于弋涵，杜偉寧，胡秋輝，蘇安祥，徐 輝，劉建輝，謝旻皓，楊文建,*

（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京外國語學(xué)校，江蘇 南京 210018）

猴頭菇（Hericium erinaceus）與魚翅并稱“山珍猴頭、海味魚翅”，不僅味道鮮美可口，還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白含量豐富，是我國傳統(tǒng)的食藥兩用真菌[1]。在猴頭菇干制品中每100 g約含有27 g蛋白質(zhì)，同時富含17 種氨基酸，其中包含有人體所必需的8 種氨基酸[2]。有研究利用蛋白組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)研究猴頭菇中參與生物調(diào)節(jié)活性的蛋白，其中有722 種蛋白存在差異表達(dá)，有專家推測這些差異蛋白可能與分子信號傳導(dǎo)、次級代謝和能量代謝等相關(guān)，這說明猴頭菇生物合成基因的差異調(diào)控，使之產(chǎn)生了不同藥理作用的活性代謝物質(zhì)[3]。但目前對于猴頭菇中活性物質(zhì)的研究多在猴頭菇多糖以及猴頭菇醇浸提物和水浸提物方面[1]，對于猴頭菇活性蛋白和活性肽的研究鮮有報道。

生物活性肽相較于蛋白質(zhì)，具有更容易被人體吸收利用[4]、在較小濃度下具有較強的生物活性的特點[5]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在食用菌活性肽研究方面取得了很大的進(jìn)展。食源活性肽的制備大多是利用酶法水解，這種制備方法操作簡單、成本低，被廣泛用于工業(yè)制備[6-8]。在特定條件下，利用酶切出特定的片段，通過分離純化技術(shù)可得到生物活性肽。程湛等[9]通過堿性蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶制備香菇多肽，發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶酶解得到的香菇多肽具有較好的抗氧化和醒酒活性。李桂峰等[10]通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解雙胞菇的條件并獲得具有抗氧化活性的雙胞菇肽。張勝等[11]采用體外細(xì)胞培養(yǎng)研究靈芝活性肽的生物活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝活性肽對肝癌細(xì)胞具有抑制生長、促進(jìn)凋亡的作用。除此之外，還有研究表明利用多種酶酶解茶樹菇、松茸、滑菇、杏鮑菇等蛋白制備的生物活性肽具有多種生物活性[12-15]。由此看出食用菌中生物活性肽資源豐富，有很大的發(fā)展和挖掘潛能。

基于此，本研究利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對猴頭菇蛋白進(jìn)行酶解，探究體外抗氧化功能，并利用體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7、人肝癌HepG-2細(xì)胞探究猴頭菇多肽的抗炎和抗腫瘤活性，為猴頭菇中生物活性肽的分離純化制備提供基礎(chǔ)信息，同時為猴頭菇功能成分開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇（干制品） 黑龍江東寧北域良人山珍食品有限公司；堿性蛋白酶（2 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（2 500 U/mg） 葉源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)喹啉-4,4’-二甲酸二鈉（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4） 北京索萊寶科技有限公司；高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（foetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青鏈霉素、胰蛋白酶 美國Gibco生物科技公司；NO測定試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測試劑、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7、人肝癌HepG-2細(xì)胞 上海瑞鹿生物技術(shù)有限公司；其他試劑（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Tube Mill 100 control 磨粉機 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；TE2145電子天平 美國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SB25-12超聲清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；Academic超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；GL-21M離心機 上海市離心機械研究所有限公司；L-8800氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀美國Becton Dickinson公司；8000系列二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇多肽的制備

猴頭菇多肽的制備參考文獻(xiàn)[16]。將猴頭菇干制品利用磨粉機制備成猴頭菇粉，過80目篩后按料液比1∶20加入蒸餾水，以0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至浸提液pH值為13，70 ℃水浴加熱8 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液。沉淀重復(fù)上述操作進(jìn)行復(fù)提，合并2 次上清液，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)整上清液pH值為3，靜置30 min，在12 000 r/min的條件下離心20 min，得到蛋白質(zhì)沉淀。用少量超純水?dāng)噭虻鞍?，加?.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，后利用截留分子質(zhì)量 500 Da、直徑25 mm的透析袋透析10 h，透析外液為去離子水，每2 h更換一次透析外液。60 ℃旋蒸，體積濃縮至原體積三分之一后冷凍干燥，得到猴頭菇粗蛋白備用。采用凱氏定氮法測定猴頭菇粗蛋白中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.43%。將猴頭菇粗蛋白溶于水中（10 g/L）按照表1用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值并分別在木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶的作用下進(jìn)行酶解，加酶量為0.1 g/L，酶解4 h后90 ℃加熱10 min終止反應(yīng)，12 000 r/min離心后取上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到猴頭菇粗多肽分別命名為HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T，置于室溫干燥器中儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 蛋白酶最適水解條件Table 1 Optimum conditions for protease hydrolysis used in this study

1.3.2 猴頭菇多肽氨基酸組成的分析

采用氨基酸自動分析儀測定猴頭菇多肽氨基酸組成。稱取1 mg的猴頭菇多肽于安瓿管中，加入6 mol/L的濃鹽酸，用保鮮膜封閉管口，在110 ℃下水解24 h后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸干，用0.02 mol/L HCl溶液溶解并調(diào)節(jié)氨基酸濃度在40 nmol/L。采用氨酸酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組分分析。

1.3.3 猴頭菇多肽表面疏水性的測定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene sulfonate，ANS）熒光探針法測定猴頭菇多肽的表面疏水性[17]。將HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T溶于PBS（0.01 mol/L、pH 7.4，后同）配制成質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 μg/mL的溶液。取4 mL樣品溶液，加入20 μL 8 mmol/L ANS。熒光分光光度計測定樣品的熒光強度（其中激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm），以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強度為縱坐標(biāo)作圖，擬合曲線初始階段的斜率即為猴頭菇多肽的表面疏水性指數(shù)。

1.3.4 猴頭菇多肽抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的測定

在96孔板中分別加入50 μL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的猴頭菇多肽或VC溶液，然后加入200 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合均勻，其中空白為超純水，對照為50 μL超純水中加入200 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液。室溫下，在黑暗中靜置30 min后，通過酶標(biāo)儀測定517 nm波長處的吸光度，按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為對照的吸光度；A1為添加不同質(zhì)量濃度猴頭菇多肽或VC溶液的吸光度；A2為空白的吸光度。

1.3.4.2 ?OH清除率的測定

準(zhǔn)確吸取0.15 mL濃度5.0 mmol/L的鄰二氮菲溶液加入試管中，再加入0.4 mL濃度0.75 mol/L PBS（pH 7.4）和0.25 mL蒸餾水，充分混勻。然后加入0.6 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液后立即混勻。實驗組試管中分別加入0.1 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的猴頭菇多肽或VC溶液，并加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)1% H2O2溶液；空白組試管中加入0.1 mL的蒸餾水和0.1mL體積分?jǐn)?shù)為1% H2O2溶液；對照組試管中加入0.2 mL的蒸餾水。各組溶液于37 ℃條件下保溫60 min后冷卻至室溫，測定536 nm波長處吸光度。按照式（2）計算?OH清除率。

式中：A1為對照組吸光度；A2為實驗組吸光度；A3為空白組吸光度。

1.3.5 猴頭菇多肽對RAW264.7細(xì)胞抗炎活性的測定

1.3.5.1 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10% FBS和體積分?jǐn)?shù)0.5%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基）在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞鋪板率大于培養(yǎng)瓶底面積的80%時，吸盡原培養(yǎng)基并用移液槍吸取3 mL PBS，洗滌細(xì)胞兩次，除去漂浮的死細(xì)胞，隨后用移液槍吸取2 mL完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞至完全脫落，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104個/mL，按每孔100 μL加入到96 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.5.2 RAW264.7細(xì)胞增殖率的測定

使用MTT法評估猴頭菇多肽對RAW264.7細(xì)胞的毒性[18]。1.3.5.1節(jié)96 孔板中RAW264.7細(xì)胞37 ℃孵育24 h后吸盡培養(yǎng)液，用PBS洗滌數(shù)次?？瞻捉M加入200 μL的DMEM，對照組（不含RAW264.7細(xì)胞）加入200 μL/孔DMEM，實驗組加入200 μL/孔含400 μg/mL猴頭菇多肽的DMEM，每組設(shè)置5 個平行，孵育24 h后，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）并在37 ℃培養(yǎng)基中孵育4 h。去除MTT溶液后每孔加入100 μL DMSO。將96 孔板置于恒溫振蕩器上室溫振蕩20 min后，測定570 nm波長處的吸光度，按照式（3）計算細(xì)胞增殖率。

式中：A1為實驗組吸光度；A0表示對照組吸光度；A2表示空白組吸光度。

1.3.5.3 NO濃度的測定

采用Griess法對RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量水平進(jìn)行測定[19]。將1.3.5.1節(jié)96 孔板中RAW264.7細(xì)胞，孵育24 h，去除上層培養(yǎng)液。96 孔板中加入100 μL 10 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），放置在培養(yǎng)箱中孵育4 h后加入100 μL不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、400 μg/mL）的樣品，培養(yǎng)24 h，收集上清液并參考NO測定試劑盒說明書測定NO濃度。

1.3.5.4 IL-6、IL-10質(zhì)量濃度的測定

參考ELISA試劑盒說明書測定RAW264.7細(xì)胞IL-6、IL-10質(zhì)量濃度。

參照1.3.5.3節(jié)方法建立炎癥模型，即用10 μg/mL LPS處理RAW264.7細(xì)胞4 h后移除上清液。實驗組加入不同質(zhì)量濃度的猴頭菇多肽（50、100、200、400 μg/mL），空白組加入完全培養(yǎng)基，孵育24 h。每組樣品設(shè)置5 個平行。

1.3.6 猴頭菇多肽抑制HepG-2細(xì)胞活性的測定

1.3.6.1 HepG-2細(xì)胞的培養(yǎng)

HepG-2細(xì)胞用完全培養(yǎng)基置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞鋪板率大于培養(yǎng)瓶底面積的80%時，吸盡原培養(yǎng)基并用移液槍吸取3 mL PBS，洗滌細(xì)胞兩次，除去漂浮的死細(xì)胞，隨后用移液槍吸取2 mL胰蛋白酶溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%，后同），覆蓋細(xì)胞約30 s后吸去胰蛋白酶溶液，培養(yǎng)箱放置2 min后加入2 mL完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞至完全脫落，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104個/mL，按每孔100 μL加入到96 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.3.6.2 HepG-2細(xì)胞增殖率的測定

將1.3.6.1節(jié)96 孔板中HepG-2細(xì)胞37 ℃孵育24 h后吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌數(shù)次。參照1.3.5.2節(jié)方法測定HepG-2細(xì)胞在200 μg/mL猴頭菇多肽、50 μg/mL5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）（陽性對照組）作用下的HepG-2細(xì)胞增殖率。

1.3.6.3 乳酸脫氫酶釋放率的測定

將1.3.6.1節(jié)96 孔板中HepG-2細(xì)胞，孵育24 h后去除上層培養(yǎng)液。分別用不同質(zhì)量濃度的樣品（50、100、200、400 μg/mL）處理12 h，以50 μg/mL 5-Fu作為陽性對照組，等體積的DMEM為空白組，不含細(xì)胞的等體積DMEM為對照組。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸取孔內(nèi)上清液，利用LDH檢測試劑盒檢測上清液中LDH水平。按照式（4）計算LDH釋放率。

式中：A1為空白組吸光度；A0為對照組吸光度；A2為添加樣品的實驗組吸光度。

1.3.6.4 MDA含量的測定

通過硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法[20]測定HepG-2細(xì)胞內(nèi)MDA含量。將1.3.6.1節(jié)96 孔板中HepG-2細(xì)胞，孵育24 h后去除上層培養(yǎng)液。分別用不同質(zhì)量濃度的樣品（50、100、200、400 μg/mL）處理12 h，以50 μg/mL 5-Fu作為陽性對照組，等體積的培養(yǎng)基為空白組。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上清液。加入100 μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，裂解完成后，10 000×g離心10 min，取上清液后參考MDA試劑盒說明書測定各組HepG-2細(xì)胞中MDA含量，單位為U/mg。

1.3.6.5 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡

使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對HepG-2細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行測定。按照1.3.6.1的方法培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，然后加入0.5 mL胰蛋白酶溶液。室溫孵育2 min，吸除胰蛋白酶溶液，加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，移至離心管，1 000×g離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)，取5×104個重懸的細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄去上清液，依次加入195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液，5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，混勻。室溫避光孵育15 min后，待測液保存于冰盒中。使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡量，檢測前需輕輕重懸細(xì)胞，用FlowJo軟件分析流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以3 次測定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理和分析，采用Duncan檢驗進(jìn)行顯著性統(tǒng)計分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的猴頭菇多肽氨基酸組成

活性肽的功能取決于其特殊的氨基酸以及排列順序，有研究表明，谷氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等有利于提高活性肽的抗氧化活性，具有較強的自由基清除活性，除此之外，疏水性氨基酸可以增強肽與脂類的相互作用更易于進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮抗炎與抗癌細(xì)胞活性[21]。因此，不同的氨基酸組成對活性肽發(fā)揮生物活性至關(guān)重要。本實驗對4 種猴頭菇多肽進(jìn)行氨基酸分析結(jié)果如表2所示，4 組酶解物的氨基酸組成都富含谷氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和蛋氨酸，這些氨基酸都有助于增強其抗氧化作用。HEPH-A和HEPH-T的必需氨基酸含量最高，為132.11 mg/g和141.38 mg/g，表明猴頭菇多肽具有較好的營養(yǎng)價值，此外疏水性氨基酸含量也均高于另外兩組，表明它們更容易進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。

表2 猴頭菇多肽的氨基酸組成及含量Table 2 Amino acid composition of HEPHs

續(xù)表2

2.2 不同猴頭菇多肽的表面疏水性指數(shù)

在天然蛋白質(zhì)分子中，疏水基團埋藏在其折疊結(jié)構(gòu)內(nèi)，蛋白質(zhì)被水解后就會暴露這些基團，表現(xiàn)在其表面疏水性的增加，而隨著水解程度的加劇，暴露的基團又會被水解成更小的肽段，甚至是氨基酸，從而失去其表面疏水性[22]。研究認(rèn)為活性肽的疏水性結(jié)構(gòu)會顯著影響抗氧化活性，活性肽N-端的疏水殘基也有助于提高抗氧化的作用[23]。由圖1可知，HEPH-A具有較高的表面疏水性指數(shù)（1 256.67±5.37），其次為HEPH-P（1 113.90±3.48）。表明HEPH-A和HEPH-P可能含有與抗氧化活性相關(guān)的活性肽。

圖1 不同猴頭菇多肽的表面疏水性指數(shù)Fig. 1 Hydrophobicity indices of HEPHs

2.3 不同猴頭菇多肽的抗氧化活性

DPPH自由基作為相對穩(wěn)定的自由基被廣泛用來檢測以自由基捕獲劑或氫供體形式存在的物質(zhì)，從而用以評定其抗氧化能力[24]。大量的生化反應(yīng)會生成超氧陰離子，雖然它們不能直接引起脂肪氧化，但是能與?OH發(fā)生反應(yīng)，對機體的危害極大[25]。因此本實驗考察了猴頭菇多肽對DPPH自由基和?OH的捕捉能力。如圖2A所示，隨著樣品質(zhì)量濃度升高，DPPH自由基清除率不斷升高，1.0 mg/mL HEPH-P的DPPH自由基清除率達(dá)到（53.01±0.27）%，盡管低于VC的DPPH自由基清除率（（96.63±0.27）%），但仍顯示出較高的DPPH自由基清除活性，說明HEPH-P中含有與DPPH自由基清除相關(guān)的活性肽組分。如圖2B所示，不同猴頭菇多肽的?OH清除率隨濃度上升而升高，其中1.0 mg/mL HEPH-P的?OH清除率（（55.73±1.52）%）大于其他猴頭菇多肽，表現(xiàn)出較好的?OH清除效果。這與圖2A的DPPH自由基清除率結(jié)果是一致的，表明HEPH-P中含有與抗氧化相關(guān)的活性肽組分。此結(jié)果與梁杰等[26]研究中木瓜蛋白酶可以水解出具有抗氧化活性多肽的結(jié)果是一致的。

圖2 猴頭菇多肽的DPPH自由基清除活性（A）和·OH清除活性（B）Fig. 2 DPPH (A) and hydroxyl radical (B)-scavenging activity of HEPHs

2.4 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細(xì)胞抗炎活性的影響

2.4.1 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

細(xì)胞增殖率可用來測定細(xì)胞生長分裂情況，常用來表征樣品對細(xì)胞活性的影響[27]。選取高劑量400 μg/mL對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行細(xì)胞毒性測定，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T處理后，RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞增殖率分別為（108.20±1.20）%、（103.94±1.23）%、（115.35±2.06）%、（90.28±1.24）%，均高于80%，表明猴頭菇蛋白水解物作用質(zhì)量濃度不高于400 μg/mL時，對小鼠巨噬細(xì)胞的毒性作用低，可用于進(jìn)行細(xì)胞實驗。

圖3 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響Fig. 3 Effect of HEPHs on RAW264.7 cell viability

2.4.2 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細(xì)胞NO分泌的影響

有研究報道NO參與免疫應(yīng)答相關(guān)的生理過程，是巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物的主要效應(yīng)分子之一[28]。過量持續(xù)刺激產(chǎn)生的NO和促炎因子會引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和凋亡[29]。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后過量表達(dá)NO，而細(xì)胞內(nèi)過多的NO不利于緩解炎癥反應(yīng)。因此對經(jīng)過不同猴頭菇多肽處理后RAW264.7細(xì)胞上清液中NO進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。HEPH-A處理組和HEPH-T處理組細(xì)胞中的NO釋放量減少，并且隨著樣品濃度的升高，與空白組相比，處理組NO濃度極顯著降低（P＜0.01）。其中，在400 μg/mL HEPH-A處理后的細(xì)胞NO濃度為（29.23±1.46）μmol/L，極顯著低于空白組（（53.12±1.26）μmol/L）（P＜0.01），且明顯低于其他猴頭菇多肽處理組，表現(xiàn)出較好的抑制NO產(chǎn)生的效果。由此表明，HEPH-A處理可以有效降低NO分泌，表現(xiàn)出較強的抗炎活性，因此選擇HEPH-A進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 不同猴頭菇多肽對RAW264.7NO釋放量的影響Fig. 4 Effect of HEPHs on RAW264.7 NO release y

2.4.3 HEPH-A對RAW264.7細(xì)胞IL-6、IL-10分泌的影響

巨噬細(xì)胞激活后可通過分泌細(xì)胞因子傳導(dǎo)并調(diào)控免疫通路，其中IL-6、IL-10在其中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明IL-6能促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長和分化、增強自然殺傷細(xì)胞的裂解功能，但是IL-6持續(xù)分泌會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，加速炎癥反應(yīng)的發(fā)展；而IL-10可以抑制炎性細(xì)胞的激活、遷移和黏附，緩解炎癥反應(yīng)，并在組織修復(fù)、過敏反應(yīng)過程中發(fā)揮作用[30]。根據(jù)2.4.2節(jié)結(jié)果，選擇猴頭菇多肽HEPH-A，進(jìn)一步探究其在LPS刺激炎癥模型中IL-6、IL-10的分泌水平。為了研究HEPH-A對細(xì)胞炎癥抑制作用是否通過調(diào)控細(xì)胞因子的分泌而實現(xiàn)，采用不同質(zhì)量濃度HEPH-A（50、100、200、400 μg/mL）處理RAW264.7細(xì)胞后測定細(xì)胞IL-6和IL-10的水平，空白組采用等體積的PBS處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6質(zhì)量濃度分別達(dá)到（153.04±1.93）、（153.11±1.95）、（139.25±1.66）、（129.85±1.32）ng/mL，空白組為（156.19±1.29）ng/mL（圖5）。與空白組相比，200、400 μg/mL HEPH-A處理RAW264.7細(xì)胞的IL-6的分泌量極顯著降低（P＜0.01），說明在一定劑量下HEPH-A可顯著抑制炎癥因子IL-6的分泌。不同質(zhì)量濃度HEPH-A（50、100、200、400 μg/mL）處理后IL-10質(zhì)量濃度分別為（183.92±1.32）、（200.75±1.62）、（251.40±1.39）、（302.36±1.14）ng/mL，空白組為（359.62±1.31）ng/mL，說明高劑量HEPH-A能有效促進(jìn)IL-10釋放，并且400 μg/mL HEPH-A處理RAW264.7細(xì)胞的IL-10的分泌水平最高。綜上，HEPH-A可以通過抑制IL-6的分泌、促進(jìn)抑炎因子IL-10的釋放而緩解炎癥反應(yīng)。

圖5 猴頭菇多肽HEPH-A對RAW264.7細(xì)胞中IL-6（A）、IL-10（B）水平的影響Fig. 5 Effect of HEPH-A on the secretion of IL-6 (A) and IL-10 (B) in RAW264.7 cells

2.5 不同猴頭菇多肽對HepG-2細(xì)胞的影響

2.5.1 不同猴頭菇多肽對HepG-2細(xì)胞活力影響

MTT法是一種檢測細(xì)胞存活及生長情況的方法，能直接反映細(xì)胞狀態(tài)。為了驗證猴頭菇蛋白4 種水解后猴頭菇多肽（HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A及HEPH-T）的體外抗腫瘤活性，利用MTT法研究猴頭菇多肽在（200 μg/mL）對HepG-2細(xì)胞增殖抑制作用。結(jié)果如圖6所示，空白組細(xì)胞增殖率為100%，陽性對照組（50 μg/mL 5-Fu）細(xì)胞增殖率為（60.02±1.25）%。與空白組相比，HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A組細(xì)胞增殖率極顯著下降（P＜0.01），其中HEPH-P組最低，為（72.14±1.40）%，高于陽性對照組。由此可見，HEPH-P、HEPH-F和HEPH-A能夠極顯著抑制HepG-2細(xì)胞增殖（P＜0.01），其中HEPH-P的抑制效果最好，因此選擇HEPH-P進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖6 猴頭菇多肽不同組分對HepG-2細(xì)胞活力的影響Fig. 6 Effect of HEPH on cell viability of HepG-2 cells

2.5.2 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細(xì)胞LDH釋放的影響

已有研究證明HepG-2肝癌細(xì)胞增殖被抑制的原因可能是活性物質(zhì)促使肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜發(fā)生破裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而LDH是一種隨著細(xì)胞膜破裂會釋放到膜外的酶，其活力能夠反映細(xì)胞膜完整性破壞程度[31]。如圖7所示，將HEPH-P以不同質(zhì)量濃度（50、100、200、400 μg/mL）作用HepG-2細(xì)胞后，細(xì)胞中LDH釋放率分別為（108.06±2.35）%、（120.83±2.60）%、（137.36±2.44）%、（149.97±3.25）%，陽性對照組LDH釋放率為（204.34±1.61）%，均極顯著高于空白組（P＜0.01）。HEPH-P作用于HepG-2細(xì)胞后使細(xì)胞膜發(fā)生破裂，LDH被釋放，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。LDH的釋放率隨添加HEPH-P質(zhì)量濃度增加而上升，這與李娜等[32]的研究結(jié)果是一致的。

圖7 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細(xì)胞中LDH釋放率的影響Fig. 7 Effect of HEPH-P on LDH release in HepG-2 cells

2.5.3 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細(xì)胞MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物之一，其含量主要反映HepG-2細(xì)胞過氧化的程度，也間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度[33]。如圖8所示，200 μg/mL HEPH-P處理HepG-2細(xì)胞中MDA的含量為（25.98±4.56）U/mg，極顯著高于空白組（P＜0.01）。這與2.5.2節(jié)的結(jié)果并不矛盾，表明HEPH-P導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外泄導(dǎo)致大量氧化反應(yīng)，導(dǎo)致MDA含量升高。

圖8 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細(xì)胞中MDA含量的影響Fig. 8 Effect of HEPH-P on MDA content in HepG-2 cells

2.5.4 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細(xì)胞凋亡的影響

為了探究由HEPH-P是否會引起HepG-2細(xì)胞的凋亡，使用流式細(xì)胞儀分析了凋亡細(xì)胞的百分比[34-35]。如圖9所示，HEPH-P可顯著促進(jìn)凋亡期HepG-2細(xì)胞的積累，與空白組（0.28%）相比，400 μg/mL HEPH-P組凋亡細(xì)胞比例增加到81.4%，其中早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞比例分別為80.5%和0.9%。由此可知，HEPH-P處理可以顯著誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，且主要是早期凋亡。促使細(xì)胞凋亡是活性肽發(fā)揮抗腫瘤生物活性的重要途徑之一，上述結(jié)果表明HEPH-P誘導(dǎo)了HepG-2細(xì)胞凋亡。

圖9 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細(xì)胞凋亡的影響Fig. 9 Effect of HEPH-P on HepG-2 cell apoptosis

3 結(jié) 論

本研究通過對猴頭菇蛋白進(jìn)行酶解制備猴頭菇多肽HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T，其中HEPH-P的DPPH自由基清除率和?OH清除率均高于其他猴頭菇多肽，具有較好的抗氧化活性，同時在HepG-2細(xì)胞中能夠抑制癌細(xì)胞增殖，具體表現(xiàn)在促使細(xì)胞膜破裂、LDH釋放以及細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞增殖。除此之外，HEPH-A在體外RAW264.7抗炎模型中表現(xiàn)出抗炎活性，經(jīng)400 μg/mL HEPH-A處理后，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 NO分泌量由空白組（53.12±1.26）μmol/L降低為（29.23±1.46）μmol/L，IL-6的釋放減少，IL-10的分泌增加。綜上，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解猴頭菇蛋白得到的猴頭菇多肽具有較好的抗氧化、抗癌和抗炎活性，本實驗揭示了猴頭菇生物活性肽的生物活性，為猴頭菇生物活性肽的制備和應(yīng)用提供了理論參考。