陳振宇

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

免疫反應(yīng)被抗原激活后，在消滅抗原的同時，甚至當(dāng)抗原已被清除后，激活的淋巴細(xì)胞凋亡延遲，且將自身組織當(dāng)作靶抗原予以殺傷，產(chǎn)生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病臨床表現(xiàn)多樣，發(fā)病機(jī)理未明，尚缺乏理想治療方法。臨床治療方案除控制發(fā)病誘因外，主要采用抑制或阻斷體內(nèi)病理性自身免疫應(yīng)答方法，如激素類藥物、抗風(fēng)濕藥物、免疫抑制劑等，但這些藥物無法徹底根治。隨著以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)的崛起，許多疾病有望通過基因治療讓患者獲得痊愈，而且近年來與自身免疫相關(guān)的基因，細(xì)胞因子和信號通路相繼被發(fā)現(xiàn)，這為治療自身免疫性疾病提供了很多新的思路。

1 CRISPR/CAS9系統(tǒng)簡述

1.1 CRISPR/CAS9的發(fā)現(xiàn)

早期，研究者們認(rèn)為像細(xì)菌和古細(xì)菌這樣的單細(xì)胞生物只有簡單的免疫防御機(jī)制，而缺乏“記住”病原體的能力。然而，Ishino等[1]發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因編碼區(qū)下游存在一段由長度為29 bp的重復(fù)片段和32～33 bp的非重復(fù)片段間隔相連的重復(fù)序列，之后的研究發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)結(jié)構(gòu)在細(xì)菌和古細(xì)菌中普遍存在[2]。21世紀(jì)初，該結(jié)構(gòu)被正式定義為Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。CRISPR/Cas系統(tǒng)類似于真核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠“記住”之前攻擊過細(xì)菌的病原體，并在病原體再次攻擊宿主時迅速建立有效的反應(yīng)，清除病原體[3]。在CRISPR/Cas發(fā)現(xiàn)后不久，科學(xué)家開始使用各種CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性基因改造，并最終用于基因治療，如今，CRISPR/Cas被認(rèn)為是開發(fā)針對疾?。ㄈ绨┌Y、單基因疾病和自身免疫性疾?。┓肿盈煼ㄗ钣星巴镜墓ぞ咧籟4]。

1.2 CRISPR/CAS9的結(jié)構(gòu)

作為一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的存在使得原核生物可以“記住”那些來自病毒或者噬菌體的外源DNA，然后阻止這些DNA在原核生物體內(nèi)的復(fù)制[5]，從而防止原核生物再次受到相同外源DNA的攻擊，類似于真核生物中的RNAi系統(tǒng)[6]。2007年，在嗜熱鏈球菌中首次發(fā)現(xiàn)CRISPR作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的證據(jù)，該項(xiàng)研究表明，CRISPR間隔區(qū)的序列與特定噬菌體基因組序列之間的序列同源性是CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用的前提[7]。此外，又證明了新的間隔重復(fù)單位是在被噬菌體攻擊之后獲得的，并且cas基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是CRISPR系統(tǒng)功能不可缺失的一部分。

一個典型的CRISPR/Cas基因序列由三個部分組成。分別是CRISPR序列，間隔重復(fù)序列以及cas基因序列。CRISPR序列在不同原核生物基因組中的數(shù)量可能有所不同，但每個CRISPR位點(diǎn)之前都含有一個富含AT的不保守的前導(dǎo)序列[8]，長度從幾個堿基對到一百個堿基對不等。該序列對于CRISPR的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，缺乏前導(dǎo)序列的CRISPR片段沒有顯示出能夠獲得新的間隔重復(fù)單位的能力[9]。

CRISPR 序列的第二部分是由間隔重復(fù)序列組成，每個單位都有一個間隔重復(fù)序列，在不同的物種、菌株，甚至在同一基因組的不同位點(diǎn)之間都有所不同，其后緊連著一個與病毒基因組中原間隔序列相同的間隔序列。每個序列重復(fù)間隔單元的數(shù)量從幾個到幾百個不等，目前已知的最高數(shù)量的重復(fù)間隔單元是氯氟烴屬植物基因組中的374個[10]。

cas 基因構(gòu)成了CRISPR基因序列的第三部分。這些基因通常位于重復(fù)序列之后，并增加了CRISPR系統(tǒng)的可變性，因?yàn)槊總€基因集群都有不同的cas基因集。迄今為止，已鑒定出40多個cas基因家族，其中六個cas基因家族存在于幾乎所有具有CRISPR序列（Cas1至Cas6）的物種中，因此被稱為“核心”cas基因。

1.3 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

CRISPR 功能分為三個階段：適應(yīng)、CRISPR RNA的形成和干擾。在第一階段，當(dāng)外源DNA入侵細(xì)菌時，其CRISPR系統(tǒng)會特異性地捕獲一段被稱為proto-spacers的外源DNA序列插入到前導(dǎo)序列與間隔重復(fù)序列之間，并進(jìn)行一次重復(fù)片段的復(fù)制，形成一段新的重復(fù)單元，這些重復(fù)單元就是細(xì)菌特異性免疫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。值得注意的是，外源DNA的捕獲并不是完全隨機(jī)的，在這些被捕獲的DNA序列下游通常有一段序列保守的特殊結(jié)構(gòu)，被稱為PAM位點(diǎn)[11]。PAM位點(diǎn)的存在可能是CRISPR系統(tǒng)區(qū)分自身DNA與外源DNA而避免發(fā)生自身免疫的機(jī)制之一[12]，同時也是基因編輯時靶序列選擇的重要需求[13]。在第二階段，形成的重復(fù)單元會被轉(zhuǎn)錄形成前體CRISPRRNA(Pre-crRNA)，在RNAseⅢ的作用下成熟。成熟的crRNA與tracrRNA通過堿基配對形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，Cas9蛋白結(jié)合形成靶向切割復(fù)合體對外源DNA進(jìn)行特異切割，達(dá)到識別和降解外源DNA的目的。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9用于篩選自身免疫性疾病調(diào)控基因

CPISPR/Cas9 有望用于治療單基因疾病和大多數(shù)自身炎癥性疾病。自身免疫性疾病的遺傳背景復(fù)雜，多基因多通路參與發(fā)病機(jī)制，且易受外部環(huán)境的影響，CRISPR/Cas技術(shù)誘導(dǎo)基因失活已經(jīng)在多個研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。

有研究表明Treg細(xì)胞的不穩(wěn)定則會促進(jìn)自身免疫或更多更有效的抗腫瘤免疫，其主要特征表現(xiàn)為主要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的缺失及促炎性特性的獲得。在一項(xiàng)研究中，研究人員開發(fā)出了一種用于初級小鼠Treg細(xì)胞表型研究的基于CRISPR的聯(lián)合篩選平臺，同時研究人員利用該技術(shù)對大約500個核內(nèi)因子進(jìn)行了靶向功能缺失的篩選分析，從而識別出能促進(jìn)或干擾Foxp3表達(dá)的基因調(diào)節(jié)程序[14]。此外，有研究團(tuán)隊(duì)使用CRISPR全基因組篩選技術(shù)，在T1D（1型糖尿?。┬∈竽Ｐ椭欣米陨砻庖叩倪x擇性壓力在自身免疫性糖尿病中進(jìn)行無偏倚的全基因組搜索，以尋找胰島β細(xì)胞存活的修飾因子[15]。

許多遺傳變異與自身耐受性的喪失及自身免疫的發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在一些自身免疫性疾病患者的樣本中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種遺傳變異，其中約90%存在于非編碼區(qū)和免疫增強(qiáng)子[16]。具有順式調(diào)節(jié)和表觀遺傳特征的非編碼區(qū)的遺傳調(diào)控受損是自身免疫性疾病的主要基礎(chǔ)，證明這些變異是否是免疫功能的假定控制因子的一個潛在方法是使用CRISPR進(jìn)行序列微干擾，該方法已被用于識別功能性非編碼區(qū)[17]。這些區(qū)域中的一些序列作為增強(qiáng)子，可能對免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，對特定的細(xì)胞外環(huán)境或刺激做出反應(yīng)?；贑RISPR的實(shí)驗(yàn)也能用于識別這些重要的自身免疫風(fēng)險基因座的調(diào)控序列，如CD69和IL2RA，后者與克羅恩病有關(guān)[18,19]。此外，CRISPR篩選也被用于PD-1和PD-L1的假定調(diào)節(jié)因子的研究[20]。

2.2 CRISPR/Cas9用于構(gòu)建自身免疫性疾病模型

CRISPR 亦被運(yùn)用于某些疾病模型的構(gòu)建。例如，一組研究人員創(chuàng)建了家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥2（FHL2）模型，以測試在無法進(jìn)行骨髓移植時，與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)作為替代療法的效果[21]。利用CRISPR對自身免疫調(diào)節(jié)因子基因（AIRE）也進(jìn)行了研究，揭示了AIRE的干擾導(dǎo)致自身免疫的機(jī)制之一是通過破壞胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞（mTECs）與胸腺細(xì)胞之間的粘附[22]。

在另一項(xiàng)研究中[23]，研究人員運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備了Trex1D18N/D18N點(diǎn)突變小鼠，該小鼠展現(xiàn)出了許多人類自身免疫的癥狀，包括生存時間顯著下降，心臟、腎臟的多個器官受損，自身抗體增加等。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立的這些自身免疫性疾病模型對后續(xù)的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要意義。

2.3 CRISPR/Cas9用于自身免疫性疾病治療

有一些免疫系統(tǒng)的疾病是由單基因紊亂引起的，例如周期性發(fā)熱綜合征、原發(fā)性免疫缺陷和某些自身免疫性疾病等可以用CRISPR來進(jìn)行治療，這些疾病中的大多數(shù)都是由于生殖系中的基因變異引起的，使得造血干細(xì)胞能夠產(chǎn)生基因變異的祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞。因此，異基因干細(xì)胞移植通常是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）[24]或慢性肉芽腫性疾病的治療方法，然而，時常發(fā)生移植物抗宿主的情況，可能會對預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響。通過使用CRISPR，可以在患者自身的造血干細(xì)胞中進(jìn)行基因修飾，插入正常的基因拷貝，然后產(chǎn)生自體移植的細(xì)胞庫，可以在沒有移植物抗宿主風(fēng)險的情況下重建免疫系統(tǒng)的功能[25]。

類似的方法也被用于鐮狀細(xì)胞病。在一項(xiàng)研究中，來自HBB基因有純合錯義突變的SCD患者的iPSCs通過CRISPR與含有野生型HBB等位基因的DNA模板進(jìn)行同源重組修飾，使得常規(guī)的β珠蛋白可以正常表達(dá)[26]。

在分化的免疫細(xì)胞也可以通過CRISPR進(jìn)行突變糾正。IL2RA的隱性突變導(dǎo)致一個有自身免疫性疾病家族史的患者FOXP3 Tregs中IL2受體α鏈處于低水平狀態(tài)，一項(xiàng)研究在利用CRISPR進(jìn)行靶向修飾后，患者的T細(xì)胞開始表達(dá)正常水平的IL2RA[27]。

CRISPR 修飾的Tregs過繼細(xì)胞療法也是治療自身免疫性疾病的方法之一。在模式動物中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通過進(jìn)行的Treg移植，顯示出改善的跡象；然而，在人類RA患者中嘗試這種方法之前，維持Treg的分化是一個重要的問題。CRISPR/Cas系統(tǒng)也被用于修飾可能影響FOXP3表達(dá)的基因，使得Treg的表型占優(yōu)勢，并促進(jìn)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎過繼Treg治療的效果[28]。

另外一項(xiàng)最新的成果中，研究人員運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)對A20進(jìn)行了研究[29]，結(jié)果表明A20去泛素化酶（DUB）結(jié)構(gòu)域的遺傳變異增加了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險。A20由基因TNFAIP3進(jìn)行編碼，是NF-κB的負(fù)調(diào)節(jié)劑，DUB結(jié)構(gòu)域可以通過結(jié)構(gòu)變化來降低或增加NF-κB活性[30-32]，因此可以對NF-κB誘導(dǎo)的促炎和存活基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是有其他報道表明A20的DUB活性對其NF-κB抑制功能并不是必要的[33]。因此，由A20 DUB結(jié)構(gòu)域的遺傳破壞引起的自身免疫風(fēng)險增加可能是由NF-κB途徑以外的其他機(jī)制引起的。

利用CRISPR/Cas對表觀遺傳進(jìn)行調(diào)控也被用于治療自身免疫性疾病。Jing等人通過CRISPR/Cas序列干擾開發(fā)了一種具有miR-155表達(dá)沉默的巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，在該細(xì)胞系中，促炎細(xì)胞因子的表達(dá)顯著降低，這種方法可能是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種途徑[34]。生物藥物的常規(guī)抗細(xì)胞因子治療通常由于在非靶組織中的抑制而具有副作用。然而，使用CRISPR/Cas9，Brunger等人實(shí)現(xiàn)了生物藥物的閉環(huán)生產(chǎn)。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)將IL1R拮抗劑和STNFR 1-鼠IgG的基因插入鼠iPSC CCL2基因的位點(diǎn)。在炎癥過程中，CCL2表達(dá)對白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞暴露于炎癥信號時，細(xì)胞因子拮抗劑的表達(dá)減輕了白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子α的體外病理生理效應(yīng)[35]。

3 總結(jié)與展望

2020 年10月，瑞典皇家科學(xué)院宣布，將2020年諾貝爾化學(xué)獎授予Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna，以表彰她們在“憑借開發(fā)基因組編輯方法”方面作出的貢獻(xiàn)，意味著此項(xiàng)技術(shù)迎來了一個嶄新的時代，它將會逐漸地滲入人類的日常生活和醫(yī)療健康，如可以用于提高部分農(nóng)產(chǎn)品的抗病性和產(chǎn)量，不需要再利用雜交選種的方式。它為疾病建模、基因篩選以及基因沉默、插入、干細(xì)胞修飾和表觀遺傳修飾等領(lǐng)域提供了一種簡單且廉價的方法，讓科學(xué)家們在各自的領(lǐng)域有了新的方向和突破。雖然這項(xiàng)技術(shù)為科學(xué)研究提供了諸多便利，由于自身免疫性疾病多與遺傳相關(guān)，且多基因多通路參與發(fā)病機(jī)制，CRISPR可能是通過使用針對自身免疫性疾病患者的個性化藥物來實(shí)現(xiàn)疾病治愈的有力治療手段之一，但需要注意的是單基因的敲除是否會影響機(jī)體其他功能的缺失或者導(dǎo)致其他疾病，所以對于CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步深入研究，以利用此項(xiàng)技術(shù)的最大潛力來開發(fā)針對特定疾病的個性化治療方法。