李秀富，朱鋒釗

(銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

高職院校農(nóng)林牧漁類“雞新城疫抗體水平測定”技能競賽是由教育部發(fā)起，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部主辦，學(xué)校、行業(yè)、企業(yè)共設(shè)的賽項。賽項測定方法按照中華人民共和國《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550—2008)國家標(biāo)準(zhǔn)，操作方法簡單，結(jié)果判定方便，但競賽時間較長，往往因器材準(zhǔn)備不合理或選手操作不規(guī)范而影響試驗結(jié)果。筆者作為我校近幾年該技能競賽國賽和省賽的指導(dǎo)教師，現(xiàn)就技能競賽中影響試驗結(jié)果的因素進(jìn)行歸納總結(jié)，以供參考。

1 試驗器材正確規(guī)范使用

在競賽第1環(huán)節(jié)中，除了物品標(biāo)識，重點是考察托盤天平和離心機(jī)的規(guī)范使用，競賽物品準(zhǔn)備的均為500 g載荷托盤天平。在試驗使用前，應(yīng)將兩側(cè)托盤架下方的保護(hù)套取下，將平衡螺母調(diào)至最里側(cè)，砝碼歸零，觀察天平敏感性。然后選擇質(zhì)量相近的2個小燒杯置于托盤中央調(diào)平，將離心管規(guī)范裝入對角取出的離心機(jī)套管并放入托盤天平燒杯內(nèi)進(jìn)行生理鹽水配平。在離心管裝入離心機(jī)套管配平時一定要精準(zhǔn)，否則將影響離心機(jī)正常使用并使離心機(jī)產(chǎn)生較大雜音，嚴(yán)重影響離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)和血細(xì)胞壓積，對清洗紅細(xì)胞和最終吸取紅細(xì)胞壓積都會產(chǎn)生不良影響，最終可能會導(dǎo)致1%紅細(xì)胞懸液配置不精準(zhǔn)。

2 反應(yīng)溫度與時間

雞新城疫抗體水平測定試驗屬于血清學(xué)實驗中的血凝與血凝抑制試驗，溫度對試驗結(jié)果影響較大。溫度過高(大于37 ℃)不僅會造成水分蒸發(fā)和反應(yīng)物解離，甚至還會造成紅細(xì)胞自溶，作用時間變短；溫度低于20 ℃則會使反應(yīng)速度變緩；溫度過低(小于4 ℃)不僅紅細(xì)胞會發(fā)生自凝，還會影響試驗結(jié)果的判定時間或與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相差1～2個滴度[1]。為了保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和競賽公平公正，在競賽前和整個競賽過程中應(yīng)將場地內(nèi)每個工位室溫盡可能控制在20～25 ℃。

3 規(guī)范精準(zhǔn)移液

在技能競賽中造成移液不精準(zhǔn)的因素很多，概括起來主要包括：吸頭與移液器型號是否完全匹配，裝配移液器吸頭是否規(guī)范，吸頭有無潤洗，移液前是否校準(zhǔn)移液器，移液是否做到“慢吸，快打”，倍比稀釋混勻是否產(chǎn)生氣泡，移液是否有液體濺出等。操作的每一個細(xì)小失誤或動作標(biāo)準(zhǔn)不一致都會造成結(jié)果誤差，甚至沒有結(jié)果。所謂“差之毫厘，謬以千里”，所以在競賽操作中要求每位選手必須謹(jǐn)小慎微、規(guī)范操作。

4 準(zhǔn)確適量配置1%紅細(xì)胞懸液

技能競賽要求準(zhǔn)備非免疫公雞1只，要求競賽準(zhǔn)備方認(rèn)真檢測雞是否有禽流感、新城疫等相關(guān)抗體。在采血時采血器要先抽取抗凝劑再采血，若加入抗凝劑的時間、方法不當(dāng)產(chǎn)生了血凝塊，對紅細(xì)胞懸液配置會有很大影響[2]。采血過程中2人要默契配合，抓雞做到輕、穩(wěn)、準(zhǔn)、巧，讓雞安靜舒適地躺臥在雞籠上保定，消毒采血部位后，采血操作者要穩(wěn)、準(zhǔn)、快地采足所需翅靜脈血液量，采血完畢一手用干棉球按壓止血，另一手蓋上采血器針帽，適度輕晃采血器以防凝血[3]。擰掉采血器上的針頭，將抗凝血沿離心管壁輕緩注入離心管中，再緩慢加入3～4倍生理鹽水混勻洗滌、配平，2 000 r/min離心5～8 min，洗滌4次，吸干凈血小板和白細(xì)胞，按照競賽用量配置適量紅細(xì)胞懸液，且所使用的生理鹽水使用前要滅菌并標(biāo)定pH值至7.2。若配置的1%紅細(xì)胞懸液濃度過高，如有潤洗吸頭，則會出現(xiàn)沉降血點變大；反之，則會出現(xiàn)沉降血點變小，血沉速度減慢，血凝滴度升高，血凝抑制滴度下降，影響結(jié)果判定甚至誤判。

5 正確選擇96孔V型血凝反應(yīng)板

96孔反應(yīng)板選擇是否正確對試驗結(jié)果會產(chǎn)生較大影響。在學(xué)生練習(xí)中，我們選擇有機(jī)玻璃板、亞克力細(xì)胞培養(yǎng)板、一次性96孔反應(yīng)板(底部分U型和V型，孔底有110度和90度)，對比試驗結(jié)果差距甚大，板孔傾斜的角度會影響紅細(xì)胞的沉降速度，細(xì)胞培養(yǎng)板嚴(yán)重影響血凝試驗判定結(jié)果，效果最好的是一次性96孔V型90度血凝反應(yīng)板。此外要保證板面水平、孔底潔凈，避免使用陳舊反應(yīng)板和有污物或彎曲傾斜等不合格的反應(yīng)板，否則會因非特異性凝集出現(xiàn)結(jié)果不正確或跳孔現(xiàn)象[4]。

6 抗原對試驗結(jié)果的影響

抗原是影響新城疫檢測結(jié)果的主要因素之一，同一抗原最好2瓶以上混勻配置分裝使用。若抗原變質(zhì)、陳舊或反復(fù)凍融等都會影響紅細(xì)胞的凝集力，造成解凝現(xiàn)象，嚴(yán)重影響試驗結(jié)果，所以抗原必須新鮮。4HAU的配置是根據(jù)血凝試驗結(jié)果進(jìn)行的，在判讀血凝試驗結(jié)果時一定要嚴(yán)格按照《雞新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550—2008)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確判讀，然后精確計算出生理鹽水和抗原的量，選擇適量的移液器先于小燒杯內(nèi)準(zhǔn)確加入生理鹽水，再加入抗原吹洗混勻。若混勻不均，濃度高的血凝抑制價會降低，濃度低的血凝抑制價會升高。競賽中因4HAU病毒抗原濃度對試驗結(jié)果會造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，所以在時間允許的情況下，最好做1次回歸驗證，以校正4HAU病毒的配置濃度。

7 判定結(jié)果時間及判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《雞新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550—2008)標(biāo)準(zhǔn)，在結(jié)果判定上不管是血凝試驗還是血凝抑制試驗均要銘記“明顯”和“完全”2字。“明顯”是2個試驗均以生理鹽水對照孔紅細(xì)胞呈“明顯”鈕扣狀沉淀到孔底為判定標(biāo)準(zhǔn)；2個“完全”區(qū)別在于：血凝試驗時，正面傾斜反應(yīng)板后紅細(xì)胞“完全”不流動，即以完全凝集病毒的最大稀釋度確定為該抗原的血凝滴度；血凝抑制試驗時，反面傾斜反應(yīng)板，以紅細(xì)胞呈淚珠狀“完全”流下判讀為血凝抑制的滴度?？傊?，正確判定結(jié)果的時間是以陽性、陰性和生理鹽水對照成立前后5 min內(nèi)判定記錄結(jié)果最好[2]。

8 小結(jié)

上述影響“雞新城疫抗體水平測定”結(jié)果的因素僅是筆者近幾年指導(dǎo)學(xué)生技能競賽的一些體會，在實際生產(chǎn)和工作中，影響抗體水平測定結(jié)果的因素還很多，每一環(huán)節(jié)都應(yīng)做到認(rèn)真細(xì)致，嚴(yán)格按照規(guī)程進(jìn)行重復(fù)規(guī)范操作訓(xùn)練和提煉總結(jié)，發(fā)現(xiàn)問題及時糾正，才能保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確無誤，才能讓參賽選手在競賽中拿到好成績，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。