陳 琳， 李 衛(wèi)， 黃國秀， 韋曉英， 劉 賀， 龐 羽， 羅珍玉， 藍盈盈， 羅穎華

結(jié)腸癌是常見的消化道癌癥之一，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中位列第三[1]，目前化療是中晚期結(jié)腸癌的主要治療形式。奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)是第三代鉑類化療藥物，其毒副反應(yīng)輕、療效好，已廣泛用于大腸癌和胃癌等治療。然而，癌細胞耐藥性的產(chǎn)生顯著降低了OXA化療的療效[2]。黃連素(berberine,Ber)屬于異喹啉類生物堿，可用于治療癌癥和消化、代謝、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ber既可逆轉(zhuǎn)乳腺癌對多柔比星的耐藥性[4]，還可增強胃癌對5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)的敏感性[5]，提示Ber在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面具有重要的作用。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，添加Ber可以顯著降低OXA對THC-8307/OXA細胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，逆轉(zhuǎn)了癌細胞對OXA的耐藥性[6]。目前，關(guān)于Ber逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌對OXA耐藥性的機制研究報道較少，相關(guān)機制尚未明確。鑒此，本研究旨在探究Ber對人結(jié)腸癌耐OXA細胞(THC-8307/OXA細胞)耐藥性的影響及其逆轉(zhuǎn)機制，為Ber的臨床應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 THC-8307/OXA細胞(批號：WG102808)由中國科學(xué)院細胞庫提供。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Thermo Fisher公司。ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒購自北京Solarbio公司。OXA、Ber、鼠抗人P-gp(1∶1 000)抗體和鼠抗人GAPDH(1∶1 000)購自Sigma公司。兔單抗PI3K抗體(1∶1 000)、兔多抗p-AKT(1∶1 000)、兔單抗Akt抗體(1∶10 000)均購自Abcam公司。辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記羊抗鼠二抗和HRP標記羊抗兔二抗購于Santa Cruz公司?？俁NA提取試劑盒購自天根公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒購自Takara公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 THC-8307/OXA細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，同時細胞培養(yǎng)液中添加2.5 μg/ml OXA維持其耐藥性。分別添加不同劑量濃度的Ber干預(yù)細胞，依次分為Ber(5 μg/ml)+OXA組、Ber(10 μg/ml)+OXA組、Ber(20 μg/ml)+OXA組和OXA組，各組OXA終濃度均為20 μg/ml，同時設(shè)立對照組(細胞培養(yǎng)液僅含2.5 μg/ml OXA)。各組均于干預(yù)36 h后收集樣品進行檢測分析。

1.2.2 細胞形態(tài)學(xué)變化觀察 在干預(yù)結(jié)束后采用日本尼康公司Ti2倒置相差顯微鏡進行細胞形態(tài)學(xué)觀察并采集圖片。

1.2.3 MTT法檢測 取對數(shù)生長期的細胞以3.0×105cells/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將10% FBS的DMEM培養(yǎng)液換成含Ber和OXA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，按實驗分組，每組設(shè)置3復(fù)孔，并設(shè)置空白對照孔，干預(yù)36 h后棄上清，加入90 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液和10 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄上清，加入110 μl甲瓚(formazan)溶解液，于搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標儀于490 nm測各孔吸光值(A值)，結(jié)果取均值。細胞存活率=[(干預(yù)組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值)]×100%。

1.2.4 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測 各組細胞經(jīng)Ber和OXA干預(yù)后棄上清，滅菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2次，按總RNA提取試劑盒說明書進行總RNA提取，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行RT-qPCR檢測，各組均設(shè)置3個復(fù)孔。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，引物序列見表1，實驗重復(fù)3次，以2-△△Ct法計算其相對表達量。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測 應(yīng)用放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液提取細胞總蛋白，以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法進行蛋白定量，以30 μg總蛋白上樣量進行蛋白電泳，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶室溫封閉2 h，分別進行一抗孵育(4 ℃，過夜)，Tris-HCl緩沖鹽溶液和吐溫20(tris-buffered saline and tween 20,TBST)洗膜5次，5 min/次，分別孵育相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)熒光顯色。采用凝膠成像系統(tǒng)(上海天能，Tanon 5200)拍照，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.6 細胞凋亡檢測 消化細胞制備單細胞懸液，根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，用結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)節(jié)濃度為1×106cells/ml，取100 μl細胞懸液于流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC混勻，室溫避光孵育10 min，再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，最后加入400 μl PBS混勻后應(yīng)用流式細胞儀(美國BD Biosciences，BD FACSCantoTM Ⅱ)進行檢測分析。

2 結(jié)果

2.1OXA聯(lián)合Ber干預(yù)對THC-8307/OXA細胞形態(tài)的影響 顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，OXA組細胞的生長狀態(tài)和細胞形態(tài)無明顯變化。Ber+OXA組細胞生長被抑制，細胞貼壁不牢，體積變小伴核固縮，胞質(zhì)中黑色顆粒增加，培養(yǎng)基中細胞碎片增多，且隨Ber濃度升高，抑制作用越明顯。見圖1。

?對照組；?OXA組；?Ber(5 μg/ml)+OXA組；?Ber(10 μg/ml)+OXA組；?Ber(20 μg/ml)+OXA組圖1 顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)所見(×100)

2.2各組THC-8307/OXA細胞存活率比較 與對照組相比，Ber聯(lián)合OXA干預(yù)可顯著降低THC-8307/OXA細胞的存活率(P<0.05)，但OXA組細胞存活率與之比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與OXA組相比，Ber+OXA組細胞存活率顯著降低，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA組顯著低于Ber(5 μg/ml)+OXA組，Ber(20 μg/ml)+OXA組顯著低于Ber(10 μg/ml)+OXA組(P<0.05)。見表2。

表2 各組THC-8307/OXA細胞存活率比較

2.3各組THC-8307/OXA細胞凋亡率比較 與對照組比較，Ber聯(lián)合OXA干預(yù)細胞組的凋亡率均顯著升高(P<0.05)，但OXA組的細胞凋亡率與之比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與OXA組相比，各Ber+OXA組的細胞凋亡率顯著升高，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA組顯著高于Ber(5 μg/ml)+OXA組，Ber(20 μg/ml)+OXA組顯著高于Ber(10 μg/ml)+OXA組(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 各組THC-8307/OXA細胞凋亡率比較

2.4各組THC-8307/OXA細胞的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表達水平比較 與對照組相比，Ber聯(lián)合OXA干預(yù)細胞組的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，但OXA組的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表達水平與之比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與OXA組相比，各Ber+OXA組的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表達水平顯著降低，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA組顯著低于Ber(5 μg/ml)+OXA組，Ber(20 μg/ml)+OXA組顯著低于Ber(10 μg/ml)+OXA組(P<0.05)。見表4，圖3。

圖3 Western blot檢測THC-8307/OXA細胞P-gp蛋白的表達結(jié)果圖

表4 各組THC-8307/OXA細胞的MDR-1 mRNA和P-gp蛋白表達水平比較

2.5OXA聯(lián)合Ber對THC-8307/OXA細胞PI3K/Akt通路活化的影響 與對照組相比，Ber聯(lián)合OXA干預(yù)細胞組的PI3K、p-Akt蛋白表達水平及p-Akt/Akt值顯著降低(P<0.05)，但OXA組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與OXA組相比，各Ber+OXA組的PI3K、p-Akt蛋白表達水平及p-Akt/Akt值顯著降低，其中Ber(10、20 μg/ml)+OXA組顯著低于Ber(5 μg/ml)+OXA組，Ber(20 μg/ml)+OXA組顯著低于Ber(10 μg/ml)+OXA組(P<0.05)。各組Akt蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖4。

圖4 Western blot檢測THC-8307/OXA細胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白的表達結(jié)果圖

表5 各組THC-8307/OXA細胞的PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達水平及p-Akt/Akt值比較

3 討論

3.1OXA是繼順鉑(cis-platinum,DDP)、卡鉑(carboplatin,CBP)后第3代水溶性鉑類化合物，通過鉑原子與DNA共價結(jié)合損傷DNA，破壞DNA修復(fù)，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，目前廣泛應(yīng)用于胃癌、肝癌和結(jié)直腸癌等癌癥的治療[7]。腫瘤細胞耐藥常導(dǎo)致化療藥物胞內(nèi)濃度降低而不能有效致死癌細胞，增加化療失敗風(fēng)險。因此，尋找耐藥靶點和化療藥物的增敏劑，研究藥物逆轉(zhuǎn)機制對提高腫瘤細胞對化療藥物敏感性至關(guān)重要。

3.2Ber是一種異喹啉類生物堿，藥理作用廣泛，當(dāng)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時可輔助腫瘤治療[8]。有研究證實，Ber與DDP聯(lián)用，可通過激活caspase蛋白介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)細胞凋亡，增強DDP對卵巢癌的化療效果[9]，還可增強乳腺癌細胞MCF-7對DDP的敏感性[10]。另外，Ber還可通過下調(diào)p-STAT3和生存素(survivin)表達水平，提高5-Fu對胃癌的療效[5]。此外，本課題組的既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，通過20 μg/ml Ber對THC-8307/OXA細胞進行干預(yù)后可使OXA對細胞的IC50從3.019 μg/ml降低至0.148 μg/ml，提示Ber可顯著提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)耐藥。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過不同濃度Ber(5、10、20 μg/ml)的處理后，THC-8307/OXA細胞的細胞存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，且隨著Ber的濃度升高效應(yīng)增強，提示Ber能顯著提高結(jié)腸癌細胞THC-8307/OXA對OXA的敏感性，增強化療療效。

3.3耐藥機制的產(chǎn)生與膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的藥物外排、凋亡異常和調(diào)節(jié)細胞增殖的信號通路相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的耐藥機制與P-gp蛋白表達增高有關(guān)[11]。P-gp蛋白作為膜轉(zhuǎn)運蛋白的成員，是腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)依賴的藥物外排轉(zhuǎn)運體，由MDR-1基因編碼，可將多種化療藥物泵出胞外，增加藥物外排，降低藥物胞內(nèi)濃度，誘導(dǎo)腫瘤細胞耐藥性的發(fā)生。P-gp蛋白介導(dǎo)的MDR是導(dǎo)致腫瘤化療失敗率升高的重要原因之一，抑制P-gp蛋白表達或蛋白活性可以減弱腫瘤耐藥效應(yīng)[12]。有研究證實，下調(diào)P-gp蛋白表達可顯著增強人膠質(zhì)細胞瘤對替莫唑胺的敏感性[13]。伍奕等[14]的研究也顯示，在結(jié)腸癌細胞HCT-8/VCR中添加Ber抑制P-gp蛋白表達，逆轉(zhuǎn)了長春新堿(vincristine,VCR)的化療效果，提示Ber逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的機制與P-gp蛋白相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度Ber(5、10、20 μg/ml)聯(lián)合OXA處理THC-8307/OXA細胞后，MDR-1 mRNA和P-gp蛋白的表達均顯著下調(diào)，且表現(xiàn)出劑量依賴性，表明Ber可通過下調(diào)P-gp的表達，進而增強結(jié)腸癌細胞對OXA的敏感性。

3.4PI3K/Akt信號通路在腫瘤發(fā)生中具有重要作用，Akt磷酸化促使靶基因激活，參與癌細胞增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。而該通路異常激活也參與了卵巢癌、乳腺癌、肝癌以及結(jié)直腸癌等藥物抵抗的發(fā)生[15]。另外，PI3K/Akt通路還可調(diào)控P-gp蛋白的表達，其下游核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)可通過與MDR-1啟動子結(jié)合，啟動MDR-1基因轉(zhuǎn)錄。研究指出，抑制Akt磷酸化可以降低NF-κB磷酸化水平，進而抑制MDR-1基因轉(zhuǎn)錄，降低P-gp蛋白等ABC膜轉(zhuǎn)運蛋白表達水平，最終抑制P-gp蛋白介導(dǎo)的腫瘤耐藥機制[16]。Zhang等[17]的研究顯示，下調(diào)激肽釋放酶11(kallikrein 11,KLK11)可阻斷PI3K/Akt信號通路，逆轉(zhuǎn)HCT-8/OXA細胞對OXA的耐藥性。Yu等[18]的研究也提示，在HCT116/OXA細胞中，抑制PI3K/Akt通路可導(dǎo)致MDR-1 mRNA和P-gp蛋白的表達水平下調(diào)，從而逆轉(zhuǎn)HCT116/OXA細胞對OXA的耐藥性，表明抑制PI3K/Akt信號通路可有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對化療藥的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，不同濃度Ber(5、10、20 μg/ml)聯(lián)合OXA干預(yù)結(jié)腸癌細胞THC-8307/OXA后，PI3K、p-Akt蛋白表達水平和p-Akt/Akt值顯著降低，且Ber濃度越高下降越顯著，表明Ber可有效抑制結(jié)腸癌細胞中PI3K/Akt信號通路，進而逆轉(zhuǎn)THC-8307/OXA細胞對OXA的耐藥性。

綜上所述，Ber具有顯著的抗腫瘤活性，可逆轉(zhuǎn)THC-8307/OXA細胞對OXA的耐藥性，其機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路，下調(diào)P-gp蛋白表達有關(guān)，進一步提示Ber可作為一種有效的化療增敏劑以輔助結(jié)腸癌的化療，值得深入研究。