申紀(jì)饒，武小虎，張惠婷，李新圃，丁學(xué)智，嚴(yán)作廷，李宏勝

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所／農(nóng)業(yè)部 獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

奶牛乳腺炎是一種由機(jī)體、病原微生物和環(huán)境衛(wèi)生共同作用引起的奶牛常見(jiàn)病，發(fā)生范圍廣、發(fā)病率高，嚴(yán)重影響奶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［1］。全世界約有三分之一的奶?；加懈鞣N類(lèi)型的乳腺炎，而我國(guó)臨床型乳腺炎發(fā)病率高達(dá)33.41%，隱性乳腺炎陽(yáng)性率更高達(dá)46.4%～85.7%，均高于國(guó)外，給我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。

目前，獸醫(yī)臨床上主要采用抗生素防治奶牛乳腺炎，但抗生素的使用導(dǎo)致乳汁中的抗生素殘留和病原菌耐藥問(wèn)題加劇，不僅危害了奶牛的健康，同時(shí)也影響了人們對(duì)綠色食品的追求［3］。中藥以純天然、資源豐富、低毒、低殘留、藥效明確、不易產(chǎn)生耐藥性、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，成為未來(lái)研究防治奶牛乳腺炎藥物的發(fā)展方向［4］。

中藥方劑的篩選及作用機(jī)制的研究通常需要建立相關(guān)的疾病模型，使用奶?；铙w研究開(kāi)發(fā)新藥具有成本大、風(fēng)險(xiǎn)高且無(wú)法保證試驗(yàn)樣本同一性的問(wèn)題。而牛乳腺上皮細(xì)胞（bMEC）作為乳腺中唯一具有分泌功能的細(xì)胞，不僅是實(shí)現(xiàn)泌乳的基礎(chǔ)，而且是通過(guò)乳導(dǎo)管與外界接觸較緊密且具有免疫功能的細(xì)胞，是乳腺先天免疫的重要組成部分，與奶牛乳腺炎的發(fā)生有著密切聯(lián)系。bMEC廣泛分布在高度分支的乳腺實(shí)質(zhì)組織表面，其數(shù)量遠(yuǎn)多于其他參與抵御侵入病原菌的免疫細(xì)胞，在乳腺免疫中扮演重要角色，可以成為乳腺免疫的哨兵，它的免疫功能也因此受到人們的極大關(guān)注［5］。研究表明，bMEC可以表達(dá)多種細(xì)菌傳感器，即病原菌模式識(shí)別受體，可以識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，進(jìn)而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，釋放IL-8、IL-1β、IL-6、TNFα、IL-17A等炎癥介質(zhì)，進(jìn)行免疫防御［6-7］。由于bMEC的免疫特性，目前它已經(jīng)廣泛用于生理、病理、藥理等方面的研究，以及研究泌乳機(jī)制、乳腺炎發(fā)病機(jī)制和藥物篩選等，為奶牛乳腺炎的研究節(jié)約了成本、提高了效率。因此，文章就中藥防治奶牛乳腺炎的研究現(xiàn)狀、體外乳腺炎細(xì)胞模型的建立、中藥干預(yù)奶牛乳腺炎細(xì)胞模型研究進(jìn)展及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為奶牛乳腺炎的臨床防治找到一種有效的解決措施。

1 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)特性研究

從尊重生命和動(dòng)物福利考慮，在藥物研究初期應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和靶動(dòng)物的使用；同時(shí)也為了避免體內(nèi)試驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高、條件復(fù)雜且存在個(gè)體差異等諸多問(wèn)題，細(xì)胞試驗(yàn)成了研究者的首選。因此，建立乳腺上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系是開(kāi)展乳房炎致病機(jī)制研究及治療藥物篩選工作的基礎(chǔ)。

1.1 小鼠乳腺上皮細(xì)胞

劉玉輝等［8］通過(guò)采取妊娠后期的健康SPF昆明鼠的乳腺組織，經(jīng)膠原酶消化等一系列操作后成功分離到高濃度的小鼠乳腺上皮細(xì)胞，其形態(tài)呈鋪路石樣，細(xì)胞聯(lián)系緊密，間隙清晰。高云航等［9］采取孕中期的健康小鼠，選用混合酶經(jīng)差時(shí)消化法及傳代培養(yǎng)、分離、純化到鋪路石樣的乳腺上皮細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度高時(shí)呈島嶼狀生長(zhǎng)，密度低時(shí)各細(xì)胞的凸起和細(xì)胞外基質(zhì)形成拉網(wǎng)狀結(jié)果。易瓊等［10］利用改良過(guò)的混合酶（采用Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶混合（1∶1∶1））及差速貼壁法純化培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，72 h后細(xì)胞完全鋪開(kāi)，呈典型的鋪路石樣。免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，角蛋白18呈陽(yáng)性反應(yīng)。方彧聃等［11］利用慢病毒載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)牛催乳素的小鼠乳腺上皮細(xì)胞系，為體外研究乳腺生物反應(yīng)器提供了良好的細(xì)胞模型。劉玉輝等［8］培養(yǎng)的傳代小鼠上皮細(xì)胞雖出現(xiàn)鋪路石樣外觀，但細(xì)胞間隙大，排列不規(guī)則。

1.2 牛乳腺上皮細(xì)胞

利用牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行奶牛乳房炎的體外研究試驗(yàn)更具可靠性。目前關(guān)于牛乳腺上皮細(xì)胞的獲取有分離原代細(xì)胞和建立細(xì)胞系兩種方式。

盧金霞等［12］采用組織塊培養(yǎng)法和乳汁分離法分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，利用差時(shí)胰酶消化法純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞，通過(guò)測(cè)細(xì)胞核型及骨架蛋白-角蛋白，對(duì)分離的牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果在顯微鏡下觀察可見(jiàn)，純化的乳腺上皮細(xì)胞為典型上皮細(xì)胞形態(tài)，呈多角形或乳滴形，細(xì)胞核型正常，細(xì)胞特異性蛋白-角蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，成功建立了奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型。馬鵬睿［13］應(yīng)用組織塊種植法和胰酶消化法分離培養(yǎng)牛乳腺上皮細(xì)胞，鑒定為牛乳腺上皮細(xì)胞，為后續(xù)黏附素ClfA、EfB及FnBPA的抗體對(duì)金黃色葡萄球菌黏附牛乳腺上皮細(xì)胞的抑制試驗(yàn)建立了基礎(chǔ)。董海龍等［14］通過(guò)組織貼塊法取部分奶牛乳腺組織進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)免疫熒光鑒定、形態(tài)學(xué)觀察、掃描電鏡和透射電鏡檢測(cè)原代乳腺上皮細(xì)胞特性，結(jié)果顯示，分離到的牛乳腺上皮細(xì)胞呈鵝卵石樣，呈單層聚集，細(xì)胞狀態(tài)良好，培養(yǎng)至15代以上細(xì)胞增殖仍旺盛，可以作為奶牛乳腺相關(guān)研究重要工具。李勝利等［15］建立了一種單層致密奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，通過(guò)該方法，細(xì)胞能形成橋粒和緊密連接，為多種與奶牛乳腺相關(guān)的試驗(yàn)研究提供了體外細(xì)胞模型。

隨著目前研究的深入，學(xué)者們不僅使用原代細(xì)胞進(jìn)行研究，還旨在建立永生化的牛乳腺上皮細(xì)胞系。最常用的永生化方法包括病毒法、人端粒酶催化亞基法、引入癌基因或通過(guò)放射因素干擾細(xì)胞的衰老進(jìn)程，損害其衰老機(jī)制，最終使細(xì)胞獲得永生能力［16］。B.Zavizion等［17］利用SV40LTA轉(zhuǎn)染至原代牛乳腺上皮細(xì)胞，從而建立了細(xì)胞系。這種細(xì)胞系表現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞特征，能穩(wěn)定表達(dá)角蛋白、微絨毛、特殊乳白蛋白等。胡菡［18］通過(guò)一種攜帶SV40大T抗原基因的病毒感染原代牛乳腺上皮細(xì)胞，使其永生化，這種細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳代到50代并具有上皮細(xì)胞標(biāo)志特征。He X.Y.等［19］通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因建立了一種自發(fā)永生化的牛乳腺上皮細(xì)胞系，該細(xì)胞與原代細(xì)胞有同樣的基本特征。這些細(xì)胞系的建立為奶牛乳腺炎的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2 牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型的建立

體外建立乳腺炎細(xì)胞模型不僅是研究細(xì)菌感染乳腺炎的基礎(chǔ)，還可利用此模型進(jìn)行藥物篩選。病原微生物對(duì)細(xì)菌的感染主要分為革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌，脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌的主要成分，可被Toll-4受體識(shí)別，而脂磷壁酸（LTA）是革蘭氏陽(yáng)性菌致病的主要成分，可被Toll-2受體識(shí)別，二者均可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞模擬細(xì)菌感染。因此，分別對(duì)細(xì)菌及LPS和LTA誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥模型進(jìn)行綜述。

2.1 革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)

LPS是革蘭氏陰性菌的主要成分，可以模擬革蘭氏陰性菌感染。利用LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞建立模型，具有方便易得、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，有助于深入研究該病的發(fā)病機(jī)制。郝俊芳等［20］以1，5，10μg／mL LPS處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，LPS刺激后小鼠乳腺上皮細(xì)胞與炎癥相關(guān)的mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。Xiao H.B.等［21］用LPS處理小鼠及離體乳腺上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，脂多糖在小鼠乳腺炎體內(nèi)外模型中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并提示NF-κB通路和OPN參與其中。在利用山羊乳腺上皮細(xì)胞建立模型方面也有文獻(xiàn)報(bào)道。O.B.Javier等［22］用1μg／mL LPS侵染山羊乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果CCL2、CXCL6、IL6、CXCL8、PTGS2、IFIT3、MYD88、NFKB1和TLR4的表達(dá)增加，該研究結(jié)果使人們對(duì)LPS刺激損害山羊乳腺組織的潛在機(jī)制有了一個(gè)基本的認(rèn)識(shí)。

由于利用奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有同源性，更受到學(xué)者們的認(rèn)可。張文耀等［23］利用LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行侵染，選用TNF-α作為建立乳腺炎細(xì)胞模型的指標(biāo)，設(shè)置LPS濃度梯度0，5，10，20 ng／μL以確定最適濃度，然后根據(jù)推薦處理時(shí)間設(shè)置0，3，6 h，篩選最適濃度下能夠明顯上調(diào)TNF-α的最短處理時(shí)間作為建立模型的處理時(shí)間。結(jié)果顯示，在0～10 ng／μL濃度范圍內(nèi)，LPS作用乳腺上皮細(xì)胞3 h，TNF-α基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平隨LPS處理濃度的增高而增加。安東等［24］利用0，1，10，100μg／mL LPS分別處理細(xì)胞6，12，24 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)TNF-α的表達(dá)量。結(jié)果顯示，LPS處理后TNF-α、IL-6、BNBD-5表達(dá)量增加，確定炎癥模型建立成功。

由于大腸桿菌是目前引起奶牛乳腺炎的最主要革蘭氏陰性菌，因此，為了更加真實(shí)地建立乳腺炎細(xì)胞模型，目前大多數(shù)學(xué)者還以大腸桿菌為研究對(duì)象。盧勁曄等［25］利用大腸桿菌侵染小鼠乳腺上皮細(xì)胞，大腸桿菌刺激原代培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞后TLR-4和MyD88蛋白表達(dá)顯著升高，乳腺上皮細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β的表達(dá)及活性氧（ROS）的釋放均顯著升高，成功建立了細(xì)胞炎癥模型。于亞娟等［26］用熱滅活的大腸桿菌作用于牛乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能促進(jìn)TLR2和TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平具有劑量和時(shí)間依賴性。Gu N.J.等［27］用熱滅活的大腸桿菌（E.coli）感染原代牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)幾乎所有編碼炎癥趨化因子相關(guān)基因被顯著激活，其中包括白細(xì)胞介素、β-防御素、血清淀粉樣蛋白A和觸珠蛋白相關(guān)的基因。

2.2 革蘭氏陽(yáng)性菌誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型

LTA是革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的重要成分，能激發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)［28］。利用LTA刺激乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥模型，可以模擬革蘭氏陽(yáng)性菌感染，有利于深入研究革蘭氏陽(yáng)性菌在奶牛乳腺炎中的致病機(jī)制。

張文耀等［23］以0，1，10，20，40 ng／μL濃度梯度、以0，3，6，12，24 h時(shí)間梯度處理細(xì)胞，結(jié)果表明，20 ng／μL的LTA處理上皮細(xì)胞12 h可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答，為體外建立LTA誘導(dǎo)奶牛乳腺炎細(xì)胞模型的最適條件。Y.Strandberg等［29］用LTA誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-8、TNF-α、CXCL6和β-防御素mRNA表達(dá)顯著增加，TLR2通路被激活。Wu Y.等［30］和A.A.I.Arbab等［31］在其研究中也有類(lèi)似觀點(diǎn)。

在革蘭氏陽(yáng)性菌方面，目前研究最多而且比較成功的主要是金黃色葡萄球菌，該菌是引發(fā)奶牛乳腺炎最常見(jiàn)的病原微生物之一，目前的大多數(shù)研究也以此為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行深入研究。H.Lahouassa等［32］將金黃色葡萄球菌與乳腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，在感染后3，10，24 h測(cè)定相關(guān)炎性因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未感染的乳腺上皮細(xì)胞相比，感染3 h后的細(xì)胞表達(dá)了更多的IL-1β、TNF-α、IL-8和GRO-α等炎癥因子。崔新潔等［33］用金黃色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能刺激細(xì)胞表達(dá)IL-1β及TNF-α。趙凌等［34］發(fā)現(xiàn)，不同濃度純化的金黃色葡萄球菌液感染牛乳腺上皮細(xì)胞后，細(xì)胞因子表達(dá)呈上升趨勢(shì)，其受體表達(dá)呈下降趨勢(shì)，并誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。該試驗(yàn)利用金黃色葡萄球菌進(jìn)行體外感染試驗(yàn)，為因革蘭氏陽(yáng)性菌感染而導(dǎo)致乳腺炎的致病機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

3 中藥防治奶牛乳腺炎的研究現(xiàn)狀

中藥的藥理作用眾多，兼具抗病毒［35］、抗菌感染［36］。抗腫瘤和提高免疫力［37］等多種藥理作用。中藥能夠減小炎癥對(duì)機(jī)體的損傷，阻礙炎癥的發(fā)生發(fā)展，對(duì)炎性介質(zhì)的分泌具有重要影響。在奶牛疾病臨床上，不同劑型的多種中藥配方用于治療奶牛乳腺炎取得了顯著的效果［38］。

朱永平［39］利用金銀花、紫花地丁、蒲公英等制成中藥方劑對(duì)患乳腺炎的116頭奶牛進(jìn)行治療，其中治愈99例，好轉(zhuǎn)12例，有效率達(dá)95.7%，且產(chǎn)奶量提高了9.2%。白冬冬等［40］用地膚子、蒲公英等制備的地膚通乳散治療奶牛乳腺炎，通過(guò)臨床試驗(yàn)進(jìn)行療效觀察，結(jié)果顯示，地膚通乳散對(duì)奶牛乳腺炎的治愈率和有效率分別高達(dá)63.16%和89.47%。范才良等［41］制備的一種內(nèi)服中藥蒲金散對(duì)奶牛乳腺炎的治療具有良好效果，同時(shí)兼具提高產(chǎn)奶量的作用。據(jù)報(bào)道，利用中藥和西藥對(duì)患乳腺炎奶牛進(jìn)行對(duì)比治療研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療總有效率高于抗生素治療［1］。不同劑型的中藥對(duì)奶牛乳腺炎的防治也顯示出良好的治療效果，例如透皮劑［42］、軟膏劑［43］和灌注劑［44］等。

4 中藥干預(yù)奶牛乳腺炎細(xì)胞模型及其作用靶點(diǎn)研究進(jìn)展

中藥會(huì)破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，還能使細(xì)菌的代謝活動(dòng)紊亂，從而起到殺菌作用。中藥具有顯著的抗炎作用，對(duì)臨床型乳腺炎和隱形乳腺炎的防治提供了科學(xué)依據(jù)。目前的研究表明，中藥干預(yù)奶牛乳腺炎細(xì)胞模型，主要是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活化，降低下游炎性因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

Liang D.J.等［45］研究百里香酚對(duì)LPS刺激小鼠乳腺上皮細(xì)胞的抗炎作用，結(jié)果表明，百里香酚能明顯抑制LPS刺激的小鼠乳腺上皮細(xì)胞中TNF-α和IL-6的生成，iNOS和COX-2的表達(dá)也隨百里香酚劑量的增多而下降；此外，百里香酚阻斷了LPS刺激的mMECs中IκBα、NF-κBp65、ERK、JNK和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化。說(shuō)明百里香酚通過(guò)干擾NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活，在LPS刺激的乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用。Liu M.J.等［46］驗(yàn)證咖啡酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的原代牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抗炎特性，并闡明可能的潛在機(jī)制，結(jié)果表明，咖啡酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的bMEC炎癥損傷的保護(hù)作用是通過(guò)減少NF-κB途徑中NF-α降解和p65磷酸化介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生而得以實(shí)現(xiàn)。Yang W.H.等［47］研究了黃芩苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，細(xì)胞活力下降，p-p65／p65和p-IκBα／IκBα比值上升，TNF-α和IL-1β的表達(dá)增加，而用黃芩苷處理后能抑制NF-κB的激活和HSP7上調(diào)，減輕LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥和凋亡。Wang J.J.等［48］研究了桑色素對(duì)脂多糖刺激原代牛乳腺上皮細(xì)胞的抗炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑色素以劑量依賴性的方式抑制LPS刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因表達(dá)，得出桑色素對(duì)LPS誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用可能與其抑制NF-κB／MAPK信號(hào)通路有關(guān)。S.Kang等［49］為確定植物皂苷是否能減輕LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)程度，先用植物皂苷預(yù)處理細(xì)胞，然后再用LPS處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)減弱了LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化和超氧物的產(chǎn)生，下調(diào)了環(huán)氧合酶2（COX-2）的表達(dá)。

除此之外，Miao J.F.等［50］探討了?；撬釋?duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞功能損害的保護(hù)和抗炎作用，他們發(fā)現(xiàn)?；撬峥擅黠@抑制LPS誘導(dǎo)的NAGase活性、NO濃度升高及TNF-α、IL-1β、IL-6和LF水平的升高，45 mmol／L?；撬犸@著增加了LPS誘導(dǎo)的功能失調(diào)的β-酪蛋白分泌。結(jié)果表明，?；撬峥娠@著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子釋放，增加乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白，為?；撬釋?duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞功能障礙的保護(hù)作用提供了可能的解釋。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥作用LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞模型的研究較為廣泛，但是對(duì)于中藥作用LTA誘導(dǎo)的細(xì)胞模型相關(guān)報(bào)道還較為稀缺。孫靜等［51］用40μg／mL LTA處理乳腺上皮細(xì)胞24 h后建立了炎癥損傷模型，并從10味中藥中篩選到5種對(duì)奶牛乳腺炎致病菌具有較好抑制作用的中藥，組成配方作用于炎性細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該組方對(duì)炎性損傷具有一定保護(hù)作用，對(duì)促炎性因子基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。此外，還有一些研究直接針對(duì)由金黃色葡萄球菌刺激牛乳腺上皮細(xì)胞引起的細(xì)胞炎癥。Wang K.等［52］的研究表明，中國(guó)蜂膠可以防止由金黃色葡萄球菌引起的牛乳腺上皮細(xì)胞活力受損，下調(diào)細(xì)胞炎癥因子（IL-1β、TNF-α）的表達(dá)。Zhang J.L.等［53］發(fā)現(xiàn)，連翹苷A可以干擾由金黃色葡萄球菌引起的NF-κB和MAPKs信號(hào)通路的激活，在金黃色葡萄球菌刺激的牛乳腺上皮細(xì)胞中具有抗炎作用。

5 前景及展望

由于奶牛乳腺的特殊生理結(jié)構(gòu)，易受病原微生物的入侵而發(fā)生炎癥，細(xì)菌侵入乳腺上皮細(xì)胞是建立乳腺內(nèi)感染的重要一步［22］。隨著抗生素耐藥性逐年增加，以及抗生素難以進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，導(dǎo)致其對(duì)病原菌導(dǎo)致的奶牛乳房炎治療效果降低，使得乳腺炎反復(fù)發(fā)作，難以根治［54］。中草藥含有多種生物有效成分，對(duì)奶牛疾病預(yù)防和治療效果良好，不良反應(yīng)小，幾乎無(wú)殘留、無(wú)抗藥性、對(duì)乳制品無(wú)副作用，作為奶牛乳腺炎的治療藥物克服了抗生素的某些不足，在防治奶牛乳腺炎方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，通過(guò)中藥治療主要通過(guò)TLR2／4與NF-κB信號(hào)通路降低炎性因子的表達(dá)。NF-κB是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rel家族成員之一，是信號(hào)傳導(dǎo)通路的聚集點(diǎn)，在調(diào)節(jié)炎癥和對(duì)外來(lái)刺激免疫應(yīng)答方面起著重要作用，NF-κB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因上的特定位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而導(dǎo)致大量具有致熱活性炎性因子的合成和釋放，主要有TNF-α、IL-1β、IL-6等。中藥對(duì)乳腺上皮細(xì)胞作用抑制TLR2／4與NF-κB通路的激活，從而抑制炎癥因子的表達(dá)，由此增加細(xì)胞活力，抵御病原微生物對(duì)奶牛乳腺的侵襲，達(dá)到防治奶牛乳腺炎的目的。目前的研究主要集中于單種中藥成分對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的作用，對(duì)中藥組方的研究還比較罕見(jiàn)，對(duì)未來(lái)利用中藥組方防治奶牛乳腺炎、相互配伍取得更好療效值得期待。