郝 楠，郭 杰，陶 蕾

（蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

1 冬凌草甲素構(gòu)造修飾與抗癌活性

首先，是C（1）位（和）C（14）修飾。冬凌草甲素的結(jié)構(gòu)修飾位點(diǎn)很多，對C（1）-OH與C（14）-OH修飾是常使用的修飾模式之一，最簡易的C（1）-OH與C（14）-OH修飾是使用這兩大位點(diǎn)羥基活性的差別，通過氧化或和酰氯、酸酐等化學(xué)反應(yīng)完成修飾（Scheme 1）。比如冬凌草甲素直接C（14）位羥基乙?；?，得到化學(xué)物14-乙酰冬凌草甲素（2），通過C（1）位、C（14）位羥基雙乙酰獲得1,14-雙乙?；璨菁姿兀?）等。

在簡易修飾的前提下進(jìn)行深度修飾是常規(guī)的模式，一般以兩類模式呈現(xiàn)：首先，是通過冬凌草甲素或其派生物的C（14）羥基與含羥基的1結(jié)構(gòu)通過酯鍵相連（Scheme 2的的路徑A）；其次，是通過環(huán)形酸酐在在冬凌草甲素或其派生物的C（14）位先引進(jìn)一個(gè)羧基，再通過新引進(jìn)的羧基與含羥基或氨基的結(jié)構(gòu)以酯鍵或酰胺鍵相連（Scheme2的路徑B）。

冬凌草甲素較高級別的C（14）位修飾是在C（14）-OH以路徑A的模式引進(jìn)相異功能的基團(tuán)與藥成分，以構(gòu)成糅合體，通過協(xié)同效應(yīng)應(yīng)用于癌癥的救治中，呋咱氨氮藥物是NO供體，通過巰基還原排放氣態(tài)物分子NO。NO在生理診療方面有著多類功能，例如抗癌癥、抗炎癥、靜脈舒張等。對類巨噬細(xì)胞U937，NO通過調(diào)節(jié)自噬與催化NF-κB-COX-2-IL-1β的模式誘導(dǎo)冬凌草甲素引導(dǎo)自噬所強(qiáng)化的胞葬功能。所以，將冬凌草甲素與NO供體雜糅成一類新式的抗癌化學(xué)物是可行的。鑒于這種方略，Li等以路徑A模式在冬凌草甲素或其派生物C（14）位引進(jìn)呋咱氮氧成分，獲得化學(xué)物15a～15i、16a～16i與17a～17i。所得到的冬凌草甲素呋咱氮氧化學(xué)混合物在體外60min可以釋放較高質(zhì)量的NO，化合物15a～15i、16a～16i與17a～17i相較于冬凌草甲素（1）與1-氧代-冬凌草甲素（5），對四類癌癥細(xì)胞（K562、Bel-7402、MGC-803、Ca Es-17）都有了較強(qiáng)的抗增值活性，其抗增殖活性與NO釋放有關(guān)——NO釋放量大，抗增殖性就越佳。當(dāng)中化合物作用15 h時(shí)抗癌活性最佳，其對K562細(xì)胞IC50是1.82·mol/L，對MGC-803細(xì)胞的IC50是1.81·mol/L，對Bel-7402細(xì)胞的IC50是0.86·mol/L。

2 冬凌草作用機(jī)制問題

針對冬凌草甲素作用機(jī)制不確定的問題，還能夠在C（14）位引進(jìn)熒光基團(tuán)制備成冬凌草甲素的熒光探針進(jìn)行冬凌草甲素作用機(jī)制的研究。例如，Xu等使用模式設(shè)計(jì)制備了很多該種類化合物26a-26e、27a-27c，其中化合物作用26 d效果最好，此化合物能夠被腫瘤細(xì)胞迅速攝入，通常定位在線粒體，通過該模式佐證研究細(xì)胞色素C在冬凌草甲素誘導(dǎo)的線粒體介導(dǎo)調(diào)亡中有著極大意義。

3 冬凌草提取工藝與工藝優(yōu)化論述

3.1 冬凌草甲素比例測試

3.1.1 測試波長

精密稱取冬凌草甲素適度溶于95%乙醇中，定量稀釋為30 mg/L試液。以95%乙醇為空白做對照，于200～400 nm波長范疇內(nèi)完成紫外線掃描。

結(jié)果表明，此成分在238 nm波長范疇內(nèi)基本上被完全吸納，那么挑選其作為測試波長是可行的。

3.1.2 色譜環(huán)境

Diamonsil C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相甲醇—水分（55∶45）；測試波長是238 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫室溫；進(jìn)樣量20μL。在以上色譜環(huán)境中，冬凌草甲素保存用時(shí)是8.5 min，其色譜峰與鄰近物質(zhì)的離析度較好。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線描繪

稱取冬凌草甲素參照物10.0 mg，用95%的乙醇定容到50 mL，搖晃均勻，可以獲得200.00 mg/L參照物標(biāo)液。精密量適度，用甲醇-水（55∶45）定容到10 mL，搖晃均勻，獲得0.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程Y=24 562X-32 289（R=0.999 6），在10.0～80.0 mg/L范疇內(nèi)線性反應(yīng)最佳。

3.1.4 提取工藝優(yōu)化

冬凌草是一類資源充裕的藥食兩用的植被資源，是開發(fā)保健食品的理想原料，為高效使用，目前對其活性成分的提煉萃取藥理學(xué)進(jìn)行深入研究，并進(jìn)行開發(fā)制備及加工轉(zhuǎn)化商品工作。使用超高壓提煉冬凌草甲素的優(yōu)化統(tǒng)一條件是固液比達(dá)到1∶22、乙醇濃度達(dá)到75%、UHP用時(shí)4 min與UGP壓力達(dá)到320 MPa，甲素提取比例是0.322%，有著極大的發(fā)展?jié)撃堋?/p>

邁入21世紀(jì)以后，國際腫瘤病學(xué)界與新藥研究部門對冬凌草的抗癌功能極為重視，從全株植被分離獲得二萜類化合物、一些三萜、甾體、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸及其他類化學(xué)物。藥理研究表明，很多成分有著抗腫瘤功能、抗氧化功能、抗菌消炎、降血糖、抗突變、免疫等功能。研究表明，冬凌草中的三萜類成分熊果酸對多類惡性腫瘤細(xì)胞有抗增殖的效果。所以提取冬凌草中的熊果酸成分，對研發(fā)新藥與保健食品有著巨大的市場意義。目前對冬凌草內(nèi)冬凌草甲素等二萜類化合物提取研究很多，然而關(guān)于冬凌草內(nèi)熊果酸的提取研究進(jìn)展較慢，袁珂使用超臨界的二氧化碳技術(shù)提取冬凌草中的熊果酸，得率極高。

3.1.5 冬凌草優(yōu)化提取工藝的對比

中藥有效成分的傳統(tǒng)提取模式通常使用煎煮與回流提取工藝。目前超臨界流體提煉、超聲場強(qiáng)化、微波輔助等當(dāng)代分離技術(shù)也開始在中藥活性成分的提煉工作中使用。與傳統(tǒng)模式對比，使用當(dāng)代分離技術(shù)的提取工藝有著生產(chǎn)效果好、速率快、消耗小的特征。

冬凌草有著明顯的抑菌活性，是抑制食物腐蝕與病菌的優(yōu)質(zhì)資源。除Escherichia coli外，冬凌草乙醇提取物的抑菌圈內(nèi)徑都比山梨酸要大。冬凌草乙醇提取物對Staphylococcus aureus等4類常規(guī)的食物腐蝕病菌均有明顯的抑制效果，有著成為天然食物防腐劑的潛能。

當(dāng)前，冬凌草抑菌活性成分的提取工藝通常使用水提與醇提的傳統(tǒng)工藝。

而用當(dāng)代分離技術(shù)來提取冬凌草抑菌活性成分是在傳統(tǒng)的乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分工藝的基礎(chǔ)上以超聲場進(jìn)行強(qiáng)化，通過與乙醇回流提取與超聲提取的功效進(jìn)行比較，結(jié)果表明，超聲輔助乙醇回流提取工藝比乙醇回流提取工藝與超聲提取工藝效果更好，其抑菌圈內(nèi)徑增加到21.63 mm。并且，與直接用乙醇回流提取工藝相對比，超聲輔助乙醇回流提取工藝的提取用時(shí)從2 h減少到30 min。使用超聲輔助乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分是節(jié)省成本的模式，即有助于減少提取流程中的消耗，節(jié)省用時(shí)并且有助于節(jié)省溶液。

4 結(jié)語

綜上所述，由于冬凌草甲素對熱不穩(wěn)定，可以適度使用提取迅速、溫度偏低的超聲提取，該模式成本偏低，試液內(nèi)雜物色素很少，有助于后期純化。并且，其影響因素通常是提取用時(shí)、提取氣溫、液料比等，相對容易管控，重復(fù)性強(qiáng)，運(yùn)用柱層析融合重結(jié)晶法來純化冬凌草甲素有著極強(qiáng)的可操作性。