織結(jié)構(gòu)的破壞和不受控制的炎癥，然而，其確切機(jī)制目前仍有待深入研究。

4 NETs與炎癥性疾病

4.1 NETs與腫瘤許多實(shí)體腫瘤周?chē)?rùn)著中性粒細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞，該過(guò)程往往伴隨著炎癥反應(yīng)，同時(shí)在小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，炎癥過(guò)程中產(chǎn)生的NETs可喚醒小鼠體內(nèi)休眠的癌細(xì)胞，抑制NETs形成可防止單個(gè)播散性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不斷增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞[16]。近期NETs在腫瘤中的研究取得重大突破，我國(guó)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞膜上的蛋白CCD25可作為 NET-DNA 受體感知胞外DNA，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，監(jiān)測(cè)血液樣本中的 NET-DNA 有望成為評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的一種潛在方法，該研究分析544名乳腺癌患者的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中的NETs，發(fā)現(xiàn)NET-DNA水平與腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟之間存在著密切關(guān)系，并在小鼠腫瘤模型中得到證實(shí)，總的而言，該項(xiàng)研究確定了跨膜蛋白CCD25是DNA的特定感受器，而血液中NETs的水平升高可作為早期預(yù)測(cè)乳腺癌患者肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物，并通過(guò)小鼠模型表明CCD25可作為治療腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)，但目前對(duì)CCD25蛋白的功能研究尚不完全清晰，其治療的可行性仍有待評(píng)估[15]。

國(guó)外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PADI4是NETs形成過(guò)程中最關(guān)鍵酶，以細(xì)胞外DNA水平升高為標(biāo)志的NETs形成促進(jìn)了胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。PADI4基因敲除的胰腺癌小鼠存活率明顯提高，該研究表明游離在血液中的中性粒細(xì)胞的DNA也與癌癥發(fā)展有著密切關(guān)系，通過(guò)敲除PADI4基因可有效抑制胰腺癌的生長(zhǎng)，這可能是未來(lái)胰腺癌治療的新靶點(diǎn)[17]。這些研究均表明，NETs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。通過(guò)監(jiān)測(cè)腫瘤患者血液中的NET-DNA可為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供參考依據(jù)，評(píng)估患者的預(yù)后。同時(shí)，參與NETs形成過(guò)程以及與NETs相互作用的一些生物分子可能成為腫瘤的治療靶點(diǎn)。

此外，NETs參與腫瘤免疫的機(jī)制研究也在進(jìn)行中。國(guó)外團(tuán)隊(duì)首先研究了各種趨化因子、補(bǔ)體C5a、脂多糖等誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和GR-MDSC產(chǎn)生NETs的能力，隨后提出CXCR1和CXCR2是誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生的最重要受體的假設(shè)，并進(jìn)行了驗(yàn)證。體外研究發(fā)現(xiàn)激活CXCR1和CXCR2確實(shí)可誘導(dǎo)NETs的大量產(chǎn)生，使用CXCR1/R2抑制劑Reparixin后可完全抑制NETs的產(chǎn)生，進(jìn)一步在小鼠腫瘤模型中，可阻止NETs形成的PADI4抑制劑GSK484，能明顯增強(qiáng)PD-1抗體+CTLA4抗體的療效，且該機(jī)制是通過(guò)CD8+T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。該研究揭示NETs參與腫瘤免疫的機(jī)制，為相關(guān)趨化因子受體靶點(diǎn)藥物的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)[18]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)患者血漿和腫瘤組織中NETs水平升高與預(yù)后不良有關(guān)。機(jī)制上，DLBCL來(lái)源的IL-8與其受體(CXC receptor 2, CXCR2)在中性粒細(xì)胞上相互作用，通過(guò)Src、p38和ERK信號(hào)通路形成NETs。新形成的NETs直接上調(diào)DLBCL中的Toll樣受體9(Toll-like receptor 9, TLR9)通路，隨后激活NFκB、STAT3和p38通路以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。同時(shí)，在小鼠模型中破壞NETs、阻斷IL8-CXCR2軸或抑制TLR9可延緩腫瘤的進(jìn)展[19]。以上研究均表明NETs參與腫瘤免疫，NETs的產(chǎn)生與CXCR密切相關(guān)，進(jìn)一步揭示了腫瘤與NETs的相互作用，表明NETs是腫瘤潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，并為腫瘤的免疫治療提供了思路。

4.2 NETs與自身免疫性疾病研究表明NETs參與了自身免疫性疾病的發(fā)病進(jìn)程，國(guó)外一項(xiàng)研究在ANCA相關(guān)血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)患者的腎組織中檢測(cè)到NETs，發(fā)現(xiàn)在髓過(guò)氧化物酶誘導(dǎo)下會(huì)觸發(fā)NETs進(jìn)程，并且發(fā)現(xiàn)在ANCA活動(dòng)期，NETs生成過(guò)度，且NETs水平與血清ANCA水平無(wú)關(guān)，說(shuō)明NETs水平升高與AAV活動(dòng)性相關(guān)，可更好的指導(dǎo)臨床用藥[20]，此外還有研究發(fā)現(xiàn)AAV患者和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者均具有過(guò)量的NETs形成，且這與疾病活動(dòng)程度相關(guān)，但是兩者的機(jī)制并不相同，AAV依賴(lài)于ANCA的IgG抗體，進(jìn)而誘導(dǎo)NETs形成，而SLE免疫復(fù)合物通過(guò)Fcγ受體信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)NETs形成，這說(shuō)明NETs在自身免疫性疾病中機(jī)制的多樣性，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探索[21]。這些研究均表明，在AAV等自身免疫性疾病的發(fā)病進(jìn)程中會(huì)誘導(dǎo)NETs形成，其可能作為一種生物標(biāo)志物來(lái)跟蹤疾病的進(jìn)展，為臨床用藥提供指導(dǎo)。

在我國(guó)一項(xiàng)針對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的研究中，發(fā)現(xiàn)RA患者的MPO-DNA復(fù)合物水平顯著高于健康對(duì)照組，其水平與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高以及類(lèi)風(fēng)濕因子和抗瓜氨酸化蛋白/肽抗體陽(yáng)性率有關(guān)，該研究還發(fā)現(xiàn)RA的活動(dòng)狀態(tài)與NETosis的增加有關(guān)，血清MPO-DNA水平可有效區(qū)分RA患者與健康人[22]。有研究還發(fā)現(xiàn)針對(duì)NETs的自身抗體有可能成為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的血清生物標(biāo)志物[23]。最新一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)NETs中存在的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶既可降解軟骨，又可刺激由成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞介導(dǎo)的下游炎癥反應(yīng)，因此，抑制NET形成或阻斷NET中存在的相關(guān)分子的作用途徑可能是RA及其相關(guān)器官損害的有用治療方法[24]。以上多個(gè)研究表明，NETs可能在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和活動(dòng)中發(fā)揮作用，相關(guān)抗體也為RA的診斷和治療提供參考依據(jù)，但需要更多機(jī)制性研究提供理論依據(jù)。

4.3 NETs與心腦血管疾病NETs與心腦血管疾病的研究也在進(jìn)行中，研究發(fā)現(xiàn)miR-146a通過(guò)調(diào)節(jié)NETs的生成，可用來(lái)預(yù)測(cè)心房顫動(dòng)患者的不良預(yù)后[25]。我國(guó)一項(xiàng)針對(duì)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張癥的研究發(fā)現(xiàn)，這些患者的外周血中性粒細(xì)胞在IL-1β和可溶性粘附分子的刺激下被激活，從而NETs升高[26]。另外，載脂蛋白E可通過(guò)ROS-MAPK-MSK1途徑調(diào)節(jié)NETs形成，在載脂蛋白E缺乏的小鼠模型中證實(shí)NETs過(guò)度生成可加劇小鼠急性心肌梗塞造成的損傷[27]。NETs同樣參與了缺血性腦梗死的進(jìn)程，當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血性腦梗死時(shí)，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在受損的腦細(xì)胞旁，可加劇炎癥，在高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)下，可促進(jìn)NETosis，在小鼠模型中使用NETosis抑制劑時(shí)，不僅延緩了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，而且顯著減輕了血管損傷[28]。以上研究表明NETs可能參與心腦血管疾病的發(fā)病及進(jìn)展，這為心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)和研究方向，NETs抑制劑可能成為治療心腦血管疾病的新藥物。

4.4 NETs與糖尿病近期，NETs在糖尿病中的研究也取得一定突破，高血糖可在中性粒細(xì)胞參與下誘發(fā)血管功能障礙，甚至加劇缺血性腦梗死所造成的損傷[29]。我國(guó)最新研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8通過(guò)調(diào)節(jié)“NLRP3炎性小體-NETs”軸加速糖尿病的傷口愈合[30]。NETs的形成可導(dǎo)致2型糖尿病小鼠模型的血管損傷[31]。2型糖尿病可能與高凝狀態(tài)和NETs增加有關(guān)[32]。此外，1型糖尿病患兒的NETs構(gòu)成與健康人不同，其外周血單核細(xì)胞中的T1D-NET復(fù)合物可誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，還發(fā)現(xiàn)NETs誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞活化可導(dǎo)致1型糖尿病的Th1極化，為治療1型糖尿病提供新靶點(diǎn)[33]。增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者中的中性粒細(xì)胞在無(wú)菌炎癥晚期的血管重構(gòu)中發(fā)揮其非常規(guī)的作用，衰老的脈管系統(tǒng)會(huì)分泌吸引中性粒細(xì)胞的物質(zhì)，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生NETs，最終清除病變的內(nèi)皮細(xì)胞，重構(gòu)不健康的血管，此研究亦為治療糖尿病相關(guān)視網(wǎng)膜病變開(kāi)辟新方向[34]。以上研究表明在糖尿病患者中，NETs的形成和增加會(huì)對(duì)機(jī)體血管和免疫系統(tǒng)造成不同的影響，這可能與疾病的發(fā)病機(jī)制差異以及NETs產(chǎn)生的數(shù)量有關(guān)，需要更進(jìn)一步的疾病機(jī)制研究以明確NETs在不同亞型糖尿病中的作用及影響，為疾病的治療提供幫助。

4.5 NETs與感染性疾病NETs最初被認(rèn)為是一種抗菌機(jī)制[5]，近期其在感染性疾病中的研究有了新發(fā)現(xiàn)，國(guó)外一項(xiàng)研究證實(shí)增強(qiáng)機(jī)體NETs的活性，使其更有效捕獲傳染性細(xì)菌，從而可最終改善膿毒癥的癥狀以及生存率[35]。而目前在全球大流行的新型冠狀病毒，NETs在其作用機(jī)制中發(fā)揮了不可替代的作用，研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，尤其是NETs的產(chǎn)生，會(huì)造成機(jī)體急性肺損傷、血栓形成等嚴(yán)重?fù)p害[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)破壞性的白細(xì)胞與COVID-19患者的病程更嚴(yán)重之間存在聯(lián)系[36]。最新研究則發(fā)現(xiàn)針對(duì)纖溶酶原和NETs相關(guān)的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抗蛋白酶治療可能有利于治療新冠肺炎[37]。這些研究表明NETs可能作為新冠肺炎治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，其在COVID-19中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié) 語(yǔ)

隨著研究的越來(lái)越深入，更多關(guān)于NETs的機(jī)制在不斷被揭示，其與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，參與了腫瘤、自身免疫性疾病、心腦血管疾病、糖尿病及感染性疾病等ID的疾病進(jìn)程，但具體機(jī)制仍有待探究?，F(xiàn)有研究表明，NETs參與了ID的發(fā)生和發(fā)展，其在疾病進(jìn)展中的產(chǎn)生和增加使其DNA和相關(guān)抗體有望成為一種有助于疾病診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，與NETs產(chǎn)生以及相互作用的相關(guān)分子及通路將可能成為ID的治療靶點(diǎn)。綜上所述，NETs在炎癥性疾病中具有重要作用，研究需更加深入，為早日攻克炎癥性疾病提供理論依據(jù)和轉(zhuǎn)化策略。