趙小慧，張卉妍，胡風(fēng)慶*

(1.遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼寧 遼陽(yáng) 111000；2.遼寧大學(xué) 輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate，PHA)是很多微生物在碳源充足，氮源缺乏狀態(tài)下產(chǎn)生的一類顆粒狀可作為生物體內(nèi)碳源和能量?jī)?chǔ)備物的高分子生物聚酯[1，2].PHA因具有生物可降解性、氣體相隔性、生物相容性等許多優(yōu)秀性能[3-6]，從而應(yīng)用在可降解包裝材料、醫(yī)藥行業(yè)及組織工程等眾多領(lǐng)域[7-11].

PHA合酶是PHA合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它的活性和底物特異性決定著PHA的含量和組成[12].對(duì)PHA合酶進(jìn)行基因工程改造獲得有益基因可增加PHA產(chǎn)量、改變單體組成和降低生產(chǎn)成本，其中構(gòu)建嵌合酶是創(chuàng)造新酶、改變PHA單體組成的一種有效方式.Matsumoto等[13]構(gòu)建了由26%的富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(R.eutropha)PhaCAcN端和74%的豚鼠氣單胞菌(A.caviae)PhaCReC端嵌合成的AcRe12，在E.coliLS5218表達(dá)，當(dāng)以月桂酸為碳源時(shí)，產(chǎn)生了比親本含量高的PHA，且產(chǎn)生了新的組分HO，并降低了PHA的分子量.隨后，Sun等[14]做了進(jìn)一步研究，把AcRe12在富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(R.eutropha)和惡臭假單胞菌(P.putida)中表達(dá)，以月桂酸為原料，均產(chǎn)生了新的組分HO，且在P.putidaGpP104還發(fā)現(xiàn)了微量的HD.嵌合酶由于融合了兩個(gè)或者更多的酶，因而能表現(xiàn)出親本酶的特性.應(yīng)用嵌合PHA合酶可以改變其底物的廣泛性，有效提高PHA產(chǎn)量從而從根本上降低生產(chǎn)成本，并產(chǎn)生新類型的PHA，以使它的物理化學(xué)性質(zhì)更加接近化學(xué)合成的塑料以適應(yīng)對(duì)不同性能PHA的不同的需求，開(kāi)發(fā)PHA的新的用途[15].

實(shí)驗(yàn)以嗜水氣單胞菌PHA合酶(PhaCAh)和富氧產(chǎn)堿菌PHA合酶(PhaCRe)為親本，利用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，找到兩個(gè)酶合適的嵌合位點(diǎn)，利用SOE-PCR構(gòu)建新型嵌合酶PhaCAhRe，以產(chǎn)生新型的PHA.

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

所用菌株包括：嗜水氣單胞菌WQ，富氧產(chǎn)堿菌H16，大腸桿菌S17-1，富氧產(chǎn)堿菌PHB-4[16]，均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要試劑與酶

葡萄糖(Glucose)、果糖(fructose)、月桂酸(Lauric acid)，沈陽(yáng)禹王試劑公司；葡萄糖酸鈉(Gluconate)、油酸(Oleic acid)、乳糖(Lactose)，生工；

DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、蛋白酶K，以上均來(lái)自TaKaRa公司；RNA酶、溶菌酶，來(lái)自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

DL-6M大容量冰凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；氣相色譜儀Agilent 7890A(美國(guó)Agilent)；GeneAmp PCR system 9700(SINGAPORE)；Dolphin-Doc凝膠成像系統(tǒng)(WEALTEC).

1.4 常用培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用LB培養(yǎng)基、礦物鹽培養(yǎng)基的配制根據(jù)文獻(xiàn)[17].

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PHA合酶基因擴(kuò)增

基因組提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[18]，目的片段PCR擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)[19]，PCR產(chǎn)物回收采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit.

PHA嵌合基因SOE-PCR擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存.

2.2 PHA合酶分析方法

為獲得有活性的、能產(chǎn)生新型PHA的嵌合PHA合酶，必須選擇合適的結(jié)合位點(diǎn)，既不破壞蛋白正常構(gòu)象，保證蛋白的正確折疊，又能產(chǎn)生新的變化，產(chǎn)生新的種類.為了不破壞蛋白的正確構(gòu)象，需要對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè).由于PHA合酶蛋白的晶體接夠目前還未獲得，對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)無(wú)從下手，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)在一定程度上提供保證.用Predtor、GOR4、SOPMA三種在線二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件對(duì)A.hydrophilaWQ PHA合酶(PhaCAh)和R.eutrophaPHA合酶(PhaCRe)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè).為保證嵌合的正確性，需要進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行同源分析.故結(jié)合生物分析軟件Vector NTI 6.0序列比對(duì)結(jié)果找到兩個(gè)酶的合適的結(jié)合位點(diǎn).

2.3 質(zhì)粒構(gòu)建

PCR擴(kuò)增獲得的合酶基因切膠回收，經(jīng)HindⅢ和EcoRI雙酶切，插入pBBR1MCS2中，T4連接酶16℃過(guò)夜連接.取10 μl連接反應(yīng)液電轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，獲得重組質(zhì)粒.將重組質(zhì)粒通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入PHA缺失突變株P(guān)HB-4中，獲得重組菌.

2.4 PHA合酶/嵌合酶功能驗(yàn)證

將含有質(zhì)粒的R.eutrophaPHB-4重組菌采用兩步培養(yǎng)法，先用牙簽挑取單菌落于10 mL LB中過(guò)夜培養(yǎng)，待種子液長(zhǎng)好，再轉(zhuǎn)接入100 mL組分(體積)比例為5∶93.5∶1∶0.1礦物鹽培養(yǎng)基中，添加相應(yīng)抗生素，在30 ℃條件下，200 rpm培養(yǎng)72 h，8 000 rpm離心10 min收集菌體，水洗一次，醇洗一次，冷凍干燥至恒重，稱重并稱取50 mg酯化進(jìn)行氣相色譜分析，同時(shí)設(shè)定對(duì)照組，每個(gè)樣三個(gè)平行.

2.5 菌體干重及PHA含量計(jì)算

2.5.1 菌體干重

8 000 rpm離心10 min，收集菌體，并用蒸餾水和95%乙醇洗滌菌體2～3次，離心收集菌體，經(jīng)冷凍干燥，獲得干菌體，并稱重.

2.5.2 PHA含量分析

PHA含量通過(guò)氣相色譜法測(cè)定[16]，PHA含量計(jì)算公式如下：

標(biāo)樣質(zhì)量=10 mg

3 結(jié)果與討論

3.1 PHA合酶基因克隆

根據(jù)文獻(xiàn)[19]，從NCBI中獲得A.hydrophilaWQ序列，并以此序列設(shè)計(jì)引物AH1(5′-GCTAAGCTTCTAATGAGCCAACCATCTTAT-3′)和AH2(5′-TTTGAATTCTCATGCGGCGTCCT-3′)，PCR擴(kuò)增得到phaCAh，測(cè)序結(jié)果與發(fā)表序列一致.

根據(jù)NCBI中的R.eutrophaH16phaCRe的序列，設(shè)計(jì)帶有HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)的引物RH1(5′-GATAAGCTTCTAATGGCGACCGGCAAAGG-3′)和RH2(5′-TACGAATTCTCATGCCTTGGCTTTGACGT-3′)，以R.eutropha基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得phaCRe，測(cè)序結(jié)果與發(fā)表序列一致.

3.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)尋找嵌合酶結(jié)合位點(diǎn)

3.2.1 PhaCAh和PhaCRe二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

無(wú)規(guī)卷曲作為分子中間的連接肽，結(jié)構(gòu)比較松散，相互作用比較小，圍繞單鍵轉(zhuǎn)動(dòng)阻力極小，因此不具獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)和最適構(gòu)象，適合作為連接區(qū).

3.2.2 序列比對(duì)及結(jié)合位點(diǎn)選擇

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)出來(lái)的無(wú)規(guī)卷曲區(qū)表明這段序列可能適合作為結(jié)合區(qū)，為保證嵌合的正確性，需要進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行同源分析.采用生物分析軟件Vector NTI 6.0對(duì)兩個(gè)酶進(jìn)行序列比對(duì)，通過(guò)序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，尋找到R.eutropha第159位氨基酸和A.hydrophila第154位氨基酸適合作為結(jié)合位點(diǎn).

3.3 嵌合基因SOE-PCR擴(kuò)增

以pBBR1MCS2-phaCAh為模板，AH1和AH3(5′-GCAAGGAAGTTGGTGGCCAGGAAGT-3′)為引物，PCR獲得ΔphaCAh，大小為462 bp，切膠回收DNA備用.

以pBBR1MCS2-phaCRe為模板，利用引物RH2和RH3(5′-AACTTCCTTGCCACCAATCCC-3′)得到ΔphaCRe，大小為1296 bp.切膠回收DNA備用.

以回收的ΔphaCAh和ΔphaCRe為模板，以引物AH3和RH3中的相同部分為互補(bǔ)末端，AH1和RH2為引物，經(jīng)重疊延伸剪接技術(shù)(SOE-PCR)擴(kuò)增得到嵌合基因phaCAhRe，大小為1758 bp.

3.4 PHA合酶/嵌合酶功能驗(yàn)證

3.4.1 重組菌R.eutrophaPHB-4-AH PHA合酶功能驗(yàn)證

將含有質(zhì)粒的重組菌R.eutrophaPHB-4-AH采用兩步培養(yǎng)法后通過(guò)氣相色譜分析，重組菌R.eutrophaPHB-4-AH所產(chǎn)PHA的分子組成及含量的結(jié)果見(jiàn)表1.

如表1所示，當(dāng)以乳糖和葡萄糖為單一碳源時(shí)，重組菌不生長(zhǎng)，以其他為碳源時(shí)均能生長(zhǎng)；當(dāng)以葡萄糖酸鈉和果糖為單一碳源時(shí)，細(xì)胞干重很大，最高達(dá)8.525 g/L，但是只產(chǎn)生了3HB一種單體，而在其他碳源中發(fā)酵時(shí)均產(chǎn)生3HB和3HHx兩種單體.其中，以辛酸鈉和葡萄糖酸鈉混合碳源發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)最好，達(dá)4.68 g/L，PHA也產(chǎn)量最高，占細(xì)胞干重的79.68%.辛酸鈉為單一碳源時(shí)細(xì)胞干重最少，相對(duì)應(yīng)的PHA含量也最少，其余介于二者之間.辛酸鈉為唯一碳源時(shí)兩種單體組中HHx含量為4種碳源之中最多的.

表1 重組菌R.eutropha PHB-4-AH利用不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)PHA的含量及單體組成

3.4.2 重組菌R.eutrophaPHB-4-RE PHA合酶功能驗(yàn)證

將含有質(zhì)粒的重組菌R.eutrophaPHB-4-RE采用兩步培養(yǎng)法后通過(guò)氣相色譜分析，其所產(chǎn)PHA的分子組成及含量的結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 重組菌R.eutropha PHB-4-RE利用不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)PHA的含量及單體組成

如表2所示，以葡萄糖和乳糖為碳源時(shí)，重組菌RE與重組菌AH一樣不生長(zhǎng)，以其他碳源生長(zhǎng)時(shí)重組菌只產(chǎn)生HB一種單體.以果糖為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)狀態(tài)最好，細(xì)胞干重達(dá)6.315 g/L，PHA也產(chǎn)量最高，占細(xì)胞干重的89.84%；以辛酸鈉為碳源時(shí)重組菌生長(zhǎng)不好，細(xì)胞干重僅為1.230 g/L，PHA含量也僅為16.66%，其他碳源介于這兩者之間.

3.4.3 嵌合酶功能驗(yàn)證

將含有質(zhì)粒的重組菌R.eutrophaPHB-4-AHRE采用兩步培養(yǎng)法后通過(guò)氣相色譜分析，其所產(chǎn)PHA的分子組成及含量的結(jié)果見(jiàn)表3.

由表3可以得出，當(dāng)以乳糖和葡萄糖為碳源時(shí)，重組菌不生長(zhǎng)，而其他碳源均能生長(zhǎng).且當(dāng)以葡萄糖酸鈉和果糖為碳源時(shí)，細(xì)胞干重很大，最高達(dá)8.020 g/L，PHA含量也最高，最高占細(xì)胞干重的91.72%，但是只產(chǎn)生3HB.而其他碳源均產(chǎn)生3HB、3HHx和3HO.其中，以月桂酸為碳源發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)最好，細(xì)胞干重為5.595 g/L.以葡萄糖酸鈉和辛酸鈉混合碳源發(fā)酵時(shí)，PHA產(chǎn)量最高，占細(xì)胞干重的57.54%.以辛酸鈉為單一碳源細(xì)胞干重最少，產(chǎn)生的PHA含量也最少，其余介于二者之間.辛酸鈉為唯一碳源時(shí)新的單體組成3HO含量最高，占PHA總量的1.932%，證明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功且嵌合酶具有合成PHA的功能.

表3 重組菌R.eutropha PHB-4-AHRE利用不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)PHA的含量及單體組成

綜上，利用PCR技術(shù)，分別從A.hydrophilaWQ和R.eutropha獲得PHA合酶基因.采用Predtor、GOR4、SOPMA三種方法對(duì)兩親本PHA合酶進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，獲得兩個(gè)親本酶的無(wú)規(guī)卷曲區(qū)域，同時(shí)，利用生物分析軟件Vector NTI 6.0對(duì)兩個(gè)酶進(jìn)行序列比對(duì)，獲得保守區(qū)域，二者結(jié)合，獲得嵌合酶結(jié)合位點(diǎn).利用SOE-PCR技術(shù)，以親本質(zhì)粒pBBR1MCS2-phaCAh和pBBR1MCS2-phaCRe為模板，獲得嵌合基因phaCAhRe，經(jīng)雙酶切與載體pBBR1MCS2連接，獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-phaCAhRe，酶切測(cè)序正確，結(jié)合轉(zhuǎn)化入R.eutrophaPHB-4，獲得重組菌R.eutrophaPHB-4-AHRE.結(jié)果顯示，當(dāng)以乳糖和葡萄糖為碳源時(shí)，重組菌不生長(zhǎng)，而其他碳源均能生長(zhǎng).且當(dāng)以葡糖糖酸鈉和果糖為碳源時(shí)，細(xì)胞干重很大，最高達(dá)8.020 g/L，PHA含量也最高，最高占細(xì)胞干重的91.72%，但是只產(chǎn)生3HB.在以辛酸鈉、月桂酸、油酸、辛酸鈉和葡萄糖酸鈉混合物為碳源時(shí)，與對(duì)照，除了產(chǎn)生3HB和3HHX，還產(chǎn)生了新的組分3HO，其中以月桂酸為碳源發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)最好，細(xì)胞干重為5.595 g/L.以葡萄糖酸鈉和辛酸鈉混合碳源發(fā)酵時(shí)，PHA產(chǎn)量最高，占細(xì)胞干重的57.54%.以辛酸鈉為單一碳源細(xì)胞干重最少產(chǎn)生的PHA含量也最少，其余介于二者之間.辛酸鈉為唯一碳源時(shí)新的單體組成3HO含量最高，占PHA總量的1.932%.在構(gòu)建PHA嵌合酶的研究中，與嵌合石油假單胞菌和富氧產(chǎn)堿菌PHA合酶基因相比，本研究的重組菌在不同碳源中產(chǎn)生的PHA 產(chǎn)量相對(duì)較高，且除了產(chǎn)生相同組分3HB與3HO，還產(chǎn)生了新組分3HHx.與起皺假單胞菌和惡臭假單胞菌PHA合酶基因嵌合相比，本實(shí)驗(yàn)重組菌能在更多不同碳源中生長(zhǎng)并產(chǎn)生不同組分.這充分表明本研究新的PHA嵌合酶構(gòu)建成功，獲得了新型PHA，為今后利用基因工程技術(shù)解決菌株P(guān)HA單體組成單一提供了具體有效的方法，為獲得具有更好材料學(xué)特性的PHA奠定了工作基礎(chǔ)，對(duì)PHA嵌合酶的研究及PHA生產(chǎn)利用具有現(xiàn)實(shí)意義.