王 園，孫琳珺，程 穎，王 翔，劉陽泰，林玉海，董慶利,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品學(xué)院，上海 201514；3.荷美爾食品公司，上海 200436）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（以下簡稱單增李斯特菌）是一種兼性厭氧、無芽孢的革蘭氏陽性短桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境中，被世界衛(wèi)生組織列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一[1]。食物是單增李斯特菌傳播的主要載體，肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都是單增李斯特菌污染較高的食物[2]。攝入被單增李斯特菌污染的食物可使人患李斯特菌病，甚至引起疾病暴發(fā)，致死率高達(dá)20%～30%[3]。

生物膜是細(xì)菌在生長過程中為了適應(yīng)生存環(huán)境，分泌黏性胞外聚合物吸附于物質(zhì)表面，并增殖而形成的具有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體[4]。據(jù)調(diào)查，約80%的細(xì)菌感染均與生物膜的形成有關(guān)[5]，60%的食源性食物中毒暴發(fā)事件是由食源性致病菌生物膜引起[6]。單增李斯特菌可黏附在各種接觸物表面上并形成生物膜，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的持續(xù)污染。

細(xì)菌生物膜形成是一個動態(tài)演變過程，生物膜形成能力會因許多因素而變化。在食品加工儲藏過程中，微生物所處的環(huán)境復(fù)雜多變，諸多因素均會對生物膜的形成產(chǎn)生影響，生物膜的成熟也可能因環(huán)境條件而異[7]，例如短期的營養(yǎng)缺乏可增強(qiáng)單增李斯特菌的菌體黏附，而長期營養(yǎng)缺乏時則會阻礙生物膜成熟[8]。當(dāng)胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基中NaCl含量增加時，單增李斯特菌生物量顯著增加[9]。單增李斯特菌在惡劣環(huán)境中能長時間生存（持久性）也可能與生物膜的形成有關(guān)，形成生物膜可能是對脅迫環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)[10]。實際上，在食品加工及儲藏過程中，冷藏、高鹽度、干燥、酸處理以及消毒劑等處理使微生物長期處于脅迫環(huán)境下。環(huán)境脅迫是指在自然界或食品加工和保藏過程中，環(huán)境條件對微生物的生長和存在產(chǎn)生了一定程度的威脅和制約[11]。值得注意的是，經(jīng)各種處理后，生物膜仍可在設(shè)備表面殘留，并在環(huán)境適宜時脫落出細(xì)菌菌體，成為潛在污染源，進(jìn)一步造成交叉污染，引發(fā)嚴(yán)重的食品安全問題。環(huán)境條件對生物膜的影響極其復(fù)雜，不同的環(huán)境因子組合下形成的生物膜差異較大。此外，細(xì)菌暴露于脅迫條件下，可能提高其對其他脅迫條件的抗性[12]。生物膜的形成使細(xì)菌菌體對環(huán)境壓力的抵抗能力大大增強(qiáng)，常規(guī)方法難以清除生物膜，殘留的生物膜可發(fā)展形成新的生物膜，生物膜形成處成為交叉污染的中心，進(jìn)而對食品安全產(chǎn)生極大威脅。因此十分有必要研究不利條件下單增李斯特菌在設(shè)備表面附著和生物膜形成的情況。

本文針對不同脅迫條件對單增李斯特菌生物膜形成的影響進(jìn)行全面綜述，同時深入探討脅迫環(huán)境下生物膜的變化機(jī)制，并對未來的研究方向作出展望，有助于針對性地制定預(yù)防和控制生物膜的策略。

1 單增李斯特菌生物膜形成能力

不同分離源、不同譜系以及血清型的單增李斯特菌生物膜形成能力有所不同。根據(jù)遺傳指紋圖譜和致病潛力，單增李斯特菌可分為4 個不同的譜系。基于菌體/鞭毛抗原（O/H）血清學(xué)反應(yīng)，單增李斯特菌被分為13 種血清型，其中血清型1/2a、1/2b、1/2c和4b經(jīng)常分離于食品及患者標(biāo)本中。血清型或譜系與生物膜形成能力之間的關(guān)聯(lián)一直存在爭議。已報道的我國食源性單增李斯特菌中，1/2c血清型居多，且不同壓力條件下1/2c血清型生物膜形成能力強(qiáng)于其他血清型[13]，這可能是1/2c血清型在我國分離率較高的原因。1/2a和/或1/2c菌株（譜系II）的生物膜形成能力強(qiáng)于4b菌株（譜系I）[14-15]，然而Djordjevic等[16]研究發(fā)現(xiàn)譜系I菌株的生物膜形成能力強(qiáng)于譜系II。研究結(jié)果的差異性可能是由于菌株差異、研究條件以及培養(yǎng)介質(zhì)不同。Kadam等[17]研究了143 株不同血清型、不同分離源的單增李斯特菌生物膜的形成情況，結(jié)果顯示，血清型對生物膜的形成有顯著影響，而菌株的分離源對生物膜的形成水平?jīng)]有顯著影響。目前，評估生物膜表型的種內(nèi)多樣性的研究集中于將表型與菌株的譜系、血清型或來源相關(guān)聯(lián)，而這些評估方式可能無法反映生物膜形成的種內(nèi)多樣性。

基于特定基因型的研究，如多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）定義的基因型，可能揭示出與生物膜表型更緊密的聯(lián)系。近來，Maury等[18]發(fā)現(xiàn)低毒力型單增李斯特菌克隆CC121和CC9在亞致死濃度苯扎氯銨處理下的生物膜生成量更高；10 ℃下，CC26型菌株的生物膜形成能力明顯高于其他CC型，低溫能增強(qiáng)CC26菌株的生物膜形成能力，而CC7型的菌株在所有條件下均表現(xiàn)出較弱的生物膜形成能力[8]，這意味著某些基因型在特定條件下具有適應(yīng)性優(yōu)勢。MLST分型與生物膜形成能力和生物膜結(jié)構(gòu)相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

單增李斯特菌的生物膜形成能力具有較強(qiáng)的菌株特異性。Weiler等[19]研究表明單增李斯特菌生物膜的形成和附著與血清型無關(guān)，而是具有菌株特異性。純培養(yǎng)條件下，單增李斯特菌菌株之間生物膜形成能力差異很大[20]，且形成生物膜的結(jié)構(gòu)也因菌株而異。一些系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的菌株（包括相同基因型的分離株）之間生物膜形成能力存在較大差異，較小的遺傳變異可能會影響生物膜表型。有些菌株能更有效地附著在表面，而隨后不一定形成更多的生物膜，甚至相似來源的菌株也表現(xiàn)出不同的生物膜行為[21]。屬于同一脈沖電泳型的分離株生物膜形成能力不同，這表明生物膜形成能力取決于菌株[22]。而同一株單增李斯特菌在不同條件下的生物膜形成量顯著不同，表明菌株的表型變化可能取決于環(huán)境條件[23]。為更準(zhǔn)確地開展生物膜形成的種內(nèi)多樣性研究，應(yīng)充分掌握單增李斯特菌的種內(nèi)變異性和環(huán)境因素對種內(nèi)變異性影響的信息。

2 食品加工環(huán)境脅迫因子對單增李斯特菌生物膜形成的影響

單增李斯特菌生物膜的形成除受以上微生物內(nèi)在因素的影響，還受食品加工儲藏過程中冷藏、干燥、酸處理、消毒劑等環(huán)境因素的影響。

2.1 冷脅迫

冷脅迫包括0～12 ℃之間的冷脅迫和0 ℃以下的冷凍脅迫。4 ℃下單增李斯特菌可在3 h內(nèi)附著在食物接觸物表面[24]，并在24 h后形成稀疏細(xì)胞簇組成的生物膜[25]。研究表明單增李斯特菌在玻璃表面的生物膜形成顯著依賴于培養(yǎng)溫度和時間，4 ℃下單增李斯特菌在不銹鋼、玻璃表面均可形成生物膜，且隨著培養(yǎng)時間的延長，生物膜數(shù)量逐漸增加[26]。I?iguez-Moreno等[27]也得到了同樣的研究結(jié)果，9 ℃下單增李斯特菌數(shù)量在生物膜形成的過程中呈線性增長，細(xì)胞間相互作用形成復(fù)雜且高度結(jié)構(gòu)化的生物膜。然而，di Bonaventura等[25]研究表明，4、12 ℃下單增李斯特菌僅形成由稀疏細(xì)胞簇和少量胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的基礎(chǔ)生物膜結(jié)構(gòu)，可能是低溫下細(xì)菌存活率降低導(dǎo)致的。當(dāng)前研究主要比較了常見溫度范圍4～37 ℃對單增李斯特菌生物膜形成的影響，盡管研究結(jié)果存在爭議，但均表明單增李斯特菌可在低溫下存活并形成生物膜。

單增李斯特菌是一種嗜冷菌，不僅能在0～4 ℃的低溫環(huán)境下生存，甚至當(dāng)溫度低于0 ℃條件下仍可繁殖。研究表明冷應(yīng)激會導(dǎo)致單增李斯特菌對食品接觸表面的黏附力增強(qiáng)，增加了食品污染的幾率[28]。Miladi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過-20 ℃的冷凍脅迫后，單增李斯特菌的黏附能力增強(qiáng)，并能夠產(chǎn)生黏液。單增李斯特菌生物膜存在的時間與其低溫環(huán)境下的生長繁殖能力有關(guān)。低溫下單增李斯特菌仍可形成生物膜黏附在各種表面，降低各種殺菌清洗手段的效率，其可在食品工業(yè)設(shè)備和環(huán)境中持續(xù)存在數(shù)月甚至數(shù)年。

2.2 營養(yǎng)脅迫

饑餓生存被定義為“微生物在產(chǎn)能底物缺乏時的生存過程”[30]。在加工處理食品的過程中，通常會按照特定的程序?qū)κ称吩匣虍a(chǎn)品進(jìn)行數(shù)次清洗、消毒，使微生物暴露于消毒劑、脫水及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的條件下。

黏附是生物膜形成的第一步，Lee等[28]觀察到無論培養(yǎng)溫度如何，營養(yǎng)缺乏都會對單增李斯特菌的黏附產(chǎn)生積極影響，然而并未促進(jìn)生物膜的成熟，營養(yǎng)水平對不同階段生物膜的影響可能不同[30]。如細(xì)菌與基質(zhì)之間的疏水性和界面力等理化特性會影響細(xì)胞附著，且營養(yǎng)脅迫可能會引發(fā)細(xì)胞表面特性改變，從而導(dǎo)致黏附力增加。營養(yǎng)缺乏可能刺激單增李斯特菌和沙門氏菌形成生物膜[31-32]。Folsom等[33]研究了營養(yǎng)水平對不同菌株生物膜形成能力的影響，11 種菌株在TSB培養(yǎng)基和稀釋的TSB（diluted TSB，DTSB）培養(yǎng)基中具有相同的生物膜形成能力，14 種菌株在TSB培養(yǎng)基中比在DTSB培養(yǎng)基中形成更多的生物膜，5 種菌株在DTSB培養(yǎng)基中比在TSB培養(yǎng)基中形成更多生物膜，可見營養(yǎng)水平和菌株的交互作用對生物膜的形成有顯著影響。營養(yǎng)缺乏脅迫時，常觀察到細(xì)菌尺寸減小，同時細(xì)胞形狀從桿狀變?yōu)榍驙頪30]，這種形態(tài)上的收縮變圓可能增加細(xì)胞吸收營養(yǎng)的能力。實際上，細(xì)菌適應(yīng)惡劣環(huán)境的一種常見方法是其形態(tài)發(fā)生改變。

2.3 酸脅迫

食品加工過程中常形成低pH值環(huán)境，如使用酸性洗液和酸性食品添加劑等。單增李斯特菌生物膜形成能力也受pH值的影響，其疏水性和表面黏附力隨著環(huán)境pH值降低而增加[34]。然而Barbosa等[35]研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌1592/2暴露于酸性亞致死條件后，其在37 ℃條件下形成生物膜的能力下降。不同來源單增李斯特菌在pH 4.2、5.5、6.5下均可形成生物膜，然而隨著pH值的降低，生物膜的生成量逐漸減少[36]。研究表明短期弱酸脅迫可以增強(qiáng)腸炎沙門氏菌的附著力，而長期強(qiáng)酸脅迫能夠顯著降低細(xì)胞的附著力；與對照組相比，長期弱酸和強(qiáng)酸脅迫均顯著抑制了腸炎沙門氏菌生物膜的形成[37]。王嫻靜等[38]的研究表明，酸性條件對大腸桿菌O157:H7的生物膜形成過程具有抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)可通過細(xì)胞與環(huán)境pH值動態(tài)作用來解釋，當(dāng)環(huán)境pH值降低時導(dǎo)致膜質(zhì)子泵活性增加，從而將H+從細(xì)胞質(zhì)中排出，因此細(xì)胞內(nèi)能量消耗主要是用于避免內(nèi)部酸化，進(jìn)而降低黏附和生物膜形成過程中涉及的生理過程的速率。

通過MOSA求解面向廣義能耗的調(diào)度優(yōu)化問題的初始解，包括采用隨機(jī)方式選取子批量的加工批量、工藝路線、工序選擇的加工機(jī)床、刀具和搬運(yùn)設(shè)備，以及通過先到先服務(wù)(First Come First Served, FCFS)規(guī)則選取工序選擇的夾具和安排子批量在機(jī)床上的加工順序。根據(jù)上述方式生成調(diào)度方案的初始解R0，并通過廣義能耗和完工時間目標(biāo)函數(shù)計算柔性作業(yè)車間廣義能耗F1(R0)和完工時間F2(R0)。

值得關(guān)注的是，當(dāng)微生物暴露于酸性應(yīng)激條件之后其對該脅迫條件或其他脅迫條件的抗性會提高，從而導(dǎo)致“交叉保護(hù)”。酸適應(yīng)增強(qiáng)了單增李斯特菌對不銹鋼表面的附著能力，同時還能提高附著細(xì)胞對極端酸處理[39]和次氯酸鈉[40]的抵抗力。因此，在應(yīng)用酸性去污劑清除單增李斯特菌黏附體時應(yīng)考慮“脅迫強(qiáng)化”。

2.4 滲透脅迫

鹽是使用最廣泛的天然防腐劑，單增李斯特菌在許多食品中生存均必須克服由食鹽產(chǎn)生的滲透脅迫。單增李斯特菌能適應(yīng)周圍環(huán)境中水分活度的變化，NaCl能誘導(dǎo)生物膜的形成。在不同溫度[41]、不同培養(yǎng)基[42]條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充NaCl時，可促進(jìn)生物膜的形成，并導(dǎo)致單增李斯特菌聚集程度急劇增加。Lee等[28]的研究結(jié)果表明在營養(yǎng)豐富或營養(yǎng)缺乏條件下增加鹽濃度均能導(dǎo)致生物膜形成量顯著增加，表明鹽分添加和營養(yǎng)缺乏可促進(jìn)生物的膜形成，且營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏會增強(qiáng)氯化鈉對生物膜成熟的積極作用。而在Barbosa等[35]研究發(fā)現(xiàn)，5 株單增李斯特菌菌株在遭遇亞致死滲透壓脅迫后，生物膜形成能力沒有發(fā)生顯著變化，研究結(jié)果的不同可能是由于所使用的NaCl濃度差別以及所選擇的菌株差異性較大。

在高鹽條件下，單增李斯特菌的生物膜中細(xì)胞呈長鏈狀[43]。當(dāng)單增李斯特菌培養(yǎng)液中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于5%時，觀察到菌體細(xì)胞在較低水分活度脅迫下不能分裂，這些伸長的細(xì)胞實際上接近分裂狀態(tài)，當(dāng)轉(zhuǎn)移到更有利的條件下，就會分裂成單個細(xì)胞并開始生長[44]。對于食品加工環(huán)境中的滲透脅迫，單增李斯特菌已進(jìn)化出多種應(yīng)對機(jī)制，包括拉伸激活或由拉伸激活介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)和水由細(xì)胞膜通道流出，可避免在滲透脅迫下大量水流入細(xì)胞質(zhì)而引起的細(xì)胞裂解。

2.5 干燥脅迫

在食品工業(yè)中，在日常清潔消毒后常伴隨風(fēng)干處理，其目的是干燥食品表面，避免由于食品接觸表面水凝結(jié)導(dǎo)致微生物凝聚而引起污染。單增李斯特菌在可在相對濕度43%的條件下存活長達(dá)3 個月[45]，食鹽、有機(jī)物質(zhì)殘留和相對濕度的增加可提高單增李斯特菌在干燥條件下的存活率。生物膜可經(jīng)受一段時間的干燥并適應(yīng)周圍環(huán)境。

干燥對不同生長階段單增李斯特菌生物膜的影響不同。成熟生物膜細(xì)胞與未成熟生物膜細(xì)胞相比在干燥環(huán)境中的存活率顯著提高，且當(dāng)生物膜發(fā)育至一定階段后，進(jìn)一步成熟導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性增加并不會提高單增李斯特菌的存活率[43]。此外，單增李斯特菌的抗干燥性受遺傳因素的影響。對分離自水、食品和血液的不同單增李斯特菌生物膜形成能力及其干燥抗性進(jìn)行研究時，依據(jù)干燥后菌株生物膜的活菌數(shù)減少量，將菌株分為干燥敏感型菌株、中等敏感型菌株以及耐干燥菌株[46]。生物膜細(xì)胞干燥抗性的提高可能是通過細(xì)胞代謝、細(xì)胞膜組成改變、生物膜基質(zhì)的保護(hù)作用實現(xiàn)。

2.6 消毒劑脅迫

在食品加工環(huán)境中，不同的消毒劑，例如季銨化合物、過氧化氫、過氧乙酸和次氯酸鈉廣泛用于食品接觸表面清潔。生物膜對消毒劑抗性的評估是當(dāng)下研究者廣泛關(guān)注的熱點。

另一方面，消毒劑對細(xì)菌生物膜作用效果受其他環(huán)境因素的影響（表1）。Moorman等[50]研究了應(yīng)激處理后英諾克李斯特菌對季銨鹽消毒劑敏感性的變化，結(jié)果表明酸脅迫和饑餓脅迫提高了該菌的存活率，而熱脅迫和冷脅迫降低了其存活率。饑餓的單增李斯特菌對季銨鹽類消毒劑的敏感性降低[51]。饑餓脅迫使細(xì)胞膜的流動性和滲透性降低，增加了表面疏水性。細(xì)胞疏水性等表面特性與細(xì)胞黏附特性及生物膜的形成有密切關(guān)系。生物膜態(tài)的細(xì)胞對殺菌劑的響應(yīng)不僅與胞外多糖和周圍營養(yǎng)物質(zhì)的機(jī)械保護(hù)作用有關(guān)，同時與生物膜細(xì)胞對脅迫適應(yīng)性等內(nèi)在生理因素有關(guān)。Belessi等[52]發(fā)現(xiàn)低溫下形成的單增李斯特菌生物膜對過氧乙酸更敏感，Barroso等[53]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。然而Pang Xinyi等[54]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在4 ℃下培養(yǎng)14 d時產(chǎn)生的生物膜對消毒劑的抗性與15 ℃下無顯著差異，上述研究結(jié)果的差異可能是不同溫度下附著的細(xì)胞數(shù)量不同所引起的。然而目前消毒劑的功效通常取決于對理想條件下培養(yǎng)的浮游微生物的殺滅效果。因此，食品生產(chǎn)者在制定清潔消毒方案時，不僅需要構(gòu)建消毒劑對浮游細(xì)菌和相關(guān)生物膜清除的綜合控制方案，還應(yīng)充分考慮環(huán)境因素設(shè)定清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同條件下消毒劑對單增李斯特菌的作用效果Table 1 Effect of disinfectants on Listeria monocytogenes under different conditions

3 環(huán)境脅迫條件對單增李斯特菌生物膜形成影響的機(jī)制

細(xì)菌生物膜的抗脅迫機(jī)制不同于游離態(tài)細(xì)菌的抗脅迫機(jī)制。研究生物膜的形成機(jī)制須與其環(huán)境因子密切聯(lián)系起來，不同環(huán)境條件下生物膜形成的機(jī)制與途徑不相同[57]。單增李斯特菌生物膜的形成是一個復(fù)雜的過程，為了適應(yīng)外界環(huán)境變化，單增李斯特菌可通過膜流動性改變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控、鞭毛及胞外分泌物合成等途徑使其在不利條件下仍可存活。當(dāng)微生物應(yīng)對不良或壓力條件時，多種遺傳和生理機(jī)制改變。

3.1 膜流動性相關(guān)的適應(yīng)機(jī)制

當(dāng)微生物暴露于各種環(huán)境壓力時，包括細(xì)胞膜流動性、細(xì)胞疏水性在內(nèi)的細(xì)胞表面特性會發(fā)生改變。細(xì)胞膜流動性在營養(yǎng)運(yùn)輸、細(xì)胞形態(tài)、抵御外部不利環(huán)境侵害等多種細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要作用。此外，細(xì)胞膜流動性與其適應(yīng)各種環(huán)境壓力密切相關(guān)[58]，細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層流動性主要通過調(diào)節(jié)膜脂肪酸組成來改變。在不利環(huán)境下，革蘭氏陰性菌主要通過調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例、環(huán)丙烷脂肪酸合成或通過順/反異構(gòu)化來改變其膜流動性；革蘭氏陽性菌通過改變脂肪?；滈L度或形成支鏈脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFAs）、改變不飽和/飽和脂肪酸比例來改變其膜流動性[59]。在不利條件下微生物能夠通過膜流動性相關(guān)的適應(yīng)性策略繼續(xù)生存。

單增李斯特菌細(xì)胞膜由不常見的脂肪酸組成，尤其支鏈脂肪酸的比例較高[60]。當(dāng)單增李斯特菌在低于10 ℃下生長時，細(xì)胞中的反異-支鏈脂肪酸（anteiso-BCFAs）尤其是anteiso-C15:0含量增加，從而保證適當(dāng)?shù)哪ち鲃有訹61]。同樣，在堿性條件下，主要是由于BCFAs含量增加導(dǎo)致膜流動性提高，從而有助于菌體存活。相反，在酸性條件下，BCFAs含量下降，膜流動性降低，從而產(chǎn)生對酸脅迫的抗性[62]。而當(dāng)病原體反復(fù)暴露于亞致死水平的消毒劑時，膜脂肪酸中飽和脂肪酸含量增加，使膜的流動性下降，導(dǎo)致單增李斯特菌在消毒劑存在時得以生長[63]，盡管流動性降低會減少初始表面附著量，但在后期仍有較多生物膜形成。最新研究表明，生物膜內(nèi)細(xì)胞的脂肪酸含量與浮游細(xì)胞的脂肪酸含量不同，生物膜細(xì)胞中飽和脂肪酸含量比浮游細(xì)胞高，而BCFAs含量明顯低于浮游細(xì)胞，從而導(dǎo)致更高的相變溫度、堆積密度和雙層穩(wěn)定性[64]。生物膜的這些生理變化使其能適應(yīng)各種應(yīng)激條件，從而提高細(xì)菌存活率和對抗菌藥物的抵抗力。

3.2 生物膜相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制

分泌蛋白作為連接細(xì)胞與周圍環(huán)境的功能決定因子，可參與單增李斯特菌在非生物和生物表面的定植過程。Combrouse等[65]定量分析了單增李斯特菌生物膜胞外成分，發(fā)現(xiàn)胞外物質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量最高。采用蛋白酶處理生物膜能夠抑制生物膜的發(fā)育或誘導(dǎo)細(xì)胞的擴(kuò)散[66-67]，表明蛋白質(zhì)在生物膜發(fā)育和維持中具有重要作用。

生物膜內(nèi)部蛋白——內(nèi)化素A（internalin A，InlA）和生物膜相關(guān)蛋白L（biofilm-associated protein L，BapL）都是細(xì)胞外基質(zhì)的一部分[68]。InlA是細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，也是參與宿主細(xì)胞黏附和侵襲的主要成分之一。一些單增李斯特菌菌株分泌截短的非功能形式的InlA。與表達(dá)全長InlA的菌株相比，表達(dá)截短InlA的菌株生物膜形成能力顯著增強(qiáng)[68]。這種截短的分子完全釋放在細(xì)胞外介質(zhì)中，可能成為生物膜基質(zhì)的一部分。生物膜相關(guān)蛋白Bap在金黃色葡萄球菌的生物膜形成中具有重要作用，BapL是一種細(xì)胞壁錨定蛋白，與Bap相似，可促進(jìn)一些單增李斯特菌菌株的黏附，參與其生物膜形成過程[69]。BapL可促進(jìn)某些單增李斯特菌的附著，但其在生物膜形成過程中的作用尚未明確。最近又發(fā)現(xiàn)了一類內(nèi)部蛋白——內(nèi)化素L（internalin L，InlL）參與了單增李斯特菌EGD-e的初始細(xì)菌黏附和固著發(fā)育[70]。考慮到生物膜形成受多因素影響，當(dāng)對編碼結(jié)構(gòu)蛋白的單個基因進(jìn)行突變時，通?？梢鹨欢ǖ谋硇妥兓虼?，在對單增李斯特菌中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)生物膜形成的基因決定簇的特性分析仍然是一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。

3.3 基于基因調(diào)控表達(dá)的機(jī)制

單增李斯特菌的環(huán)境適應(yīng)能力依賴于其具有的環(huán)境適應(yīng)因子和環(huán)境適應(yīng)調(diào)節(jié)因子[71]。表2總結(jié)了單增李斯特菌生物膜形成過程中相關(guān)功能基因。

表2 單增李斯特菌生物膜形成過程中相關(guān)功能基因/蛋白Table 2 Functional genes/proteins related to the formation of Listeria monocytogenes biofilm

在單增李斯特菌中已鑒定出許多對應(yīng)激反應(yīng)和毒力基因調(diào)控很重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如SigB、HrcA、PrfA等。已有研究表明在單增李斯特菌中，SigB介導(dǎo)特定基因的表達(dá)，使其能在低pH值、氧化、乙醇、高滲透壓、高溫、低溫等環(huán)境脅迫壓力下生存[81]。Becker等[82]研究表明轉(zhuǎn)錄因子SigB參與了單增李斯特菌在低溫環(huán)境下的適應(yīng)過程。研究表明在相同的培養(yǎng)條件下，sigB缺失菌株生物膜的形成能力低于EGD株，添加0.3%膽汁酸鹽可以在一定程度上促進(jìn)EGD株生物被膜形成，而使sigB缺失菌株生物被膜形成能力略有降低[72]。應(yīng)激反應(yīng)基因ltrC也參與了單增李斯特菌在低溫下的生長和適應(yīng)過程，ltrC受SigB調(diào)控，其在1/2a血清型的單增李斯特菌中轉(zhuǎn)錄水平高于ΔsigB突變株[73]。低溫等脅迫因素可誘導(dǎo)SigB產(chǎn)生活性。SigB在單增李斯特菌環(huán)境適應(yīng)和生物膜形成過程中具有重要作用。

SigB正調(diào)控II類應(yīng)激反應(yīng)基因，而HrcA負(fù)調(diào)控I類應(yīng)激反應(yīng)基因[83]。hrcA及dnaK對于單增李斯特菌靜態(tài)生物膜形成以及消毒劑抗性具有重要作用[74]，與野生型菌株相比，ΔhrcA突變株生物膜形成量增加，提示此突變體中I類熱休克反應(yīng)的激活對靜態(tài)生物膜的形成有利。

此外，細(xì)菌的毒力和環(huán)境適應(yīng)能力密切相關(guān)。SigB對眾多的毒力因子具有調(diào)節(jié)作用，并且與重要的毒力調(diào)節(jié)因子PrfA關(guān)系密切[84]。研究表明ΔprfA突變菌株的生物膜形成能力變?nèi)鮗75]，表明毒力調(diào)節(jié)因子PrfA對單增李斯特菌生物膜的形成具有促進(jìn)作用。prfA及受其控制的其他毒力基因，如hly、mpl、plcA、plcB和actA等在37 ℃條件下轉(zhuǎn)錄更加高效[76]。然而，prfA也可在低溫下轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子PrfA可以根據(jù)生長溫度在活性和非活性之間切換[85]。溶血素基因hly是單增李斯特菌所必需的毒力基因，其在7 ℃和37 ℃下培養(yǎng)的不同血清型單增李斯特菌中均可很好地轉(zhuǎn)錄[86]。sigB和prfA會根據(jù)環(huán)境條件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其活性受pH值、溫度和細(xì)菌生長條件的影響。

鞭毛對單增李斯特菌的初始黏附具有重要作用。參與單增李斯特菌附著的主要基因包括鞭毛合成和運(yùn)動相關(guān)的基因flaA、fliP、fliG、flgE、motA、motB和mogR[87]。一旦細(xì)菌細(xì)胞附著后，生物膜的進(jìn)一步成熟需要依靠細(xì)菌細(xì)胞之間的群體感應(yīng)效應(yīng)。有兩部分系統(tǒng)參與細(xì)菌的群體感應(yīng)和生物膜形成的調(diào)控[88]，一部分為多效響應(yīng)調(diào)節(jié)因子DegU，可以調(diào)節(jié)單增李斯特菌生物膜的形成。單增李斯特菌鞭毛合成及細(xì)菌運(yùn)動性都受到DegU的調(diào)控，DegU可以使細(xì)菌在高溫下黏附于塑料表面生長繁殖并形成生物膜[78]，此外，DegU與單增李斯特菌致病性、耐藥性以及持久性有關(guān)；另一部分為依賴Agr調(diào)節(jié)的群體感應(yīng)系統(tǒng)，其在單增李斯特菌生物膜的發(fā)展過程中也起關(guān)鍵作用[89]。Agr操縱子可以調(diào)控毒力因子的表達(dá)，正向調(diào)控單增李斯特菌生物被膜的形成，并參與早期生物膜形成的黏附過程。與野生菌株相比，ΔagrA和ΔagrD突變菌株在聚苯乙烯表面上形成生物被膜的能力明顯降低[79]。Agr可以直接調(diào)控單增李斯特菌生物膜形成，還可通過調(diào)控單增李斯特菌毒力因子的表達(dá)間接調(diào)控生物膜的形成。

EPS包括蛋白質(zhì)、多糖及核酸等物質(zhì)，是生物膜的主要組成成分，在生物膜形成過程中EPS參與細(xì)菌的黏附過程，其形成量和性質(zhì)與生物膜結(jié)構(gòu)有重要的關(guān)系[90]。磷壁酸是李斯特菌生物膜基質(zhì)的主要成分。革蘭氏陽性菌的dlt操縱子包括dltA、dltB、dltC、dltD4 個基因，它們催化D-丙氨酸殘基并入細(xì)胞外脂磷壁酸[91]。研究表明dltA、dltB、dltC、dltD和phoPR突變體的生物膜形成能力降低，脂磷壁酸的D-丙氨酸化作用的喪失會改變細(xì)菌細(xì)胞表面電荷，減少單增李斯特菌的附著和生物膜形成[80]。環(huán)境中營養(yǎng)缺乏時，低濃度的無機(jī)磷酸鹽信號可被雙組分系統(tǒng)phoPR感應(yīng)，從而調(diào)節(jié)生物膜形成。

綜上所述，以往的研究多集中在與單增李斯特菌生物膜形成有關(guān)的已知功能的單個或多個基因上。然而，功能未知基因通常代表生物膜中30%～50%的差異表達(dá)基因[92]，而與生物膜相關(guān)的全新功能基因的解析仍較少。Stanley等[93]研究發(fā)現(xiàn)生物膜和浮游培養(yǎng)物中55%以上差異表達(dá)基因僅在一個時間點表達(dá)。上述機(jī)制突出了參與生物膜細(xì)胞形成因素的多樣性。總而言之，微生物在壓力條件下能夠激活多種遺傳機(jī)制，使其可在不利環(huán)境中保持活力和致病性。

4 結(jié) 語

單增李斯特菌可在脅迫條件下形成生物膜黏附于物體表面，抵抗不利環(huán)境，從而引起食品持續(xù)污染。單增李斯特菌生物膜的形成受菌體自身和外界環(huán)境因素的雙重影響。然而隨著對脅迫反應(yīng)逐漸深入了解，發(fā)現(xiàn)其具有復(fù)雜性，因此，研究各種條件下單增李斯特菌生物膜的形成和變化機(jī)制對于食品加工中微生物的安全控制具有重要意義，將來可從以下3 個方面開展。

第一，從整個系統(tǒng)的角度開展分析單增李斯特菌與共存微生物間相互作用對菌群動態(tài)及脅迫耐受性影響的研究。食品加工環(huán)境影響食品相關(guān)的微生物群落組成，在真實環(huán)境條件下，單增李斯特菌往往以多菌株狀態(tài)形成混合生物膜，僅研究某一種菌在脅迫條件下的變化不能真實地反映其在食品加工環(huán)境中所處狀態(tài)。

第二，在了解生物膜空間復(fù)雜性的同時，對生物膜內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的動態(tài)維度研究有助于揭示生物膜形成及變化的真實規(guī)律。對功能未知基因以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的動態(tài)變化進(jìn)行研究將有助于破譯生物膜形成的復(fù)雜機(jī)制。

第三，多重脅迫通常發(fā)生在食品加工和儲藏過程中，例如低pH值和高鹽濃度的處理組合，充分研究各種脅迫在時空上的綜合效應(yīng)，設(shè)計更為嚴(yán)格的綜合控制方案將是未來控制單增李斯特菌污染的主要研究方向。此外，開發(fā)環(huán)境友好型抗菌方法，包括利用酶溶液、噬菌體或微生物分泌的抗菌化合物來進(jìn)行微生物控制，仍然是一個有吸引力的挑戰(zhàn)。對脅迫反應(yīng)的研究有助于全面了解微生物生理活性以及開發(fā)新的抗微生物制劑和制定新的食品安全措施。