劉玉峰，許肈初，馬海燕

(1.遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省天然產(chǎn)物制藥工程技術研究中心，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

中藥現(xiàn)代化研究的內(nèi)容包括：有效成分篩選及新藥研發(fā)、中藥作用機理研究、中藥復方研究、中藥質(zhì)量控制及安全性評價、中藥基因組學研究和藥效變化等諸多方面.由于中藥活性成分的復雜性、作用靶點的多樣性及產(chǎn)地差異性，造成常規(guī)化藥評價標準及提取分離和活性篩選不僅效率低、成本高，而且還存在活性成分易丟失，純度與活性背離的難題[1]，因此快速分析中藥微量活性成分，高通量研究全組分作用靶點，區(qū)分與治療無關或毒性組分成為了解決難題的關鍵.利用高通量生物芯片技術可以在有限的實驗條件下獲得極為大量的生物信息，使研究工作的效率得到極大的提高，受到科學界的重視.生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片、細胞芯片、組織芯片以及其他多種由生物材料制成的芯片[2].由于根據(jù)網(wǎng)絡藥理學理論所有藥物都是通過直接或間接修飾或改變?nèi)梭w基因及基因產(chǎn)物產(chǎn)生作用[3]，因此利用基因芯片技術分析藥物活性成分影響基因表達多態(tài)性變化就成為了解決中藥活性成分研究難題的重要思路之一.

基因芯片(Gene chip)又稱DNA微陣列，由美國Affymetrix公司的Fodors等[4]在20世紀90年代初提出并研究，是專門用于核酸檢測的生物芯片.經(jīng)過近30年的發(fā)展，基因芯片作為高度集成化的分析和研究手段正成為進行藥物基因組學研究的主要平臺[5-6].基因芯片解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術操作繁瑣、樣品測定周期長、操作測定效率低等不足，其是將大量分子探針附著固定于載體支持物上，可以單次對樣品的大量基因序列進行檢測分析.根據(jù)實際情況具體設計探針系列，選擇具有針對性的分析檢測方法，可極大地擴展此技術的應用范圍，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等[7-10].而要與基因微陣列上的已知序列雜交，就要先通過聚合酶鏈式反應擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術針對樣品DNA/RNA摻入標記分子，再通過化學熒光法、同位素法、酶標法或化學發(fā)光法檢測雜交信號強度，利用計算機軟件進行數(shù)據(jù)比較、綜合分析，即可獲得樣品中大量的基因序列或表達特征信息[11].

盡管中醫(yī)中藥在中國已有幾千年的歷史，但缺乏高質(zhì)量的科學證據(jù)來證明其有效性[12].因此，西方醫(yī)學經(jīng)常以懷疑的眼光看待中醫(yī)學，這給中醫(yī)中藥走向國際帶來了巨大的困難[13].中藥成分復雜多樣，加上傳統(tǒng)的研究手段存在許多局限，這給中藥的深入研究帶來了很大困難.在分子生物學領域中高通量基因芯片技術作為一種研究分析基因信息的強有力的技術，可成為進行表達中藥基因組學研究結(jié)果的主要工具[14].當今人們長期以來對中藥的認識層次與研究手段的基本保持在低效、低通量，而通過中藥基因組學研究開發(fā)的中藥基因芯片，從分子水平上研究中藥的最新技術手段，將從根本上改變這種觀念[15].用于基因表達分析的基因芯片可根據(jù)其應用分為全局和聚焦DNA微陣列兩種類型[16-17]，可用于有效成分篩選[18]、作用機制[19]、中藥復方[20]、質(zhì)量控制及安全性評價[21].全局的DNA微陣列含有數(shù)千至數(shù)十萬個探針，代表部分或全部cDNA，表達序列標簽(EST)和各種類型的表達標記，例如用于估計細胞內(nèi)mRNA拷貝數(shù)的芯片.聚焦的DNA微陣列含有幾十到數(shù)千種針對特定目的設計的探針，例如組織/細胞類型特異性，功能特異性和表達譜分析的研究.當已知作用時，聚焦的DNA微陣列有時更適合于研究作用機制，例如化學品的風險評估和癌癥轉(zhuǎn)移風險的預測[22].

近年來，國內(nèi)外已有一些將基因芯片技術應用到中藥研究的報道[23-24].基因芯片技術是中藥研究領域中一次具有深遠意義的改革，具有極廣的發(fā)展擴張性與應用深度，為中藥現(xiàn)代化的發(fā)展提供了新途徑.

1 中醫(yī)傳統(tǒng)思維

中醫(yī)思維可從“道生一，一生二，二生三，三生萬物”的角度去理解[25].在中醫(yī)的視角中萬物普遍聯(lián)系為一個整體，從人體的角度講，人體每個局部都是一個整體，而不是局部組成了整體，不是局部和局部的聯(lián)系，是運動中發(fā)展聯(lián)系的變化.而要論貫穿疾病的產(chǎn)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、預后整個全過程的本質(zhì)即為辯病論治，其為中醫(yī)本質(zhì).

因此治法可分為“同病異治”和“異病同治”[26].這個思想在臨床中的體現(xiàn)即為著重對患者的癥狀特點、體質(zhì)差異，個性化治療入手強調(diào)辨證施治.基因蛋白調(diào)控與修飾整體的變化可以從微觀角度反映著生命機體的整體功能狀態(tài)，疾病在特定證候的本質(zhì)可以通過基因轉(zhuǎn)錄和蛋白整體水平的變化得到反映了.在體內(nèi)紛繁復雜的序列利用基因芯片技術可以高效準確的找到藥物作用靶序列，這在中藥現(xiàn)代化研究中極為重要.而面向生物體全遺傳組層面上的藥物作用分析是基因芯片應用的一個重要領域，由于藥物作用于機體疾病的整個過程具有非單一性，從其經(jīng)過藥劑相、藥代動力學相及藥效相中可知藥物在進入體內(nèi)吸收分布代謝排泄及產(chǎn)生藥效的過程大多需要經(jīng)過不同體內(nèi)屏障及發(fā)生多次結(jié)構變化，基因芯片能夠通過對上萬個基因信息的檢測分析，從中獲取大量有用的理論依據(jù)，從而對中藥產(chǎn)生的復雜作用機制提供科學合理的解釋，因此利用基因芯片技術對整個藥物干預疾病過程中基因表達改變進行監(jiān)控是具有得天獨厚的優(yōu)勢，之后對藥效進行評價，為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥方劑具有系統(tǒng)調(diào)節(jié)的治療作用提供一定的科學依據(jù).

2 中藥作用機制研究

從分子水平看，中藥有效成分與生物大分子即藥物靶點發(fā)生相互作用才能發(fā)揮藥效.而由于中藥內(nèi)化學成分復雜性及多樣性等特點，其作用機制復雜多樣，治療疾病時可產(chǎn)生多通路、多靶點、多系統(tǒng)的聯(lián)合干預作用[27].傳統(tǒng)的作用機制研究方法需要對每個樣品進行測試，而且操作繁瑣，很難達到從整體生物學角度探討藥物的作用機制，這給中藥作用機制研究帶來了很大的困難[28].

利用基因芯片技術通過比較在有無藥物作用的條件下正常與病變組織(細胞)基因表達水平的變化，從而發(fā)現(xiàn)疾病相關基因，并以此基因作為中藥篩選靶標.基因芯片技術將中藥作用機制研究引向全新的深度.鄭冬雪、劉津源等[29]在研究基于micRNA表達譜分析加味桂枝茯苓丸干預大鼠子宮肌瘤的分子機制中，利用大鼠miRNA單通道表達譜芯片對保存的大鼠子宮組織中CyDye與RNA進行檢測采用NanoDrop ND-1000法，基于R語言，BRB語言對歸一化數(shù)據(jù)進行差異表達基因分析.Real-time PCR驗證芯片，結(jié)果顯示加味桂枝茯苓丸對子宮肌瘤大鼠micRNA基因芯片表達有明顯的影響，綜合分析芯片生物學信息與模型組相比，中藥各組分別有上調(diào)、下調(diào)的micRNA差異基因，這些micRNA差異基因共同構成了加味桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤大鼠的差異micRNA基因表達譜.各組間miR-187-3p、miR-330-5p表達的變化證實了基因芯片結(jié)果的可靠性.靶基因功能富集通路分析得出4條與子宮肌瘤密切相關的信號通路提示加味桂枝茯苓丸對子宮肌瘤的治療機制涉及多種生物學信息信號傳遞及基因調(diào)控的改變，提示加味桂枝茯苓丸有可能通過上調(diào)或下調(diào)相關的miRNA通過實時PCR顯示基因陣列的結(jié)果可靠，綜上所述，子宮肌瘤是個多因素參與、多路徑調(diào)節(jié)的復雜過程.加味桂枝茯苓丸治療子宮肌瘤的分子機制可能與影響了不同信號通路的miRNA表達有關，其具體機制仍有待進一步研究.

此外，基因芯片技術也較為廣泛應用在抗心血管[30]，抗腫瘤[31]，抗抑郁[32]疾病藥理作用機制研究中.十全大補湯是由10種草藥制成的中藥制劑，是一種營養(yǎng)劑，具有改善體內(nèi)平衡紊亂和失衡的作用.此外，它還被證明具有抗腫瘤作用[33]，經(jīng)常被臨床醫(yī)生用作癌癥患者的替代藥物.Zheng Hua-Chuan等[34]通過基因芯片科學闡明了中藥十全大補湯的抗腫瘤作用和潛在的機制.基因芯片技術的應用不僅為研究新基因的功能提供了新思路，而且為中藥作用機制研究開拓了新的技術平臺.

3 中藥新藥研發(fā)及有效成分的篩選

新藥的開發(fā)一般過程是根據(jù)疾病的發(fā)病機理，確定藥物作用的靶點，建立相應的新藥篩選模型，篩選不同來源的化合物，發(fā)現(xiàn)先導化合物，然后將其開發(fā)成新藥[35].而中藥特別是復方制劑其成分復雜多樣，多種成分之間可能存在協(xié)同作用[36]，而傳統(tǒng)的新藥開發(fā)分析方法大多只是通過物理或化學方法進行分析某一組分或某一藥理作用(生物堿、黃銅、皂苷等)通過細胞或動物模型等非臨床研究手段進行藥效藥代毒理實驗，忽視了多種成分之間產(chǎn)生的多重作用及中藥整體觀.此外，許多有效成分以微量形式存在，傳統(tǒng)的分析技術難以篩選，這些都阻礙了中藥新藥研發(fā)的進程[15].因此，建立先進的研究手段是解決這類問題的必經(jīng)之路，而基因芯片在中藥研究領域的應用為中藥有效成分研究提供了新方向.從基因水平來看，中藥發(fā)揮其治療效果就是通過對基因的表達調(diào)控起作用，從而調(diào)節(jié)機體部分或整體機能[37].基因芯片通過顯示藥物作用細胞組織的靶序列進行分析比較用藥前后整個機體不同組織、器官的基因表達差異，并可實現(xiàn)實時監(jiān)控藥物調(diào)控細胞基因表達變化，從眾多中藥成分中快速篩選中藥有效成分的目的.

目前基因芯片技術在中藥有效成分篩選的應用正處在研究階段，已有利用基因擴增技術發(fā)明出篩選對治療或預防白癜風有效藥物的方法，利用患者皮膚細胞用藥前后基因擴增產(chǎn)物與正常皮膚細胞基因的電泳圖進行比較分析，即可實現(xiàn)有效藥物的篩選[38].此方法需要嚴格控制電泳條件，可能存在誤差，可將疾病基因組摻入標記分子后，與正?；蛐酒s交，通過檢測雜交信號強度，經(jīng)數(shù)據(jù)比較分析后，可更加準確地篩選出有效藥物.此外，Watanabe等[39]通過應用高密度寡核苷酸微陣列來分析銀杏提取物對小鼠的皮層和海馬的轉(zhuǎn)錄效應的影響，通過研究基因表達得知銀杏提取物對神經(jīng)元酪氨酸/蘇氨酸磷酸酶1和微管相關的mRNA轉(zhuǎn)錄表達增強了3～4倍.全基因組表達監(jiān)測在研究復雜提取物的生物學作用方面，可以從cDNA表達數(shù)據(jù)庫中得到的肽庫中制作肽芯片，從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)[15].在國內(nèi)，已有利用基因芯片從知母中篩選得到了23種有效成分的報道[40].

4 中藥復方研究

中藥復方配伍的研究是中藥現(xiàn)代化研究的又一關鍵科學問題.在中國，中藥復方具有數(shù)千年的臨床研究經(jīng)驗，形成了許多古老的中醫(yī)藥理論，如“升降浮沉”、“君臣佐使”等配伍理念均為我們所熟知，但其科學闡述一直是中藥研究領域的難點[41].

利用基因芯片技術比較復方給藥或單一有效成分給藥前后組織基因表達水平的變化，可從分子調(diào)控水平分析復方中藥的配伍作用情況.呂琳星等[42]利用基因芯片技術比較新雙龍方及其兩種有效成分人參總皂苷和總丹酚酸對急性心肌梗死大鼠的藥理作用機制.通過大鼠全基因組表達譜芯片篩選出給藥前及配伍藥與單組分給藥后的差異表達基因(Ratio>2或<0.5采用).結(jié)果表明，新雙龍方與2種有效組分對心梗大鼠基因表達的影響不同，復方比組分的療效更好，涉及更多通路，具有更積極的調(diào)控作用，從而證實了復方新雙龍方的配伍優(yōu)勢.

清開靈的主要由梔子苷、黃芩苷組成，其配伍主要具有干預腦缺血損傷的作用，荊志偉等[43]通過基因芯片技術從16 463個小鼠腦測全基因組表達譜篩選出了32個差異表達的細胞黏附相關基因.通過對比結(jié)果顯示梔子苷、黃芩苷及其配伍均能有效干預細胞黏附相關基因，但配伍后對細胞黏附相關基因干預能力大于單一組分，即配伍的整體療效高于單一組分.這與該課題組前期的藥效學(行為學、形態(tài)學)研究結(jié)果是一致的[44].用基因理論解釋中醫(yī)藥理論，增加國際對中藥復方的認可度，為中藥的國際化發(fā)展提供理論保障.

5 中藥質(zhì)量控制與安全性研究

確保中藥的質(zhì)量與安全，是保證中醫(yī)臨床用藥安全有效及可持續(xù)發(fā)展的前提.中藥質(zhì)量控制是能夠準確地鑒別中藥材，常采用形態(tài)觀察、化學成分分析等方法，簡便易行[45].但中藥復方成分復雜，應用常規(guī)方法很難準確地鑒別其藥用組分.可將基因芯片與從正品中藥中得到的DNA雜交，得到標準基因圖譜，與待鑒定中藥的基因圖譜比較分析即可達到鑒定的目的.

21世紀初，基因芯片首次被用于中藥鑒定[46]，這為破碎藥材、近緣相似種、炮制藥材及貴重藥材等的鑒別鑒定開辟了新道路.Tsoi等[47]將來自不同種屬貝母基因組DNA中的26SrDNA基因D2與D3區(qū)的多態(tài)性片段進行擴增和測序，然后將其特異性寡核苷探針點固定在芯片上，制成基因芯片.用來自不同種屬的熒光標記的與芯片雜交，不同種屬的貝母將檢測出不同的熒光信號，即可對貝母進行快速的種屬鑒別與質(zhì)量控制，史亞等[48]利用基因芯片技術研究考察了11種常見的中藥飲片攜帶微生物情況，初步建立的中藥飲片微生物基因庫，檢測包括真菌、細菌、病毒三類，檢出174類微生物，其中不乏致病微生物，中藥飲片中存在微生物污染情況，需要開展更深入的風險評估工作，完善中藥飲片微生物數(shù)據(jù)庫信息，保障中藥飲片的用藥安全.

Carles等[49]設計并制作了一種DNA芯片，用于鑒定有毒的中藥材.將來自烏頭、海芋、巴豆、曼陀羅、紫花曼陀羅、六角蓮等18種有毒中藥材的5SrRNA中的特異性寡核苷酸探針通過二硫醇鍵將探針固定在硅芯片上.擴增基因組靶序列并通過不對稱聚合酶鏈反應進行熒光標記，通過平行基因分型鑒定多種有毒物種，這說明基因芯片是用作中藥材的質(zhì)量控制和安全監(jiān)測的廉價且快速的工具.值得注意的是，中藥的藥效成分大多是其次生代謝產(chǎn)物，基因芯片只能鑒別中藥的真?zhèn)味荒軐ζ鋬?yōu)劣進行鑒定，不能取代中藥化學成分指紋圖譜等的鑒定[50].

近年來，中藥的安全性評價是中藥現(xiàn)代化領域國內(nèi)外探討的熱點問題.中藥進入國際市場通常需要提供安全性研究報告，因此，中藥毒性的快速評價與篩選是中藥研究領域亟待解決的問題[51].傳統(tǒng)的藥理毒理研究方法很難進行較全面的評價，而且對于慢性毒性和不良反應，傳統(tǒng)研究方法耗時長，需要大量人力物力，而且某些毒性和不良反應可能檢測不到[52].利用基因芯片技術將中藥的毒副作用與基因表達特征聯(lián)系起來，通過基因的表達分析即可確定藥物的毒性.1999年美國國家環(huán)境健康科學研究所(NIEHS)研究人員成功開發(fā)了基于基因組和DNA微陣列技術開發(fā)的分子生物學技術ToxChip，應用于確定天然和合成化合物的相對安全性，它將能夠讓科學家在分子水平上評估外來毒物的毒性，該技術對傳統(tǒng)毒理學具有革命性意義[53-54].

6 中藥基因組學的研究

中藥基因組學是進行中藥有效成分篩選、復方制劑研究、中藥質(zhì)量控制與安全性研究以至于中藥基因芯片構建的基礎與重要依據(jù).

該學科是從基因組水平研究中藥及其對人體作用的一門前沿學科，利用組學技術研究中藥基原物種的遺傳信息及其調(diào)控網(wǎng)絡，闡明中藥防治人類疾病的分子機制[55]，長期以來傳統(tǒng)中藥的應用主要研究方向集中在形態(tài)識別、化學物質(zhì)基礎揭示、藥效作用分析、資源調(diào)查、人工栽培等方面[56]，但就更深層次的從分子生物學基因?qū)用骊U述中藥及復方的藥性研究，中藥新藥研發(fā)以及通過基因工程進行中藥次生代謝產(chǎn)物合成等領域傳統(tǒng)研究思路與方法很難具備用武之地，因此中藥基因組學的研究基于分子生物學及基因組學兩大學科，而基因芯片，DNA條形碼等有關分子生物學、基因組學的先進技術極大地推動了利用藥用植物鑒別領域的發(fā)展.

在丹參酮生物合成基因篩選研究中，崔光紅[57]構建了首張丹參cDNA芯片，從4 354個cDNA克隆中得到114個在不同時期差異表達的獨立基因，52個為丹參中首次報道.王學勇[58]通過誘導子處理丹參毛狀根，采用cDNA芯片雜交，獲得了誘導后48 h的差異基因轉(zhuǎn)錄譜，并克隆得到了5條與丹參酮生物合成相關基因.此項研究以中藥基因組學基礎通過構建高通量基因芯片從轉(zhuǎn)錄水平分析有關丹參酮翻譯產(chǎn)物合成機制，為更深層次通過基因工程實現(xiàn)丹參酮人工生物合成提供理論基礎.

7 基因芯片技術在中藥現(xiàn)代化研究中的不足

誠然基因芯片技術可在中藥作用機理、新藥研發(fā)及有效成分篩分、復方研究及中藥質(zhì)量控制與安全性等方面，為現(xiàn)代化研究提供了全新的分析途徑，并且推動了傳統(tǒng)中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學的接軌，但不可否認該技術還存在許多不足有待發(fā)展完善，如基因芯片技術存在假陽性，基因芯片的特異性、檢測系統(tǒng)的分辨率和靈敏度都有待提高，檢測樣品的制備及標記有待簡化，基因芯片應用的成本較高限制了其應用的普及等.

8 展望

將基因芯片技術應用在中藥現(xiàn)代化研究中，對克服由于中藥化學成分復雜性及多樣性導致難以解釋作用機制等矛盾提出了新方案，為闡明中藥的治病防病理論，提高在國際醫(yī)學領域認可度有極大幫助.

要在中藥現(xiàn)代化研究中，新藥研發(fā)有效成份提取、復方制劑研究、中藥質(zhì)量控制與安全性研究等方面充分利用基因芯片技術，我們相信這樣可以有效的刺激中藥基因組學的發(fā)展，促進現(xiàn)代分子生物學及基因組學與中國傳統(tǒng)中醫(yī)文化相結(jié)合，有效為中醫(yī)理論文化的繼承與發(fā)展提供支撐，并且通過提高中藥道地性形成研究、解釋中藥遺傳機制與藥性相互作用，研究保護品種穩(wěn)定性的方法，建立中藥優(yōu)質(zhì)品產(chǎn)地及基因組相關數(shù)據(jù)庫，完善中藥材野生資源保護機制，保護中藥品種和遺傳信息資源這一國家戰(zhàn)略資源.

綜上所述，現(xiàn)代分子生物學及基因組學的持續(xù)研究造就了近30年基因芯片技術的不斷發(fā)展，而中藥現(xiàn)代化發(fā)展借助此項技術取得了的舉世矚目成就，可以預見其發(fā)展和應用前景極為廣闊.目前，從分子水平研究中藥最為高效率、高通量的技術手段依然是基因芯片技術，為中藥現(xiàn)代化研究提供了新的發(fā)展空間.未來，隨著該技術的完善，其在中藥研究領域也將更為廣闊.