羅玲玲, 于 江, 魏會強, 侯文彬*, 李祎亮*

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，天津 301617； 2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院-中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室，天津 300192)

熊去氧膽酸(UDCA)又稱3α,7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，是一種具有多種生物活性的親水性膽汁酸，也是治療肝膽疾病重要的臨床藥物，能增加膽汁的分泌[1]，抑制疏水性膽酸的細胞毒作用，保護膽管細胞和肝細胞免受毒性膽汁損傷，改善患者的發(fā)病率和死亡率。并且，它可通過改善肝移植后的原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者肝酶水平，延緩肝組織學(xué)進展，進而降低疾病的復(fù)發(fā)率以及延長生存期[2]。1997年，美國FDA批準UDCA為唯一一種用于治療PBC的一線治療藥[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，UDCA在癌癥治療中療效顯著[4]，其與多種癌癥誘發(fā)因子密切相關(guān)，介導(dǎo)并影響癌癥基因組中致癌信號通路調(diào)控，如控制細胞周期、PI3K/AKT、 P53、 TNF-κB和JAK-STAT等，如圖1所示為UDCA在腫瘤細胞中的作用機制。UDCA可特異性地調(diào)控細胞凋亡的閾值，抑制癌細胞生長[5]并誘導(dǎo)細胞自噬和凋亡[6-7]。此外，在進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中，UDCA還可改善受損的線粒體功能，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用[8]。

人體膽汁酸中UDCA約占3%，其在膽汁酸酶催化合成過程中，可由鵝去氧膽酸在腸道中通過代謝反應(yīng)少量合成[9-10]。鑒于UDCA具有豐富的醫(yī)療價值，通過化學(xué)和生物合成開發(fā)人工合成熊去氧膽酸以滿足臨床迫切的需求，已成為該領(lǐng)域藥物研究的熱點。以簡便易得的動物膽酸為原料，化學(xué)合成技術(shù)方法合成，操作簡單、試劑廉價，在工業(yè)上較為成熟。但工藝中化學(xué)有毒試劑以及手性難點等問題，成為工業(yè)技術(shù)轉(zhuǎn)化的瓶頸，利用生物酶催化或目標菌種將膽酸(Cholic acid， CA)、鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid， CDCA)轉(zhuǎn)換成UDCA，開發(fā)綠色、簡便、高效的生物合成方法，成為近年來的研究熱點。本文將近年來UDCA的最新合成方式進行了總結(jié)，分析并探討現(xiàn)有工藝的優(yōu)缺點，期望能為未來人工合成UDCA提供可借鑒、參考的信息。

1920年UDCA首次在熊膽汁中被發(fā)現(xiàn)， 但直到1937年才確定了UDCA的二羥基膽烷酸結(jié)構(gòu)。膽烷酸母核由4個環(huán)稠合而成，即A環(huán)和B環(huán)呈順式稠合，B環(huán)和C環(huán)呈反式稠合，母核上取代基的位置、數(shù)目的不同構(gòu)成各種膽汁酸(Chart 1)。UDCA結(jié)構(gòu)式的主要特征在于5-位β-H，3-位α-OH和7-位β-OH，其中7-位的羥基是區(qū)別于其差向異構(gòu)體CDCA的唯一特征。最初UDCA是通過活熊膽汁引流法獲得[11]，但熊膽汁來源有限并且違反了動物保護法。1954年，Kanazawa等[12]成功地從膽酸中合成UDCA，隨后，以CA、 CDCA、豬去氧膽酸(Hyodeoxycholic acid， HDCA)等原料通過化學(xué)合成UDCA的技術(shù)日益成熟。目前，相關(guān)研究主要致力于減少有毒試劑的使用、簡化步驟、提高收率、降低生產(chǎn)成本、擴大工業(yè)化生產(chǎn)。

1.1 由膽酸合成熊去氧膽酸

膽酸(CA)一般存在于牛、羊、豬的膽汁中，結(jié)構(gòu)與UDCA相似，是UDCA合成的主要原料之一。該路線制備通常經(jīng)側(cè)鏈羧酸酯化、3-位和7-位羥基乙?；Ｗo、12-位羥基氧化成羰基、羧酸酯水解、酮還原、7-位羥基構(gòu)型翻轉(zhuǎn)等7步反應(yīng)得到目標化合物[13](Scheme 1)。該路線中Wolff-Kishner反應(yīng)還原12-位羰基為亞甲基，由于聯(lián)氨毒性較大且容易爆炸，安全系數(shù)低，目前工業(yè)上一般采用流動化系統(tǒng)或碳化硅反應(yīng)器，提升反應(yīng)速度，避免過量使用聯(lián)氨[14]。也有文獻采用肼基甲酸甲酯代替聯(lián)氨，其操作簡單、安全[15]。Mozingo還原與Wolff-Kishner反應(yīng)類似，收率約95%[16]，但反應(yīng)生成乙硫醇的特殊氣味，不適合用于生產(chǎn)。歐松等[17]將膽酸12-位羥基置換為硫醚基團，再使用雷尼鎳還原去除硫醚基團，該方法相對于水合肼還原，操作簡單，優(yōu)勢明顯。仇文衛(wèi)等[18-19]采用叔丁醇鉀作為立體選擇性試劑，硼氫化鉀為唯一供氫體，40 ℃常壓下雷尼鎳催化合成UDCA，產(chǎn)率由64% 提高到71%，該方法新穎、成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好，便于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，運用Mitsunobu反應(yīng)在偶氮二碳酸二乙酯(DEAD)或偶氮二碳酸二異丙酯(DIAD)和三苯基膦(PPh3)作用下，可直接實現(xiàn)7-位羥基的構(gòu)型翻轉(zhuǎn)；但該反應(yīng)需在無水、無氧條件下進行，且反應(yīng)溫度、投料順序、副反應(yīng)等均難以把控，因此在工業(yè)上推廣仍有待繼續(xù)開發(fā)研究。

Scheme 1

Scheme 2

Scheme 3

1.2 由鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸

CDCA與UDCA互為差向異構(gòu)體。由CDCA合成UDCA的傳統(tǒng)合成方法是由CDCA通過甲酯化、選擇性保護羥基、Jones試劑或NBS氧化和二氯化鎳還原等步驟得到UDCA，步驟長且收率僅有43%[20]。經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，7-酮石膽酸(7K-LCA)是合成UDCA良好的中間體，將其作為原料通過催化加氫的方法進行立體選擇性還原即可得到高純度的UDCA。張國明等[21]報道在丙酮與水中用氧化劑NBS可將CDCA氧化為7K-LCA中間體,產(chǎn)率為86%，趙宏斌等[22]采用間接電氧化法，可將CDCA合成7K-LCA，產(chǎn)率約83%。由7K-LCA 合成UDCA，歐洲專利曾報道雷尼鎳在KOCMe3和Me2CHOH存在下，常壓40 ℃催化氫化還原得到UDCA，產(chǎn)率高達95%，UDCA純度為97%[23]。為減低反應(yīng)毒性和簡化步驟，盧茂芳等[24]用NaClO代替Jones試劑氧化得7K-LCA，然后在金屬鋰-叔丁醇作用下兩步法合成目標產(chǎn)物(Scheme 2)。此方法工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)率可以達到82%。

1.3 由豬去氧膽酸合成熊去氧膽酸

豬去氧膽酸(HDCA)是存在于豬膽汁中的一種天然甾體化合物，價廉、易得，是合成UDCA的重要原料之一。目前，開發(fā)出了多種以HDCA為原料合成UDCA的工藝方法，胡祥正等[25]對此進行了綜述。這些方法的反應(yīng)條件苛刻、總收率低，難以實現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)[26]。2016年，Qian等[27]以6,7-OH轉(zhuǎn)化的Shapiro反應(yīng)為關(guān)鍵步驟，開發(fā)了一條新的、簡便、高效的合成UDCA的路線，并通過區(qū)域選擇性氧化和隨后的自由基還原得到UDCA，總收率為26%(Scheme 3)。此外，因為有機硅烷試劑在自然界中的穩(wěn)定性、無毒性和來源豐富，Qian等利用有機硅烷試劑發(fā)現(xiàn)了一條總收率較高的合成路線，該路線反應(yīng)穩(wěn)定、綠色高效(Scheme 4)。

Scheme 4

Scheme 5

1.4 以植物源為原料合成熊去氧膽酸

雙鈉醇(Bisnoralcohol, BA)是由一株新金分枝桿菌對植物甾醇進行側(cè)鏈降解得到的化合物[28]。Wang 等[29]將植物來源的BA的3-位羰基變?yōu)橐叶趸玫交衔?5，經(jīng)PDC/NHPI氧化、H2SO4還原、Raney-Ni還原和水解，得到UDCA，產(chǎn)率約59%(Scheme 5)。 BA來源豐富，價格低廉。因此，以現(xiàn)有原料BA為原料，開發(fā)一種改進的UDCA規(guī)?；a(chǎn)的合成路線是十分有價值的。Chen等[30]以植物源脫氫雄酮(Dehydroepiandrosterone, DHEA) 為原料，通過Mistunobu反應(yīng)和區(qū)域選擇性烯丙基氧化反應(yīng)，開發(fā)了一條合成UDCA的新路線。在這條合成UDCA的新路線中，大多數(shù)反應(yīng)步驟都有很高的轉(zhuǎn)化率，8步總收率可達35%。這一發(fā)現(xiàn)啟示從天然產(chǎn)物入手，設(shè)計合成目標產(chǎn)物，可解決原料來源和安全性問題，但植物的分離、純化、分離量等問題還需要進一步探究。

盡管目前已經(jīng)發(fā)展出多種以CA、 CDCA和HDCA等簡便、易得的天然甾體化合物為原料合成UDCA的工藝方法，但產(chǎn)率低、步驟繁瑣、反應(yīng)條件苛刻且使用多種有毒化學(xué)試劑等缺陷，極大地限制了工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。工業(yè)上使用化學(xué)法生產(chǎn)的UDCA約為市場份額的30%，且制備純度低[31]，遠遠不能滿足市場需求。因此，提高UDCA生產(chǎn)工藝水平是目前企業(yè)面臨的最大技術(shù)難關(guān)，合成原料來源、綠色環(huán)保、工業(yè)化可持續(xù)性等仍然是合成工藝探索亟待解決的問題。

近年來，UDCA的生物合成技術(shù)發(fā)展迅猛，相比于化學(xué)合成，生物催化法具有綠色、高效、安全等特點，人們利用生物催化方法合成UDCA的研究也已經(jīng)取得長足進步。

2.1 生物合成相關(guān)酶

7α-羥類固醇脫氫酶(7α-HSDH)和7β-羥類固醇脫氫酶(7β-HSDH)同屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族，其中7α-HSDH可以將甾體底物中的7α-位羥基氧化為羰基，而7β-HSDH則將7-位羰基選擇性還原為7β-羥基[32]。Lou等[33]在Clostridiumabsonum中分離得到7α-HSDH，通過基因編輯得到的突變體R194A催化效率(Kcat/Km)較高。據(jù)報道，大腸桿菌內(nèi)7α-HSDH具有CDCA轉(zhuǎn)化為UDCA的最高活性，但研究尚不成熟，目前國內(nèi)外研究主要集中在異源表達工程酶的研究，此類脫氫酶可由野生細菌產(chǎn)生，表1為部分已報道的通過野生型微生物催化轉(zhuǎn)化為UDCA的相關(guān)細菌。

表1 已報道的野生型微生物全細胞轉(zhuǎn)化

2.2 輔酶再生因子

NADP+和 NAP+是輔酶再生因子，可作為供氫體參與體內(nèi)多種代謝反應(yīng)。其中，輔酶循環(huán)是氧化還原酶催化體系的核心技術(shù)。使用脫氫酶的微生物，通過提供適當?shù)妮o酶再生底物(如葡萄糖)，利用微生物的輔酶再生系統(tǒng)，使輔酶再生循環(huán)使用。常用的輔助再生系統(tǒng)見圖2。文獻報道大多數(shù)7β-HSDH 是NADPH依賴性激酶。與NADP+相比，NAD+更經(jīng)濟，You等利用基于結(jié)構(gòu)信息和保守序列比對的輔助因子特異性反轉(zhuǎn)策略，合理地設(shè)計了一種源自Ruminococcustorques的重組7β-HSDH，其能有效地將7β-HSDH的 輔助因子NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADH[34]。 2019年，F(xiàn)abio等[35]從Lactobacillusspicheri中鑒定了一株野生型依賴NADP+的7β-HSDH，并對其進行重組、純化和生化鑒定。該酶與從Stenotrophomonas分離出的7α-HSDH聯(lián)合使用能實現(xiàn)CA向UDCA轉(zhuǎn)化。

圖2 輔助因子的循環(huán)再生系統(tǒng)

2.3 UDCA的生物合成路線

CDCA能通過兩步反應(yīng)制得UDCA，即將7-位羥基氧化為羰基生成中間體7-酮石膽酸(7K-LCA)，進而還原得到UDCA。在氧化過程中，在7α-HSDH的作用下CDCA氧化為7K-LCA，與此同時輔因子NAD+(NADP+)轉(zhuǎn)化為NADH(NADPH)，并在乳酸脫氫酶(LDH)的催化下將NADH(NADPH)轉(zhuǎn)化為NAD+(NADP+)，實現(xiàn)輔酶循環(huán)。隨后，加熱淬滅，使7α-HSDH和LDH失活，避免可逆反應(yīng)。在還原反應(yīng)中，7β-HSDH將中間體7K-LCA還原生成UDCA，與此同時輔因子NADH(NADPH)轉(zhuǎn)化為NAD+(NADP+)，并在葡萄糖脫氫酶(GDH)的作用下，實現(xiàn)輔因子NADH(NADPH) 的再生[36]。Zheng等[37]首次識別7β-HSDH在堿性環(huán)境下影響酶活性和熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸殘基，采用易錯聚合酶鏈式反應(yīng)(ep PCR)、 DNA改組和定點誘變等技術(shù)多目標定向設(shè)計7β-HSDH，以大腸桿菌BL21(DE3)hsd-kan+基因敲除突變體為宿主，獲得高水平的重組酶，實現(xiàn)了酶的高效表達。與野生酶相比，V3-1突變體在最適pH下活性提高5.5倍，穩(wěn)定性提高3.5倍，UDCA產(chǎn)量提高7倍，產(chǎn)率90%。目前重組脫氫酶在500 L發(fā)酵罐中，已實現(xiàn)公斤級UDCA的規(guī)?；a(chǎn)[38]。此外，秦和平等[39]利用磷酸緩沖液的底物CDCA，在輔酶Ⅰ(NAD)、 NADPH氧化酶2(NOX2)以及通入氧氣的情況下，利用7α-HSDH酶催化氧化CDCA得到7K-LCA；在NAD、 L-蘋果酸以及蘋果酸脫氫酶存在的情況下,利用7β-HSDH催化還原7K-LCA得到UDCA。此方法操作簡單，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高達99%。

Scheme 6

Scheme 7

12-酮-熊去氧膽酸(12K-UDCA)是CA轉(zhuǎn)化為UDCA的重要中間體。CA經(jīng)7α-HSDH和12α-HSDH分別氧化7-位和12-位羰基，得到7,12-酮-熊去氧膽酸(7,12-keto-UDCA)，該過程依賴NAD+輔助因子，并通過LDH和丙酮酸再生NAD+。 7,12-keto-UDCA經(jīng)由依賴NADP+的7β-HSDH將7-位羰基還原為羥基，得到關(guān)鍵中間體12K-UDCA，并通過GDH和葡萄糖再生NADPH。中間體12K-UDCA經(jīng)Wolff-Kishner還原得到目標產(chǎn)物UDCA。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度底物會導(dǎo)致催化進行不完全，一鍋法反應(yīng)容易產(chǎn)生副產(chǎn)物，采用膜反應(yīng)器生物合成法與化學(xué)合成法相結(jié)合方式進行改進，將7α-HSDH和12α-HSDH和一定濃度CA置入第一個膜反應(yīng)器中，完成酶催化氧化反應(yīng)，生成物7,12-keto-UDCA連續(xù)不斷的透過分離膜進入含有7β-HSDH的第二級膜反應(yīng)器；完成7,12-keto-UDCA酶催化還原反應(yīng)后，生成的12K-UDCA 在堿性條件下與肼反應(yīng)得到UDCA，收率維持在75%左右。該方法有效減少副反應(yīng)，且延長酶循環(huán)使用期限?；瘜W(xué)和酶的結(jié)合步驟時，應(yīng)特別注意二者的配伍性，這種途徑也是獲得UDCA高產(chǎn)率的重要方法。

2.4 UDCA的生物合成方法

細胞內(nèi)不同代謝途徑存在大量的多酶級聯(lián)反應(yīng)，這些反應(yīng)通常由兩種或兩種以上的酶參與完成。多酶級聯(lián)反應(yīng)中的有毒或不穩(wěn)定中間體可能在出現(xiàn)的一瞬間就會被消耗[41]，從而改變反應(yīng)平衡，使其有利于產(chǎn)物的形成，推動可逆反應(yīng)完成，減少反應(yīng)時間，降低成本。Sun等[42]研究了化學(xué)酶法制備UDCA的關(guān)鍵步驟：兩步還原脫氫膽酸底物的濃度會影響細胞的生長[41]，抑制HSDH酶活性，限制產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；此外，產(chǎn)物對酶活性的抑制也是導(dǎo)致不完全異構(gòu)化的主要原因。Chen 等人通過使用具有不同輔助因子特異性的7α-HSDH和7β-HSDH，利用獨立的輔助因子回收系統(tǒng)(以黃素氧化還原酶(FR)和黃素單核苷酸(FMN)為原料，建立了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)再生體系，在一個鍋內(nèi)實現(xiàn)了CDCA到UDCA的完全轉(zhuǎn)化[43]。在酶催化反應(yīng)中，輔助因子的濃度會提高其再生速率，也會同時抑制另一個輔助因子，輔助因子的濃度比至關(guān)重要。Sun等人提出兩步一鍋批量還原DHCA為12K-UDCA的動態(tài)過程模型，通過多實驗過程曲線擬合，推導(dǎo)了該機理和競爭底物酶反應(yīng)的全速率方程，并分別確定了各酶反應(yīng)的模型參數(shù)，模型分析為最佳反應(yīng)條件的確定提供了重要依據(jù)[44]。

采用流動反應(yīng)系統(tǒng)完成多步合成的固定化酶技術(shù)已廣泛應(yīng)用于UDCA的工業(yè)化生產(chǎn)。填充床反應(yīng)器(PBR)是常用的一種固定化酶連續(xù)流動反應(yīng)器，環(huán)氧化功能化樹脂能通過共價結(jié)合方式，將UDCA生物合成所需酶類固定, 得到LDH-7α-HSDH@ES-103和7β-HSDH-GDH@ES-103。該工藝的流動化系統(tǒng)分為兩個模塊(圖3)，首先原料CDCA在NAD+依賴的LDH-7α-HSDH@ES-103的PBR中被氧化為7K-LCA，隨后7K-LCA在第二個模塊中的7β-HSDH-GDH@ES-103的PBR中被還原為UDCA，總反應(yīng)時長為12 h，產(chǎn)率接近100%，時空產(chǎn)率為88.5 g/L[45]。一般酶半衰期約為23 h，固定化酶技術(shù)在保持較高產(chǎn)率情況下，可使酶的半衰期延長至近2 w，并能多次使用。

圖3 從CDCA連續(xù)合成UDCA的級聯(lián)填充床反應(yīng)器示意圖

2.5 生物合成的局限性

盡管生物合成的產(chǎn)率較高，但在工業(yè)化生產(chǎn)上仍具有一定的局限性。首先，所用到的酶不穩(wěn)定(特別是7β-HSDH)，在反應(yīng)體系中會快速失活。其次，要想提高轉(zhuǎn)化率，必須增加酶的用量，而酶的來源是主要的限制性因素。此外，在底物承載量低的情況下，高濃度的底物會影響酶的活性。而涉及酶的生物催化反應(yīng)中，通常還存在酶的可回收性問題，由于生產(chǎn)過程中機械剪切的應(yīng)力和物理損失，均容易造成酶的損失，導(dǎo)致酶的回收率下降。上述問題是限制UDCA的工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的主要因素。此外，生物合成途徑中還會涉及到如何兼顧關(guān)鍵酶的表達條件和催化條件、評定微生物的致病性、額外凈化和無菌控制操作等其他問題[46-47]。目前生物催化底物負載量僅達到克級別，距離工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)還有相當距離，而在上述問題中，酶穩(wěn)定性差是最關(guān)鍵的限制因素，因此篩選發(fā)現(xiàn)新型穩(wěn)定高活性的相關(guān)酶類是該領(lǐng)域的研究重點，優(yōu)化反應(yīng)條件、提高底物負載量等是提高產(chǎn)率和降低成本的落腳點。

隨著近年來UDCA及其衍生物在肝膽疾病及腫瘤治療領(lǐng)域的不斷發(fā)展，UDCA的合成已經(jīng)取得突破性發(fā)展。目前UDCA化學(xué)合成法是大規(guī)模生產(chǎn)的主要方法，但受限于收率偏低、步驟繁瑣和環(huán)境不友好等因素，未能滿足市場需求。而生物合成法則因為轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、環(huán)保安全等優(yōu)點，將逐步成為當前制備UDCA的主流研究方向。伴隨著生物工程技術(shù)、多級酶聯(lián)反應(yīng)和固定化酶技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，限制其生物合成的種種壁壘將逐漸被突破。生物合成UDCA作為一種先進的生產(chǎn)方式，在促使生產(chǎn)過程向環(huán)境友好型轉(zhuǎn)化，降低成本，擴大收益，提高產(chǎn)品質(zhì)量，其市場和發(fā)展前景廣闊，開發(fā)潛能巨大。