陳學士，褚俊，楊利軍，王濤，陶陸陽

1.蘇州大學法醫(yī)學系（司法鑒定中心），江蘇 蘇州 215021；2.蘇州市公安局刑事警察支隊，江蘇 蘇州215131

常規(guī)組織病理學技術如甲醛溶液固定組織、石蠟切片制備、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色在法醫(yī)病理學診斷中發(fā)揮了重要作用。然而在法醫(yī)損傷病理學鑒定實踐中[1-3]，常遇到損傷時間推斷、損傷并發(fā)癥鑒定等疑難問題。損傷時間推斷主要包括生前傷與死后傷鑒別、皮膚損傷時間推斷、外傷性遲發(fā)性脾破裂（traumatic delayed rupture of spleen，TDRS）損傷時間推斷、血栓形成時間推斷、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）及硬腦膜下血腫（subdural hematoma，SDH）形成時間推斷等，損傷并發(fā)癥主要包括脂肪栓塞、擠壓綜合征及骨筋膜室綜合征的診斷等。免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）及特殊染色技術有助于解決上述問題。由于IHC 和特殊染色技術具有操作簡便、不需要昂貴儀器、可同時檢測多種指標等優(yōu)勢，在法醫(yī)損傷病理學實踐中得到了廣泛應用。本文綜述IHC 和特殊染色技術在法醫(yī)損傷病理學實踐檢案中損傷時間推斷和損傷并發(fā)癥鑒定的應用和價值，以期為法醫(yī)工作者提供參考。

1 損傷時間推斷

損傷時間包括人體死亡前形成的損傷和活體上損傷所經歷的時間[2]，法醫(yī)病理學中的損傷時間是指從受傷到死亡經歷的時間，對損傷時間進行推斷和認定是判斷損傷與死亡關聯性的前提。損傷時間推斷的首要任務是鑒別生前傷與死后傷，進一步推斷傷后存活時間。生活反應是損傷局部及全身皆可出現的防衛(wèi)反應，是確定生前損傷及推斷損傷后存活時間的基礎，可通過肉眼觀察和組織病理學技術檢測[1]。

1.1 生前傷與死后傷鑒別

生前傷是活體受暴力作用造成的損傷，死后傷是死后受暴力作用造成的損傷，鑒別生前傷與死后傷的意義在于判斷死者真正的致死因素[1]。生前傷與死后傷的鑒別主要基于生活反應，如肉眼觀察到的出血、組織收縮、腫脹、痂皮形成、創(chuàng)口感染、異物移動等，以及組織病理學變化，如血栓栓塞形成、炎癥反應及損傷愈合等[1]。早在20 世紀60 年代初，RAEKALLIO[4]通過酶組織化學技術檢測人體皮膚切創(chuàng)中心區(qū)和周邊區(qū)酶活性變化對生前傷與死后傷進行鑒別。國內法醫(yī)學者亦通過特殊染色技術對生前傷與死后傷的鑒別進行了一系列研究：盧慶林[5]對人體生前與死后皮膚切創(chuàng)進行Hart 氏改良彈力纖維染色，發(fā)現無論是不同時間的生前傷還是不同時間的死后傷，其真皮中彈力纖維均具有相似的形態(tài)結構，如呈波浪狀、網狀、點狀及點片狀，因此，無法依據真皮中彈力纖維形態(tài)學變化鑒別生前與死后皮膚切創(chuàng)。李真等[6]對生前縊死、勒死13 例和死后懸尸5 例索溝處皮膚組織進行彈力纖維染色，發(fā)現生前索溝處皮膚彈力纖維因收縮而變得粗細不均，斷端呈多形性改變，如卷曲、膨大、分叉或呈蝌蚪狀、球拍狀；死后索溝處皮膚彈力纖維粗細相差不懸殊，斷端多整齊、平直。因此，應用彈力纖維染色有助于鑒別生前和死后索溝。趙樞泉等[7]報道，即使對水中腐敗尸體的鑒定，仍可通過緒方氏染色法鑒別頸部和踝部索溝處皮膚組織的生活反應能力。牛文有等[8]報道了一種改良Poley’s 酸性復紅-甲基綠染色法在鑒別生前與死后索溝時，比Mallory’s三色法和緒方氏染色法效果更好，尤其是高度腐敗尸體，其鑒別能力更好。而IHC 染色與特殊染色技術聯合使用在鑒別生前傷與死后傷方面更具優(yōu)勢。國外有學者[9]報道了1 例被發(fā)現死于垃圾運輸車內的流浪漢，為鑒別死者的真正死因，法醫(yī)病理學家提取多處損傷頭皮組織進行HE、Van Gieson（VG）及分化群（clusters of differentiation，CD）15 染色，盡管在損傷區(qū)沒有發(fā)現纖維素滲出和中性粒細胞聚集，但發(fā)現P-選擇素在損傷區(qū)小血管內皮細胞質膜上呈中度表達，E-選擇素無表達。VAN DER LAAN 等[10]發(fā)現，P-選擇素在生理條件下表達于血管內皮細胞桿狀細胞器Weibel-Palade小體膜上，在外傷或感染等條件下受組胺及凝血酶等刺激，迅速轉移表達于內皮細胞質膜上（1～2 min開始表達、10～15 min 達峰值，2～4 h 逐漸消失），并招募中性粒細胞聚集；而E-選擇素僅在外傷或受白介素（interleukin，IL）-1、腫瘤壞死因子-α 或脂多糖刺激后1～2 h 開始合成、4～6 h 達峰值，并于8～10 h 完全消失。

1.2 皮膚損傷時間推斷

皮膚損傷愈合是一個復雜、規(guī)律的過程，包括炎癥期、增殖期和重塑期[11]，應用IHC 染色技術檢測上述過程中的生物活性物質，如膠原蛋白、炎癥因子、細胞因子、生長因子等時程性表達，可用于皮膚損傷時間推斷[12]。在20 世紀80 年代，EISENMENGER 等[13]應用IHC 染色技術檢測損傷區(qū)及周邊區(qū)皮膚組織不同類型膠原纖維的表達，用于皮膚損傷時間推斷。國內法醫(yī)學者亦采用IHC 染色技術在人體皮膚損傷時間推斷方面進行了系列研究。王慧君等[14]收集15 例交通事故傷和刀刺傷人體皮膚標本，IHC 染色發(fā)現，損傷皮膚組織中均表達轉化生長因子-β、堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子，并總結前人研究成果[15]，提出多種細胞因子聯合檢測有助于人體皮膚損傷早期時間推斷。官大威等[16]收集了52 例刺、切創(chuàng)人體皮膚標本，經IHC 染色發(fā)現損傷區(qū)皮膚組織中性粒細胞、單核細胞及成纖維細胞中均表達IL-8，且具有時程性變化規(guī)律，因此，IL-8 可作為人體皮膚損傷時間推斷的候選指標。劉寧國等[17]在動物實驗研究的基礎上，成功研制出纖維連接蛋白-EIIIA 金標單克隆抗體試紙條，并初步應用于人體皮膚損傷時間推斷。KONDO[12]總結了皮膚損傷時間推斷的研究成果，認為參與皮膚損傷愈合過程的各類生物活性物質如膠原蛋白、纖維蛋白、黏附分子、炎癥因子、趨化因子、血管生成因子、轉化生長因子、應激蛋白、細胞增殖相關蛋白、類花生酸類物質等都可能成為皮膚損傷時間推斷的候選指標，并建議利用IHC 染色技術系統(tǒng)研究多種類型細胞及多指標時程性變化規(guī)律用于人體皮膚損傷時間推斷。

1.3 TDRS 損傷時間推斷

TDRS 系脾中央型破裂和包膜下破裂發(fā)展而形成的真性破裂，常在傷后有一段較長時間的無典型癥狀和體征的“間歇”期，因此，TDRS 損傷時間推斷是確定脾破裂與外傷之間因果關系的關鍵依據[1]。萬陽等[18]對118 例人體外傷性脾破裂標本進行IHC 染色，檢測損傷中央區(qū)及周邊區(qū)髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、CD68 和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達，發(fā)現傷后5 d 內均有MPO 表達且于傷后12～24 h 達高峰，傷后6～14 d 均有CD68 表達且于傷后5～7 d 達高峰，傷后1～14 d 均有α-SMA 表達且于傷后14 d 達高峰。因此，采用多指標IHC 染色并結合脾破裂組織病理學變化有助于人脾破裂損傷時間的精確推斷。國外有學者收集了80例鈍性脾破裂人體標本[19]，根據損傷周圍組織纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）、CD61 及CD68 的IHC 染色結果，將外傷性脾破裂劃分為傷后1～3 d、4～10 d、11～16 d 和17～30 d 4 個時間階段，用于外傷性脾破裂損傷時間推斷。張富源等[20]在1 例TDRS 損傷時間推斷的案例中，聯合運用HE、Mallory 及IHC 染色技術，發(fā)現Mallory 染色較HE 染色可更清晰地觀察到紫色條索狀纖維素樣物（新鮮出血區(qū)）與藍染膠原纖維（陳舊出血區(qū)），且陳舊出血區(qū)較新鮮出血區(qū)可表達更多的α-SMA，從而確定同時存在急性（12～24 h）與遲發(fā)性（8～14 d）脾破裂，為TDRS 損傷時間推斷的精準鑒定提供了病理學依據。

1.4 血栓形成時間推斷

在鑒定損傷后因肺動脈血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）死亡的案例中[21]，法醫(yī)病理學家需要研究血栓栓子的形成時間，從而分析損傷與血栓栓塞發(fā)生之間的時間順序，進而分析損傷與死亡之間的因果關系。FINESCHI 等[22]對140 例PTE 死亡案例進行回顧性研究，經對血栓組織切片進行HE、Masson、磷鎢酸蘇木精（phosphotungstic acid-hematoxylin,PATH）、VG、Von Kossa 和Perl’s 等染色，以 及FIB、CD61、CD45、CD15、CD68 等IHC 染色，將血栓形成時間劃分為3 個階段，即傷后1～7 d、2～8 周和2 個月以上，并在后期收集的43 例PTE 死亡案例中得到了進一步驗證[23]。國內法醫(yī)學者[24]亦應用上述3 階段分期標準對23 例PTE 死亡案例分析，發(fā)現血栓形成時間與外傷發(fā)生時間基本一致。王林林等[21]總結前人對血栓形成時間推斷的研究成果并收集了相關法醫(yī)學實踐案例，結合IHC 和特殊染色結果，建議將血栓形成時間劃分為5階段，即傷后1～3 d、4～7 d、2～4周、5周～2 個月和2 個月以上，以利于血栓形成時間的精準推斷。

1.5 TBI 及SDH形成時間推斷

TBI 后損傷時間推斷是法醫(yī)損傷病理學研究的重點與難點[1]。筆者前期收集了TBI 人體標本[25-26]，經IHC 染色發(fā)現膠質纖維酸性蛋白、增殖細胞核抗原及可溶性蛋白100 均呈單峰表達，且上述指標的聯合使用有助于TBI 后損傷時間的推斷。HAUSMANN 等[27]收集104 例人體TBI 標本，對波形蛋白、肌腱蛋白及α-抗胰蛋白酶進行IHC 染色，并應用于TBI 后損傷時間推斷。周亦武等[28-30]研究發(fā)現，熱休克蛋白70、神經絲蛋白200 及細胞周期素D1 于TBI 后呈時程性變化表達，推測上述指標可作為TBI 后損傷時間推斷的參考指標。此外，眾多學者對TBI 后細胞凋亡進行了系列研究[31-33]，并用于TBI 后損傷時間的推斷。郭相伸等[34]通過免疫熒光雙重染色技術發(fā)現TBI 后核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid derived 2-like 2，Nrf2）在神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中均呈單峰表達，推測Nrf2 在多種類型神經細胞的時程性表達有望為TBI 后損傷時間推斷提供新的參考指標。

SDH 多由外傷造成，分急性（3 d 以內）、亞急性（3 d～3 周）及慢性（3 周以上），其中非急性（亞急性和慢性）SDH 常在傷后一段時間才出現臨床癥狀，因此判斷非急性SDH 與外傷之間的因果關系是法醫(yī)學鑒定的難點[1]。VAN DEN BOS 等[35]在總結前人研究成果的基礎上，擴大SDH 樣本量，聯合使用HE、IHC 及特殊染色技術，總結SDH 后24 h 到1 年的組織病理學變化特點，以期對SDH 形成時間進行精準推斷。

2 損傷并發(fā)癥鑒定

損傷并發(fā)癥[1]是指機體在原發(fā)性外傷的轉歸過程中發(fā)生的與原發(fā)性外傷之間存在直接因果關系的不良后果，其中脂肪栓塞、擠壓綜合征和骨筋膜室綜合征的鑒別與診斷可以通過IHC 和特殊染色進行輔助診斷。

2.1 脂肪栓塞

脂肪栓塞分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性。創(chuàng)傷性脂肪栓塞[1，36-37]常見于嚴重外傷（如長骨骨折）、脂肪組織豐富的軟組織嚴重挫傷、大面積燒傷等，傷后短時間內肺、腦、心等多器官微血管內出現脂肪滴并堵塞管腔，嚴重時可因脂肪栓塞綜合征（fat embolism syndrome，FES）死亡。在常規(guī)HE 染色切片制作過程中，因脂肪栓子被有機溶劑溶解，顯微鏡下肺組織細小動脈管腔內可見大小不等的空泡，尤其是肺泡壁毛細血管呈串珠樣改變，但HE 染色無法明確血管內空泡的性質。因此，對懷疑因脂肪栓塞導致死亡的案件進行鑒定時，應提取肺、腦、心等組織制作冰凍切片，進行蘇丹Ⅲ、油紅O 及猩紅染色，當在血管內發(fā)現亮橙黃色至紅色小球，可為脂肪栓塞鑒定提供直接證據[1，38]。周蘭等[38]利用油紅O 染色對20 例因FES 死亡的案例進行回顧性研究時，發(fā)現18 例為單純肺脂肪栓塞、2 例為肺脂肪栓塞合并腦脂肪栓塞。葉光華等[39]報道1 例因隆胸手術并發(fā)FES 死亡的案例，死者生前曾通過抽吸臀部皮下脂肪顆粒注射到乳房皮下組織內，HE 染色在死者肺動脈細小分支內觀察到大量空泡，蘇丹Ⅲ染色證實為脂肪栓子，進一步檢查發(fā)現死者左側乳房針孔附近小靜脈破裂伴周圍大量游離脂肪顆粒形成，從而證明了死因與隆胸手術之間的關系。

2.2 擠壓綜合征和骨筋膜室綜合征

擠壓綜合征是指人體軀干、四肢等肌肉豐富的部位遭受嚴重擠壓解除后，全身微循環(huán)障礙，腎小球濾過率降低，腎小管受阻、變性、壞死，出現以肌紅蛋白尿和急性腎衰竭為主要特征的臨床綜合征[1]，法醫(yī)學鑒定主要依據原發(fā)性軟組織損傷及腎組織特征性組織病理學檢驗所見。HE 染色發(fā)現腎小管蛋白管型，IHC 染色證明為肌紅蛋白（myoglobin，Mb），可作為診斷擠壓綜合征的直接證據[1]。高彩榮等[40]對15 例確診為擠壓綜合征死亡的案例進行回顧性研究，發(fā)現所有死亡均發(fā)生于傷后36 h～6 d，HE 染色均觀察到腎小管壞死及蛋白管型，IHC 染色證明其中13 例有腎小管Mb 管型。

骨筋膜室綜合征（osteofascial compartment syndrome，OCS）常并發(fā)于擠壓傷、藥物濫用、手術固定不當、低位墜落，甚至蛇咬傷等引起的橫紋肌溶解綜合征[41-42]，亦可引起肌紅蛋白尿和急性腎衰竭，甚至死亡。王濤等[42]曾報道1 例成年男性從0.8 m 高工作臺上墜落致其右下肢疼痛并于4 d 后死亡的案例，尸體檢驗時發(fā)現其右下肢骨骼肌及軟組織廣泛腫脹、呈紫黑色伴大量血性液體滲出，HE 染色觀察到肌肉廣泛壞死伴大量中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤，腎小管內發(fā)現大量均質蛋白管型，IHC 染色證明為Mb 管型，且死后血液中尿素氮和肌酐呈數倍升高，從而鑒定死者符合低位墜落致右下肢OCS 引起代謝功能紊亂并發(fā)急性腎功能衰竭死亡。

3 蛇咬傷和胰島素他殺鑒定

IHC 染色技術還常用于蛇咬傷、胰島素他殺案件的法醫(yī)學鑒定。蛇毒的毒性成分主要是具有酶活性的蛋白質和多肽，且不同種類的蛇毒毒性成分的抗原特異性不同[43]，因此，可利用IHC 染色技術對蛇毒中毒及毒蛇種類進行鑒別。趙樞泉等[44]報道了1 例老年女性在睡眠中被蛇咬傷，2 d 后死亡的案例。尸體檢驗發(fā)現死者右外踝有3 處疑似毒蛇牙痕的點狀出血伴周圍軟組織腫脹，HE 染色提示皮下膠原組織及肌肉凝固性壞死、出血并伴有以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，IHC 染色發(fā)現上述損傷區(qū)蝮蛇蛇毒蛋白呈陽性表達，從而認定死者系蝮蛇咬傷中毒死亡。胰島素過量使用可引起低血糖昏迷、休克甚至死亡，而利用胰島素進行謀殺常因注射部位隱蔽或尸體高度腐敗使案件偵破處于困境。有研究[45]表明，利用IHC染色技術在疑似注射針痕周圍皮膚組織中檢測到胰島素或胰島素佐劑如魚精蛋白，可作為胰島素注射死亡的關鍵證據。楊怡等[45]報道1 例水中尸體死因鑒別的案例，在死者左上臂及左手背發(fā)現兩處疑似出血點，經IHC 染色發(fā)現出血部位皮下軟組織中含有胰島素及魚精蛋白成分，綜合案情認定死者系胰島素他殺后拋尸入水。

4 不足與展望

IHC 及特殊染色技術在法醫(yī)損傷病理學實踐中的應用廣泛，并起到了越來越重要的作用。然而，IHC 和特殊染色技術在法醫(yī)損傷病理學實踐中的應用還存在以下不足：（1）大多數特殊染色技術的染色機制尚不明確，染色劑與組織細胞之間可能是物理性結合，也可能是化學性結合，在一定程度上影響了特殊染色技術的應用及發(fā)展；（2）對于IHC 染色技術，抗原成分的破壞或抗體的非特異性結合都會影響染色結果，從而造成假陰性或假陽性的判斷；（3）本文綜述的研究成果多為回顧性研究和案例報道，尤其是在損傷時間推斷方面，其影響因素較多，如個體差異（年齡、性別、疾病）、損傷后治療、死后變化等，缺乏系統(tǒng)性的評價，影響損傷時間推斷結果的可靠性和準確性。

隨著組織病理學技術的發(fā)展，全自動IHC 和特殊染色機在組織病理學檢驗中逐漸普及，與傳統(tǒng)的人工染色相比，全自動染色機具有良好而穩(wěn)定的染色結果、自動高效的工作流程，因此更具優(yōu)勢，值得推廣。在此基礎上，建議采用多指標、多細胞類型、人工智能、優(yōu)化的統(tǒng)計方法，以及聯合應用分子生物學技術、組學技術、光譜學和（或）質譜學成像技術等[2]，以利于IHC 和特殊染色技術在法醫(yī)損傷病理學實踐中的精準應用。