薛素琳，南米娜，龔 迪，王 斌，姜 紅，Dov PRUSKY,3，畢 陽,*，薛華麗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅 蘭州 730070；3.以色列農(nóng)業(yè)研究組織農(nóng)產(chǎn)品采后科學部，以色列 里雄萊錫安 7505101）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是主要的采后病原真菌[1]，不僅侵染杏[2]、甜瓜[3]和番茄[4]等多種果蔬，引起品質劣變，而且還會在果實體內(nèi)積累單端孢霉烯族毒素，造成潛在的安全隱患[5]。該病原菌主要經(jīng)由果實表面的傷口和自然孔口侵染[6]，通過堿化果實傷口環(huán)境激活胞外酶致病[7]。有報道表明，果蔬的呼吸代謝在病原菌侵染過程中具有重要作用[8]。三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)是重要的呼吸代謝途徑，在提供能量、還原力以及碳骨架方面具有核心作用[9]，磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是另一條重要的呼吸代謝途徑，除了提供還原力外，還是核苷酸、芳香族氨基酸、苯丙烷及其衍生物碳骨架的重要來源[10]。Zhang Shen等發(fā)現(xiàn)，焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）侵染激活了龍眼果實的TCA循環(huán)，導致還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）顯著積累，而PPP受到抑制，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）含量減少[11]；在擬莖點霉菌（Phomopsis longanae）侵染龍眼果實期間也觀察到類似的現(xiàn)象[12]。也有報道表明，灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染活化了蘋果果實的PPP，促進了NADPH的合成[13]。同樣，擴展青霉（Penicillium expansum）侵染蘋果果實后激活了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH），促進了NADPH合成[14]。盡管已有不同病原真菌侵染增強果實TCA循環(huán)和PPP的報道，但T. roseum侵染厚皮甜瓜后，果實TCA循環(huán)和PPP如何發(fā)生變化及其在不同侵染階段的差異鮮見報道。因此，本實驗用T. roseum接種厚皮甜瓜果實，觀察常溫條件下果實病斑直徑的變化，測定侵染期間果實病健交界處組織TCA循環(huán)和PPP關鍵酶活力以及中間產(chǎn)物含量的變化，分析不同侵染階段的差異，以期為揭示TCA循環(huán)和PPP在病原菌侵染果實中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘玉金香’厚皮甜瓜，于2017年6月14日（花后35 d）采自甘肅省蘭州市皋蘭縣什川鎮(zhèn)泥灣村。單果套發(fā)泡網(wǎng)袋后入包裝箱（30 個/箱），當天運抵實驗室，于（22±2）℃、相對濕度55%～60%下貯藏待用。

T. roseum為本實驗室保存菌種。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）美國西格瑪公司；植物NAD激酶（NAD kinase，NADK）、植物核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate，Ru5P）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海杏宜生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司；3K30型高速冷凍離心機 北京東訊天地醫(yī)療儀器有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡 日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-30085H-II型恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實損傷接種

孢子懸浮液的制備參考Bi Yang等[15]的方法。取25 ℃下培養(yǎng)7 d含有T. roseum的PDA培養(yǎng)基，加入含體積分數(shù)0.05% Tween 20的無菌水約10 mL，用玻璃棒刮下PDA培養(yǎng)基上的T. roseum孢子，然后轉入50 mL三角瓶中，在漩渦混合器上振蕩15 s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數(shù)板計數(shù)算出孢子懸浮液的濃度，用無菌水稀釋至1×106spores/mL。

果實損傷接種參考Bi Yang等[15]的方法并修改。果實先用自來水沖洗干凈，然后用體積分數(shù)2%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來水沖洗后常溫（22±2）℃下晾干。用體積分數(shù)70%乙醇溶液對果實接種點進行表面消毒后，用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實赤道部位均勻打孔4 個（深3 mm）?？變?nèi)分別接入20 μL上述孢子懸浮液，以無菌水接種作對照組，晾干后于常溫下貯藏。分別在接種后0、12、24、48 h和72 h測量病斑直徑。每處理每一時間點用果實8 個，重復3 次。

1.3.2 生化指標測定取樣

參照Lü Liang等[16]的方法，分別于接種后0、12、24、48 h和72 h用直徑為10 mm的打孔器距離病斑邊緣1 cm內(nèi)打孔，切取皮下2～5 mm處果肉組織3 g，鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于測定生化指標。

1.3.3 相關代謝酶活力測定

1.3.3.1 異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活力測定

參考Tang Mi等[17]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L抗壞血酸、體積分數(shù)0.1% Triton X-100，pH 8.2）研磨。在4 ℃下勻漿，10 000 r/min離心30 min，上清液為粗酶液。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）活力測定反應體系：0.3 mL粗酶液、0.5 mL反應液（40 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.8 mmol/L NAD、0.2 mmol/L MnSO4，pH 8.2）、0.2 mL 2 mmol/L異檸檬酸鈉，混合后于340 nm波長處測定吸光度，以每克鮮組織每分鐘消耗1 mmol NAD表示1 個IDH活力，單位為mmol/（min·g）。

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）活力測定反應體系：0.3 mL粗酶液、0.5 mL反應液（40 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、0.8 mmol/L NAD、0.2 mmol/L MnSO4，pH 8.2）、0.2 mL 2 mmol/L蘋果酸鈉溶液，混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘消耗1 mmol NAD表示1 個MDH活力，單位為mmol/（min·g）。

1.3.3.2 NADK活力測定

參照植物NADK酶聯(lián)免疫分析試劑盒的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）研磨。在4 ℃下勻漿3 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶液。NADK活力測定反應體系：40 μL樣品稀釋液（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、體積分數(shù)0.5%牛血清白蛋白溶液，pH 7.2）、10 μL粗酶液、100 μL酶標試劑。37 ℃溫育60 min，棄去液體，洗滌液清洗5 次，甩干后加入50 μL顯色劑A、50 μL顯色劑B混合，37 ℃避光15 min，加入50 μL終止液終止反應，于450 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADP表示1 個NADK活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.3.3 G6PDH和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活力測定

參考Mateos等[18]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL預冷的提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 乙二胺四乙酸、1 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮，pH 8.0），在4 ℃條件下浸提20 min，勻漿液在10 000 r/min下離心20 min，上清液為粗酶液。

G6PDH活力測定反應體系：150 μL粗酶液、850 μL反應液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、3 mmol/L NADP、3 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P），pH 8.0），混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH表示1 個G6PDH活力，單位為nmol/（min·g）。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehy drogenase，6PGDH）活力測定反應體系：150 μL粗酶液、850 μL反應液（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、3 mmol/L NADP、3 mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate，6PG），pH 8.0），混合后于340 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH表示1 個6PGDH活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.3.4 核糖-5-磷酸異構酶活力測定

參考Xiong Yuqing等[19]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 7.4）研磨。在4 ℃下勻漿10 000 r/min離心5 min，上清液為粗酶液。核糖-5-磷酸異構酶（ribose-5-phosphate isomerase，RPI）活力測定反應體系包括0.1 mL粗酶液、0.3 mL提取緩沖液、0.1 mL 30 mmol/L核糖-5-磷酸，將試管短暫搖動并在室溫下放置5～15 min。后依次加入0.5 mL 30 mmol/ L半胱氨酸，2 mL體積分數(shù)75%硫酸溶液和0.2 mL體積分數(shù)0.1%咔唑溶液，37 ℃下水浴30 min后，再在冰水中冷卻2 min，540 nm波長處測定吸光度。以每克鮮組織每分鐘消耗1 nmol核糖-5-磷酸表示1 個RPI活力，單位為nmol/（min·g）。

1.3.4 相關代謝產(chǎn)物含量測定

1.3.4.1 G6P和Ru5P含量的測定

G6P含量測定參考Elisa等[20]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL提取緩沖液（0.2 mol/L Tris-HCl、體積分數(shù)0.05% Triton X-100，pH 7.5）研磨，在4 ℃條件下浸提10 min，10 000 r/min離心10 min，上清液為待測液。G6P含量測定反應體系：1 mL待測液、20 μL 30 mmol/L NADP、20 μL 0.5 mol/L MgCl2、10 μL 700 U/mL G6PDH，混合后于340 nm波長處測定吸光度。G6P含量單位為ng/g，結果以鮮質量計。

核酮糖-5-磷酸（ribulose-5-phosphate，Ru5P）含量通過酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定。取3 g冷凍組織，加入5 mL生理鹽水研磨，在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，上清液為待測液。設置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加不同質量濃度（50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mL）的50 μL標準品，樣品孔加入10 μL待測液、40 μL樣本稀釋液（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、體積分數(shù)0.5%牛血清白蛋白，pH 7.2）。標準品孔和樣品孔再加入100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體混合，37 ℃水浴鍋溫育60 min，棄去液體，加入洗滌液，靜置1 min，棄去洗滌液，如此重復5 次，加入試劑盒自帶底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入50 μL終止液，混合后15 min內(nèi)在450 nm波長處測定吸光度。Ru5P含量單位為ng/g，結果以鮮質量計。

1.3.4.2 NAD（H）和NADP（H）含量的測定

參考顧采琴等[21]的方法。取3 g冷凍組織，加入6 mL 0.1 mol/L HCl（對應NAD和NADP）或NaOH（對應NADH和NADPH）溶液研磨，在4 ℃條件下浸提10 min，10 000 r/min離心20 min，將上清液移至離心管中，用0.1 mol/L的NaOH（HCl）溶液調(diào)pH值至7.0，再在4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min，上清液為待測液。

NAD（H）和NADP（H）含量測定反應體系：待測液150 μL、200 μL混合液（含1 mol/L Tricine-NaH、40 mmol/L乙二胺四乙酸、4.2 mmol/L噻唑藍、16.6 mmol/L吩嗪硫酸甲酯、25 mmol/L G6P）、150 μL 100 mmol/L NaCl，混合后37 ℃水浴5 min，取出后進行冰浴，加入100 μL G6PDH（對應NADP和NADPH）（乙醇脫氫酶（對應NAD和NADH）），再在37 ℃水浴40 min，最終加入200 μL 6 mol/L NaCl溶液終止反應，于570 nm波長處測定吸光度。NAD（H）和NADP（H）含量單位均為μmol/g，結果以鮮質量計。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

上述各項測定至少重復3 次。全部數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件計算平均值和標準誤，并用SPSS 19.0軟件進行Duncan’s多重差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 接種T. roseum后厚皮甜瓜果實病斑直徑的變化

病斑直徑增大是果實感病的直接表現(xiàn)。由圖1可知，接種果實在接種后24 h內(nèi)病斑直徑無明顯變化，接種后48 h接種果實與對照組病斑直徑均增大，接種后72 h果實病斑直徑顯著高于對照組（P＜0.05），是對照組的1.71 倍（圖1）。

2.2 T. roseum接種對果實IDH、MDH、G6PDH和6PGDH活力的影響

IDH和MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶，分別催化異檸檬酸和蘋果酸生成α-酮戊二酸和草酰乙酸，同時合成NADH[22]。接種果實和對照組果實的IDH活力在接種后12 h迅速降低。接種果實的IDH活力之后緩慢上升，至48 h時達到峰值；對照組果實IDH活力在12 h后基本不變。接種果實的IDH活力在12 h時顯著低于對照組，但在24 h后顯著高于對照組（P＜0.05），48 h時是對照組的1.63 倍（圖2A）。接種果實的MDH活力在接種后呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，對照組果實則是先迅速降低后緩慢升高。接種果實的MDH活力始終高于對照組（P＜0.05），在12 h和24 h時分別是同期對照組的2.72 倍和2.14 倍（圖2B）。

G6PDH和6PGDH是PPP的關鍵酶，分別催化G6P和6PG生成6-磷酸葡萄糖酸酯和Ru5P，同時調(diào)控NADP生成大量的NADPH以作為供氫體參與多種代謝反應[10]。接種果實和對照組果實的G6PDH活力在接種后24 h內(nèi)相對平穩(wěn)，接種果實的G6PDH活力顯著高于對照組；24 h后接種果實的G6PDH活力迅速增加，在48 h和72 h時分別是同期對照組的1.83 倍和1.71 倍（P＜0.05）（圖2C）。接種果實和對照組果實的6PGDH活力在接種后迅速下降，接種果實的6PGDH活力在接種后24 h內(nèi)顯著低于對照組（P＜0.05）；但接種果實的6PGDH活力在接種24 h后迅速升高，48 h和72 h時分別是同期對照組的2.51 倍和2.98 倍（圖2D）。

圖2 T. roseum接種對果實IDH（A）、MDH（B）、G6PDH（C）和6PGDH（D）活力的影響Fig. 2 Effect of inoculation with T. roseum on the activity of IDH (A),MDH (B), G6PDH (C) and 6PGDH (D) in muskmelon fruit

2.3 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實NAD（H）和NADP（H）含量的影響

NAD（H）和NADP（H）在能量形成和維持細胞的氧化還原平衡中具有核心作用[23]。在貯藏過程中，接種果實的NAD和NADH含量均先升高后降低，對照組果實這兩種物質含量逐步升高，且接種果實的NAD和NADH含量總體顯著高于對照組（P＜0.05），在24 h時分別高出對照組50.37%和50.31%（圖3A、B）。接種果實的NADP含量接種后48 h內(nèi)基本穩(wěn)定，但顯著低于對照組（P＜0.05）；接種果實的NADP含量在48 h后含量迅速增加，在72 h時與對照組果實相比無顯著差異；對照組果實的NADP含量逐漸升高，接種果實的NADPH含量在48 h內(nèi)緩慢增加，且顯著低于對照組，48 h后迅速增加，且在72 h時顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3C、D）。

圖3 T. roseum接種對果實NAD（A）、NADH（B）、NADP（C）和NADPH（D）含量的影響Fig. 3 Effect of inoculation with T. roseum on the contents of NAD (A),NADH (B), NADP (C) and NADPH (D) in fruits

2.4 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實G6P和Ru5P含量的影響

G6P和Ru5P是PPP的重要中間產(chǎn)物，G6PDH催化G6P生成6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，6PGDH催化6PG而產(chǎn)生Ru5P，這兩個反應過程均伴有NADPH合成[24]。接種后果實的G6P含量呈現(xiàn)先略升高后降低再升高的趨勢，雖然12 h和72 h時接種果實G6P含量高于對照組果實，但24 h和48 h時卻顯著低于對照組（P＜0.05）（圖4A）。接種果實和對照組果實的Ru5P含量在接種后48 h內(nèi)逐漸降低，且接種果實的Ru5P含量顯著低于對照組；接種果實Ru5P含量在接種48 h后有所升高，且在72 h時與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）（圖4B）；說明接種顯著降低了早中期果實Ru5P含量。

圖4 T. roseum接種對果實G6P（A）和Ru5P（B）含量的影響Fig. 4 Effect of inoculation with T. roseum on the contents of G6P (A)and Ru5P (B) in muskmelon fruit

2.5 T. roseum接種對厚皮甜瓜果實NADK和RPI活力的影響

NADK通過催化NAD（H）與ATP或無機多聚磷酸提供的磷?；蒒ADP（H），維持生物體內(nèi)的氧化還原平衡，保護組織免受氧化損傷[25]。接種果實的NADK活力在貯藏過程中先升高后降低，在48 h內(nèi)顯著高于對照組（P＜0.05），12 h時是對照組的1.17 倍（圖5A）。接種果實和對照組果實的RPI活力均呈先升高后降低的趨勢，接種果實在48 h內(nèi)顯著低于對照組；48 h后接種果實的RPI活力有所上升，在72 h時與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）（圖5B）；說明接種顯著降低了早中期果實RPI活力。

圖5 T. roseum接種對果實NADK（A）和RPI（B）活力的影響Fig. 5 Effect of inoculation with T. roseum on the activity of NADK (A)and RPI (B) in muskmelon fruit

3 討 論

呼吸代謝增強是病原真菌侵染植物后的典型反應[11]。但不同的呼吸途徑在不同的侵染階段表現(xiàn)各異，L. theobromae侵染龍眼早期誘導NAD（H）合成，促進TCA循環(huán)[11]；P. longanae侵染荔枝果實后期會提高NADP（H）含量，提高PPP代謝強度[26]。

TCA循環(huán)除了能提供碳骨架外，還能合成ATP和NADH[22]。NAD和NADH是吡啶核苷酸的主要類型，起調(diào)節(jié)輔因子和電子轉移的作用，參與鈣信號轉導[27]；NAD和NADH通過多聚ADP核糖基化和蛋白質去乙?；瘏⑴c修復DNA[28]。隨著質子跨線粒體膜轉運，通過TCA循環(huán)將NAD轉化為NADH[29]。NADH可通過氧化磷酸化進一步氧化為NAD，并伴隨ATP的生成[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染早期甜瓜果實的NAD和NADH含量大幅度升高。前人研究發(fā)現(xiàn)，大麥感染白粉病后，葉片中NAD含量增加了2 倍[31]；NAD可誘導擬南芥PR基因的表達和對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性[32]。IDH是TCA循環(huán)中的關鍵酶，催化琥珀酸生成α-酮戊二酸，同時產(chǎn)生NADH[33]。α-酮戊二酸是谷氨酸合成前體[34]，谷氨酸在植物抵御病原菌侵染過程中具有重要作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染早期甜瓜果實的IDH活力在早期（12 h）顯著低于對照組。前人研究發(fā)現(xiàn)，過量ATP的產(chǎn)生可抑制TCA循環(huán)[11]，T. roseum侵染12 h時，能誘導厚皮甜瓜大量ATP合成[16]。因此，認為IDH活力在侵染早期的降低可能受到ATP大量合成的影響。MDH是TCA循環(huán)中的另一關鍵酶[36]，催化蘋果酸生成草酰乙酸，促進細胞質和亞細胞器之間代謝物的交換和NADH的再生，且與能量代謝密切相關[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染早期大幅度提高了甜瓜果實的MDH活力，該結果與Fusarium oxysporum侵染豌豆后導致的早期MDH活力升高的結果[38]基本一致。由此表明，通過TCA循環(huán)形成的能量和碳骨架在厚皮甜瓜果實抵御病原物侵染的早期發(fā)揮了重要作用。

PPP不僅能提供碳骨架，同時也是NADPH的主要來源途徑[10]，同時其中間產(chǎn)物如赤蘚糖-4-磷酸是合成可溶性酚酸的前體，酚酸能夠激活植物細胞體內(nèi)信號參與對病原菌的抗性[39-40]。葡萄糖經(jīng)己糖激酶催化生成的G6P是PPP的初始底物，G6P可為蔗糖、淀粉和細胞壁的合成提供前體物質[41]。NADPH可在NADPH氧化酶的作用下轉移電子將O2催化還原為超氧陰離子，參與活性氧產(chǎn)生[42]。NADPH還是谷胱甘肽還原酶的輔酶，以維持還原型谷胱甘肽的正常水平，在清除活性氧的過程中發(fā)揮作用，以保護酶、硫氧還蛋白以及細胞膜免受氧化損傷[43]。RPI可催化PPP的非氧化階段中Ru5P和R5P之間相互轉化，在核苷酸、芳香族氨基酸、苯丙烷及其衍生物合成中具有重要作用[44]，苯丙烷及其衍生物除具有直接的抑菌作用外，還積極參與了寄主的抗病反應[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染厚皮甜瓜后期顯著提高了G6PDH和6PGDH的活力，促進了G6P和NADPH的積累。NADPH含量在侵染的前期和中期顯著低于對照組，而在后期顯著高于對照組，可能是由于在前期和中期TCA循環(huán)旺盛，抑制了PPP[37-38]。后期接種甜瓜果實NADPH含量增加的原因與PPP激活相關[11,24]。由此表明，通過PPP形成的碳骨架和NADPH在厚皮甜瓜果實抵御病原菌侵染的后期發(fā)揮了重要作用。

NADK是生物體內(nèi)唯一能夠催化NAD+生成NADP+的酶，該酶以ATP作為磷?；w催化NAD（H）反應生成NADP（H）[46]。NADK的激活可提高或維持組織中NADPH水平，以發(fā)揮NADPH在抗病中的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum侵染厚皮甜瓜果實后NADK活力先急劇升高后逐步降低，但始終高于對照組。由此表明，NADK催化的NAD+轉化為NADP+在果實抗病的不同階段均發(fā)揮了作用，但詳細機制有待進一步揭示。

接種果實由于早期能量供應短缺導致病斑出現(xiàn)，為了彌補能量供應短缺，果實的TCA循環(huán)被激活，在一定程度上抑制了PPP[11]。接種后期由于防御反應需要大量的碳骨架，因此PPP增強，TCA循環(huán)受到了一定程度的抑制[14]。

綜上，T. roseum侵染早期能誘導厚皮甜瓜果實大幅度提高TCA循環(huán)關鍵酶MDH的活力，促進NAD和NADH的積累；侵染的后期激活了果實的PPP，增加了G6PDH和6PGDH活力以及G6P、NADH含量。由此表明，TCA循環(huán)和PPP在病原菌侵染果實的不同階段發(fā)揮作用，TCA循環(huán)更多參與了果實早期的抗病防御，而PPP在后期的寄主防御反應中發(fā)揮了更大的作用。