李兵兵，龍慧，伍恩慧，李祎，夏寧，滕建文，黃麗，韋保耀

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合專家委員會于2001年提出益生菌科學(xué)定義：益生菌是指活的微生物，當(dāng)攝取足夠數(shù)量時，對宿主健康有益[1]。而益生菌在體內(nèi)產(chǎn)生有益作用的活菌數(shù)量應(yīng)不少于106cfu/g[2,3]，因此保持益生菌在加工過程中的活性顯得十分重要。冷凍干燥是保持益生菌活性最常用和最成功的技術(shù)之一[4,5]。但冷凍干燥會使益生菌遭受低溫、冷凍、滲透、低壓和干燥脅迫，造成細(xì)胞膜功能損傷以及細(xì)胞內(nèi)酶活性降低，從而導(dǎo)致益生菌的活力喪失[6-8]。影響冷凍干燥后益生菌活力的因素有很多，包括菌的特性、生長介質(zhì)、冷凍干燥前預(yù)處理、冷凍干燥工藝以及冷凍干燥保護劑[9,10]。其中冷凍干燥保護劑具有提高益生菌的抗凍性及延長益生菌粉儲藏時間的雙重作用，是目前研究的熱點[11,12]。而蛋白質(zhì)和碳水化合物由于來源天然、無毒和良好的生物相容性被廣泛用作益生菌冷凍干燥保護劑[13]。其中碳水化合物類保護劑能提高凍干體系的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從而減少益生菌細(xì)胞膜和酶因冰晶的生成而受到的損傷[14,15]。一些具有益生作用的碳水化合物類保護劑如果寡糖[16]、低聚半乳糖[17]等在減少冰晶破壞的同時還具有促進益生菌在腸道增殖的功能。然而由于碳水化合物類保護劑的乳化性較差，以及凍干后疏松多孔抗機械壓力差，不足以有效保護益生菌，通常會將其與蛋白類保護劑復(fù)合以提高凍干保護效果[18,19]。

銀耳多糖（Tremellapolysaccharides，TPS）是一類具有益生活性的真菌多糖。有研究表明銀耳多糖能夠促進家禽腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖，改善家禽的腸道有益菌群[20]；目前，銀耳多糖已被用于合生元產(chǎn)品中[21]；此外，由于其物理特性上的高黏與乳化性，已有研究將其用于改善酸奶的口感[22]及提高飲料穩(wěn)定性[23]等食品工業(yè)中；而且銀耳多糖還能減少冰淇淋中冰晶的生成[24,25]。銀耳多糖的界面性質(zhì)和益生作用使其具備作為益生菌功能性冷凍干燥保護劑的潛力，而益生元作為保護劑以提高益生菌在生產(chǎn)和儲藏過程中的活力在研究中受到了廣泛的關(guān)注[26]。然而目前還沒有研究報道銀耳多糖在益生菌冷凍干燥保護劑領(lǐng)域的應(yīng)用。

因此，基于銀耳多糖界面性質(zhì)差的缺點，本試驗以銀耳多糖復(fù)合酪蛋白酸鈉作為冷凍干燥保護劑，以植物乳桿菌為試驗菌株，探討銀耳多糖作為一種具有益生活性的益生菌冷凍干燥保護劑的可行性，為銀耳多糖的開發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌Lp-115（Lactobacillus plantarumLp-115），丹尼斯克有限公司；銀耳子實體多糖，上海輝文生物技術(shù)股份有限公司；酪蛋白酸鈉（Sodium caseinate，NaCS），山東德佳生物有限公司；己糖激酶、丙酮酸激酶及ATP酶檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；MRS培養(yǎng)基所用試劑及其它試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機，德國Christ公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；磁力攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠；渦旋儀，意大利VELP科學(xué)儀器有限公司；TLE204E，分析天平、pH計，上海梅特勒－托利多儀器有限公司；Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀，美國熱電公司；SU-1510型掃描式電子顯微鏡（SEM），日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

購買的植物乳桿菌按3.0%的接種量置于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，活化至第三代，然后在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h；之后再挑單菌落于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，最后再按3.0%的接種量轉(zhuǎn)接到30 mL MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)11 h后，離心（4 ℃，4000 r/min，10 min，）收集菌泥，將收集到的菌泥用無菌生理鹽水洗滌兩次后，重懸于30 mL無菌蒸餾水中得到菌液備用；同時用平板計數(shù)法對該菌液計數(shù)。

1.3.2 植物乳桿菌凍干粉的制備

冷凍干燥保護劑的配制：分別配制濃度為4.0%（m/m）的銀耳多糖和酪蛋白酸鈉溶液，并將兩者分別按1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的質(zhì)量比（m/m）混合均勻，80 ℃滅菌30 min，冷卻后作為復(fù)合保護劑備用。

凍干菌粉制備：取上述配制的保護劑與菌液混合均勻，并添加無菌蒸餾水調(diào)整保護劑的終濃度為2.0%，保護劑與菌液的比例為5:1（m/V），空白對照組加相同比例的無菌蒸餾水。將制備的混合液于-80 ℃預(yù)凍2 h后，進行冷凍干燥。冷阱溫度-80 ℃，真空度0.3 Pa，溫度25 ℃，干燥時長48 h。

1.3.3 植物乳桿菌存活率（Viability）的測定

取0.1 g凍干菌粉于9.9 mL無菌生理鹽水中完全溶解，梯度稀釋后利用平板計數(shù)法計數(shù)。根據(jù)式（1）計算存活率。式中NA是凍干后活菌數(shù)，NB為凍干前活菌數(shù)，單位為cfu/g。

1.3.4 傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）分析

參考Xue等[27]的方法并稍做修改，稱取1 mg制備的菌粉與100 mg溴化鉀研磨混合壓片，然后進行傅里葉紅外光譜測定。測定范圍為400～4000 cm-1的吸收光譜，分辨率為4 cm-1，環(huán)境溫度為25 ℃，掃描信號累加16次，OPD速度0.2 cm/s。

1.3.5 掃描電鏡

參考Li等[7]的方法并稍做修改，取少量制備的菌粉于貼有導(dǎo)電膠的鋁片表面，將菌粉涂抹均勻，多余的菌粉用氮氣小心吹去，然后將鋁片鍍金5 min。用掃描電子顯微鏡在5 kV的電壓下，圖像放大10000倍，獲取樣品的微觀圖像。

1.3.6 糖代謝關(guān)鍵酶活性測定

1.3.6.1 乳酸脫氫酶的活性測定[28]

超聲提取乳酸脫氫酶：取制備的菌粉0.1 g溶解于9.9 mL無菌生理鹽水后，離心收集菌體，之后將菌體重新懸浮于同體積且含有2 mmol/L EDTA的磷酸鉀溶液（pH 7.0，0.2 mol/L）中；取5 mL菌懸液在超聲細(xì)胞破碎儀中冰浴超聲100次，功率為20%，每次超聲3 s，間隔10 s；最后離心（10000 r/min，4 ℃）收集上清液，置冰上待測。

酶活測定：測定體系共3 mL，含有0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.3）2.7 mL，6.6 mmol/L NADH和30 mmol/L丙酮酸鈉各0.1 mL，以及0.1 mL酶提取液，在25 ℃進行催化反應(yīng)，每0.5 min讀取一次吸光值，連續(xù)5 min，以吸收值對時間作圖，取初始的線性范圍，計算每分鐘降低的吸收值，以每分鐘降低1.0個吸收值為1個酶活單位，以U表示。

1.3.6.2 己糖激酶、丙酮酸激酶及ATP酶活性測定

己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）及ATP酶活性測定按照酶活試劑盒（購自索萊寶）上的方法對三種關(guān)鍵酶進行活性測定。具體流程如下所述：

酶提取液配制：按照操作說明將酶活試劑盒中的各種試劑混合配制酶提取液；

超聲提取酶：先收集細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500:1的比例加入酶提取液，超聲波破碎細(xì)菌（冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)100次）；離心（8000 r/min，4 ℃，10 min），取上清，置冰上待測；

酶活測定：按照酶活試劑盒說明測定各酶活力。

1.3.7 細(xì)胞膜性質(zhì)分析

1.3.7.1 胞內(nèi)Ca2+含量測定[29]

采用Fluo3-AM熒光探針法測定制備的菌粉胞內(nèi)Ca2+含量：取5 mmol/L的Fluo3-AM/DMSO熒光染液1 μL置于5 mL菌液中（1.0×109cfu/mL），避光條件下，37 ℃孵育30 min，離心（10000 r/min，5 min）棄上清，用生理鹽水洗滌后，重懸于5 mL生理鹽水中。將染色后的菌液置于熒光分光光度計內(nèi)測熒光強度，λex為488 nm，λem為528 nm。

1.3.7.2 細(xì)胞膜流動性

參照Li等[30]的方法測定細(xì)胞膜的流動性，具體流程如下所述：

熒光染色劑的配制：將1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）溶于四氫呋喃配制2 mmol/L的DPH染色儲備液，每次實驗前用0.01 mol/L的PBS溶液稀釋成2 μmol/L。

菌粉前處理：制備的菌粉用無菌水復(fù)溶后離心（4 ℃，8000 r/min，10 min）收集菌體，洗滌后重懸于無菌水中并調(diào)整其濃度為1×107cfu/mL；取2 mL菌液用2 mL體積分?jǐn)?shù)為0.37%的甲醛溶液固定30 min，離心（4 ℃，8000 r/min，10 min）收集菌體并用0.01 mol/L的PBS溶液洗滌兩次，加入2 mL PBS（0.01 mol/L）溶液重懸細(xì)菌，再加入0.2 mL DPH染色液染色45 min，離心（4 ℃，8000 r/min，10 min）收集菌體并用0.01 mol/L的PBS溶液洗滌兩次，重懸于5 mL PBS（0.01 mol/L）溶液后置于熒光分光光度計檢測熒光強度，λex為361 nm，λem為443 nm。

1.3.7.3 細(xì)胞膜完整性

細(xì)胞膜完整性的測定參考Li等[7]的方法并稍作修改。將凍干的菌粉溶解于無菌生理鹽水中，菌濃度調(diào)整為1.0×107cfu/mL；取1 mL菌液與5 mL碘化丙啶溶液（pH 7.2，60 mmol/L）混勻，在25 ℃暗處孵育15 min；離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，60 mmol/L）洗滌兩次，去除未結(jié)合的染料，重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，60 mmol/L）中備用。在流式細(xì)胞儀上測定碘化丙啶熒光，每個樣本分析10000個細(xì)胞，根據(jù)膜完整細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值表征膜完整性百分比。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 7.5作圖，SPSS 10.0進行單因素方差分析，p＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護劑對凍干植物乳桿菌存活率的影響

以菌存活率為指標(biāo)，評價不同比例的銀耳多糖與酪蛋白酸鈉復(fù)合保護劑的保護效果，結(jié)果如圖1所示。在未添加保護劑時，植物乳桿菌在冷凍干燥過程中的存活率只有0.52%，幾乎全部失活；添加銀耳多糖、酪蛋白酸鈉及兩者復(fù)合物處理，植物乳桿菌的存活率均可達到40.00%以上，其中不同比例的保護劑對植物乳桿菌的保護效果是有所差異的。單一的銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的保護效果差異不顯著，植物乳桿菌的存活率分別為42.19%和47.98%；復(fù)合保護劑中銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為1:3、1:2、1:1時，復(fù)合保護劑的保護效果與單一的銀耳多糖保護劑沒有顯著性差異，植物乳桿菌的存活率分別為43.66%、47.41%和47.43%；復(fù)合保護劑中銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為2:1時，復(fù)合保護劑的保護效果與單一的銀耳多糖保護劑具有顯著性差異，植物乳桿菌的存活率為48.85%；當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例達到3:1時，植物乳桿菌的存活率達到最大值55.39%。銀耳多糖與酪蛋白酸鈉都能顯著提高植物乳桿菌在冷凍干燥過程中的存活率，但當(dāng)兩者復(fù)合時，少量的酪蛋白酸鈉會顯著提升銀耳多糖對植物乳桿菌的凍干保護效果，過量的酪蛋白酸鈉對銀耳多糖的保護效果提升不顯著。這可能是由于兩者復(fù)合后銀耳多糖能更有效的抑制胞外冰晶的生成從而減少菌細(xì)胞受到損傷[31]。Li等[7]發(fā)現(xiàn)滑菇多糖在凍干過程中對干酪乳桿菌也有一定的保護作用，當(dāng)滑菇多糖濃度為0.04、0.02、0.01、0.005、0.002和0.001 mg/mL時，干酪乳桿菌凍干后的存活率分別為74.5%、74.4%、66.3%、62.2%、56.8%和42.5%，當(dāng)其與輔助冷凍保護及混合時，干酪乳桿菌的存活率分別提高至80.4%、80.5%、75.5%、73.1%、66.2%和50.5%，顯示出明顯的協(xié)同作用且保護效果強于銀耳多糖。Guedesa等[32]的研究表明濃度為10%（m/V）的β-葡聚糖作為凍干保護劑時，Lactobacillus plantarumLP-49和Lactobacillus plantarumLP-201凍干后的存活率為18.20%與12.59%，保護效果弱于銀耳多糖。

圖1 植物乳桿菌凍干后的存活率Fig.1 Survival rate ofLactobacillus plantarum after freeze-drying

2.2 凍干菌粉的紅外光譜圖

圖2 植物乳桿菌凍干粉的FT-IR圖Fig.2 FT-IR spectrum of bacterial powder

銀耳多糖復(fù)合酪蛋白酸鈉能夠提高菌粉存活率，為了進一步研究兩者是否發(fā)生相互作用從而對植物乳桿菌的活力保持產(chǎn)生影響，對制備的菌粉進行紅外光譜分析。從圖2可知，TPS的吸收峰出現(xiàn)在3417 cm-1、2925 cm-1、1650 cm-1、1419 cm-1和1076 cm-1附近，分別代表O-H伸縮振動峰，C-H伸縮振動變角振動峰，糖醛酸中的羰基C=O振動，羰基上C-O的伸縮振動峰以及C-O-C變角振動峰[33,34]。NaCS的吸收峰出現(xiàn)在3423 cm-1、2929 cm-1和1076 cm-1附近，分別代表O-H伸縮振動峰，C-H鍵的伸縮振動以及N-H面內(nèi)彎曲振動；酪蛋白酸鈉有兩組特征吸收譜帶：酰胺I帶和酰胺II帶，其波長分別對應(yīng)1700～1600 cm-1和1550～1400 cm-1[35]，且隨著銀耳多糖的加入，酰胺I帶和II帶的伸縮振動峰發(fā)生偏移，這說明酪蛋白酸鈉與銀耳多糖發(fā)生了相互作用；在1419 cm-1附近，銀耳多糖羰基上C-O的伸縮振動峰向高波長方向移動，這表明銀耳多糖與酪蛋白酸鈉分子之間可能存在氫鍵作用；此外，在1076 cm-1附近，銀耳多糖糖環(huán)中的C-O-C變角振動峰強度隨著酪蛋白酸鈉的增加發(fā)生偏移，也表明TPS與NaCS分子間存在相互作用[36]。Sohrab Sharifiab等[37]也利用傅里葉紅外光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白與阿拉伯膠之間形成縮合物提高了植物乳桿菌在奶酪中的活性。

2.3 凍干菌粉的形態(tài)觀察

圖3 植物乳桿菌凍干粉的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope of bacterial powder

通過掃描電子顯微鏡觀察冷凍干燥制得的菌粉，結(jié)果如圖3所示。添加保護劑后冷凍干燥制得的菌粉為形狀和尺寸不規(guī)則的薄片狀，植物乳桿菌附著在保護劑表面，且菌體隨機分布。由于冷凍干燥過程涉及到冷凍、初級干燥（升華）、次級干燥（解吸），溶液中水分在真空環(huán)境中直接從冰升華成水蒸氣，因此菌粉表面會因失水而出現(xiàn)微孔。通過對比不同比例保護劑菌粉的掃描電鏡圖，發(fā)現(xiàn)其微觀結(jié)構(gòu)具有明顯差異。酪蛋白酸鈉凍干后結(jié)構(gòu)致密，但表面孔隙較多；銀耳多糖凍干后結(jié)構(gòu)疏松，但表面孔隙少。兩者復(fù)合后，隨著復(fù)合保護劑中銀耳多糖的增加，菌粉表面的微孔越來越少，出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于銀耳多糖一方面能夠提高保護劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從而減少冰晶的生成[38]，另一方面會增強保護劑的黏性，進而使菌粉表面結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，減少了凍干過程中的坍縮現(xiàn)象；同時可以看出，酪蛋白酸鈉的添加使得菌粉表面更加致密。菌粉微觀結(jié)構(gòu)表明，銀耳多糖能夠抑制凍干過程中冰晶的生成，降低菌粉表面的孔隙率；同時復(fù)合保護劑結(jié)合了單一保護劑各自的優(yōu)勢，改善了菌粉的表面性質(zhì)，可能會有利于菌粉的儲藏穩(wěn)定性。Diako等[39]的研究也發(fā)現(xiàn)明膠包埋的益生菌粉表明光滑、均勻、結(jié)構(gòu)更為致密，而果膠包埋的益生菌粉則呈現(xiàn)出粗糙、網(wǎng)狀、有裂隙的結(jié)構(gòu)，兩者結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致了在儲藏過程中對益生菌保護效果的不同；而銀耳多糖包埋的菌粉表面沒有明顯的裂隙，表現(xiàn)出比果膠更好的包埋效果。

2.4 冷凍干燥保護劑對植物乳桿菌細(xì)胞膜性質(zhì)的影響

2.4.1 冷凍干燥保護劑對細(xì)胞膜通透性的影響

圖4 不同保護劑對植物乳桿菌胞內(nèi)鈣離子含量的影響Fig.4 Effect of different protectants on intracellular calcium content ofLactobacillus plantarum

通過測定菌體細(xì)胞膜的性質(zhì)變化來進一步說明保護劑的保護效果。由于冷凍過程中形成的冰晶會損傷細(xì)胞膜，造成細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致胞外鈣離子內(nèi)流。因此可以通過測定胞內(nèi)鈣離子含量變化來反映細(xì)胞膜的通透性。從圖4可知，未添加保護劑時，Ca2+熒光強度最高，為43.10；添加NaCS后Ca2+熒光強度降低到35.89，且隨著保護劑中銀耳多糖含量的增加，Ca2+熒光強度越來越低；當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為1:3、1:2、1:1、2:1、3:1時，Ca2+熒光強度分別為37.39、34.98、33.50、32.56、29.98。當(dāng)保護劑為銀耳多糖時，熒光強度達到最低，為25.83。說明銀耳多糖對維持細(xì)胞膜具有較強的保護作用。這可能是因為多糖類保護劑中的羥基與磷脂雙分子層形成氫鍵，保持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減少了胞外Ca2+的內(nèi)流[40]。王飚等[41]的研究發(fā)現(xiàn)凍干后的德氏乳桿菌胞內(nèi)鈣離子熒光強度遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，約為正常菌體胞內(nèi)鈣離子熒光強度的5倍，添加有海藻糖保護劑的凍干菌體胞內(nèi)鈣離子熒光強度相對未添加保護劑的菌體降低約40%，保護效果優(yōu)于銀耳多糖。

2.4.2 不同冷凍干燥保護劑對細(xì)胞膜流動性的影響

圖5 不同保護劑對植物乳桿菌細(xì)胞膜流動性的影響Fig.5 Effects of different protectants on membrane fluidity of Lactobacillus plantarum

細(xì)胞膜的流動性可以反映細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)是否完整。當(dāng)熒光探針DPH與細(xì)胞質(zhì)膜中磷脂的脂烴鏈區(qū)結(jié)合時，體系的介質(zhì)黏度增加，順反異構(gòu)化受到抑制而成為唯一能發(fā)光的全反構(gòu)型，此時DPH熒光強度低表明結(jié)構(gòu)有序性低或細(xì)胞膜流動性高[30,42]。由圖5可知，未添加保護劑組的熒光強度最高，為9.82；添加保護劑后熒光強度顯著降低（p＜0.05），說明添加保護劑有利于維持細(xì)胞膜正常的流動性；保護劑為NaCS的菌粉與保護劑為銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為1:3、1:2、1:1和2:1的菌粉的熒光強度無顯著性差異，其熒光強度分別為6.02、6.83、6.58、6.81、6.01；保護劑為銀耳多糖時，熒光強度為4.91。同時可以看出，少量的銀耳多糖對復(fù)合保護劑的保護效果影響不明顯，只有當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例達到3:1時，保護效果才得到顯著增強（p＜0.05）且達到最大，此時熒光強度為3.73。Li等[15]以蔗糖15%（m/V），海藻糖5%（m/V），海藻糖10%（m/V）和重組脫脂牛奶10%（m/V）作為保護劑對Lactobacillus reuteriCICC6226細(xì)胞膜的保護作用，發(fā)現(xiàn)只有海藻糖10%（m/V）和重組脫脂牛奶10%（m/V）能夠改善細(xì)胞膜的流動性。

2.4.3 不同冷凍干燥保護劑對細(xì)胞膜完整性的影響

圖6 不同保護劑對植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.6 Effects of different protectants on the membrane integrity ofLactobacillus plantarum

為進一步說明保護劑對細(xì)胞膜性質(zhì)的影響，本研究利用PI只能進入細(xì)胞膜受損的植物乳桿菌體內(nèi)與其核酸反應(yīng)發(fā)出紅色熒光的原理，通過流式細(xì)胞儀測定其染色情況以表征細(xì)胞膜的完整性。如圖6所示，圖中峰出現(xiàn)在左側(cè)代表未發(fā)出紅色熒光的菌體占總菌數(shù)的比例，右側(cè)代表發(fā)出紅色熒光的菌體占總菌數(shù)的比例。

未經(jīng)冷凍干燥的植物乳桿菌（a）中98.55%的菌未檢測出紅色熒光，說明大多數(shù)菌的細(xì)胞膜完整；在無保護劑（b）的情況下，98.35%的植物乳桿菌經(jīng)冷凍干燥后細(xì)胞膜完整性遭到破壞；而在添加保護劑后，細(xì)胞膜受損的植物乳桿菌比例顯著降低，但各保護劑對細(xì)胞膜的保護作用有所差異。保護劑為NaCS時，細(xì)胞膜受損的植物乳桿菌百分比為59.10%；保護劑為銀耳多糖比酪蛋白酸鈉等于1:3、1:2、1:1、2:1和3:1時，膜受損的植物乳桿菌百分比分別為48.15%、57.40%、39.50%、47.40%、43.40%；保護劑為銀耳多糖時，細(xì)胞膜受損的植物乳桿菌百分比最低，為37.90%。相比于單一的酪蛋白酸鈉保護劑，將其與銀耳多糖復(fù)合后，它的保護效果得到了提升，可能是因為銀耳多糖的加入提高了復(fù)合保護劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從而減少冰晶的形成，進而減少細(xì)胞膜受到的機械損傷[43]。Jéssica等[32]研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖包埋的Lactobacillus plantarumLP-49和Lactobacillus plantarumLP-201在冷凍干燥過程中膜受損的菌占比分別為31.90%和8.90%，而低聚果糖包埋的Lactobacillus plantarumLP-49和Lactobacillus plantarumLP-201在冷凍干燥過程中膜受損的菌占比分別為16.20%和18.80%，多糖對細(xì)胞膜的保護作用受益生菌的固有特性影響。

2.5 不同保護劑對凍干菌粉的糖代謝酶活性的影響

2.5.1 乳酸脫氫酶活性變化

圖7 不同保護劑對乳酸脫氫酶活性的影響Fig.7 Effect of different protectants on LDH activity

凍干后菌粉的活性變化還表現(xiàn)在對細(xì)胞內(nèi)糖代謝酶的影響上[44]。有研究表明，冷凍干燥會對乳酸脫氫酶造成損傷，從而導(dǎo)致植物乳桿菌細(xì)胞的活力下降[45]。從圖7可知，未凍干的菌乳酸脫氫酶活力為0.37 U/mL，凍干后菌的乳酸脫氫酶活力會明顯降低；未添加保護劑時酶活為0.11 U/mL，同時可以看出，在凍干過程中添加保護劑能顯著降低乳酸脫氫酶受到的損傷，當(dāng)保護劑為NaCS以及銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為1:3、1:2、1:1、2:1時，乳酸脫氫酶活力分別為0.25、0.24、0.27、0.26、0.24 U/mL，酶活無顯著性差異；當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為3:1時，保護劑對乳酸脫氫酶的保護效果達到最高水平，此時酶活為0.32 U/mL；但單一的銀耳多糖保護劑對乳酸脫氫酶的保護效果最低，酶活為0.21 U/mL。結(jié)果表明，冷凍干燥會對植物乳桿菌的乳酸脫氫酶造成損傷，而保護劑能降低此種損傷，其中復(fù)合保護劑比單一的銀耳多糖保護劑的效果更好，并且銀耳多糖只有在高添加量時才會顯著提高復(fù)合保護劑對乳酸脫氫酶的保護效果。Li等[15]研究也發(fā)現(xiàn)不同保護劑對乳酸脫氫酶活力有顯著性影響，蔗糖15%（m/V）、海藻糖10%（m/V）以及重組脫脂牛奶10%（m/V）作為保護劑時，乳酸脫氫酶的活力分別為9.11 U/mg、8.38 U/mg和8.96 U/mg，與未凍干的菌的酶活無顯著性差異，而海藻糖5%（m/V）則無法有效保護乳酸脫氫酶。

2.5.2 己糖激酶和丙酮酸激酶活性變化

圖8 不同保護劑對己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）活性的影響Fig.8 Effects of different protectants on the activities of hexokinase (HK) and pyruvate kinase (PK)

己糖激酶和丙酮酸激酶都是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，其活性大小與乳酸菌的糖代謝速率有關(guān)，本研究通過測定冷凍干燥對其活性大小的影響，結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出，未凍干的植物乳桿菌己糖激酶和丙酮酸激酶的活力分別為44.52 U/g和0.77 U/g；無保護劑的植物乳桿菌己糖激酶和丙酮酸激酶分別為33.73 U/g和0.46 U/g；保護劑為NaCS和TPS的植物乳桿菌己糖激酶活力分別為25.69 U/g與39.39 U/g，丙酮酸激酶的活力分別為0.48 U/g與0.67 U/g；保護劑中銀耳多糖比酪蛋白酸鈉等于1:3、1:2、1:1、2:1及3:1時，植物乳桿菌粉的己糖激酶活力分別為29.42、35.98、31.59、30.38、31.18 U/g，丙酮酸激酶的活力分別為0.56、0.57、0.43、0.48、0.71 U/g。盡管不同比例保護劑菌粉的己糖激酶和丙酮酸激酶活性大小不同，但與未添加保護劑的凍干菌粉及未凍干的菌相比，沒有顯著性差異，這一結(jié)果表明冷凍干燥過程中，己糖激酶和丙酮酸激酶的活性并不會受到太大影響，具體原因尚不明確，推測可能與己糖激酶和丙酮酸激酶的亞細(xì)胞定位以及分子量大小有關(guān)。Li等[15]在研究蔗糖、海藻糖、酪蛋白酸鈉、脫脂乳等不同保護劑對冷凍干燥后乳酸桿菌的己糖激酶和丙酮酸激酶活力的影響時，也發(fā)現(xiàn)冷凍干燥對己糖激酶和丙酮酸激酶的影響不大。

2.5.3 ATP酶活性變化

圖9 不同保護劑對ATP酶活性的影響Fig.9 Effect of different protectants on ATPase activity

通過測定冷凍干燥后菌粉ATP酶的活性來反映菌粉活力大小，結(jié)果如圖9所示。從圖9可知，未凍干的菌Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分別為147.62 U/g和68.75 U/g；未添加保護劑的菌凍干后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分別為41.45 U/g和12.73 U/g；保護劑為NaCS時，菌凍干后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分別為82.50 U/g和28.61 U/g；保護劑為TPS時，菌凍干后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分別為117.97 U/g和34.95 U/g；凍干前后兩種ATP酶的活性都具有顯著性變化，而保護劑的添加能降低冷凍干燥對ATP酶活性的損傷。少量添加銀耳多糖并不能顯著提高保護劑對Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的保護效果，只有當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例達到3:1時，保護效果才得到顯著提高，此時Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分別為121.61 U/g和45.64 U/g；同時也可以看到單一的銀耳多糖對Na+-K+-ATP酶的保護作用也很強，說明銀耳多糖在對Na+-K+-ATP酶的保護方面做出了更大的貢獻。銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例為1:3和1:2時，菌凍干后Na+-K+-ATP酶的活力分別為62.62 U/g和69.33 U/g，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分別為23.17 U/g和17.20 U/g；與未添加保護劑組相比，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性大小并沒有顯著性差異，當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的比例達到3:1時，保護效果達到最大，說明銀耳多糖含量低對Ca2+-Mg2+-ATP酶的保護效果沒有促進作用；同時可以看出單一的酪蛋白酸鈉和銀耳多糖保護劑也具有明顯的保護作用。Castro等[45]的研究也表明冷凍干燥過程中ATP酶活性的降低是造成菌粉活力降低的原因之一。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)10%（m/V）的海藻糖對Lactobacillus reuteriCICC6226的ATP酶具有顯著的保護效果，菌凍干后的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶的活力分別為23.44、23.44、24.00 U/mg，與未凍干菌的酶活力大小相比基本不變，表現(xiàn)出比銀耳多糖更佳的保護效果。

3 結(jié)論

本文研究了銀耳多糖與酪蛋白酸鈉在凍干菌粉的制備過程中對植物乳桿菌細(xì)胞膜和糖代謝酶的保護作用。結(jié)果表明，銀耳多糖與酪蛋白酸鈉之間產(chǎn)生了非共價相互作用，菌粉表面的孔隙率隨銀耳多糖含量的增加而降低，當(dāng)銀耳多糖與酪蛋白酸鈉的質(zhì)量比為3:1時：植物乳桿菌的存活率最高（55.39%）；DPH的熒光強度最低（4.91）；菌的乳酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力最高，分別為0.32 U/mL、121.61 U/g及45.64 U/g，但冷凍干燥前后己糖激酶和丙酮酸激酶活力無顯著性變化。此外，菌體細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度隨保護劑中銀耳多糖含量的增加從43.10降低到25.83；保護劑為銀耳多糖時膜受損的菌百分比從98.35%最大降低至37.90%。因此，銀耳多糖對凍干植物乳桿菌的細(xì)胞膜和糖代謝酶具有較強的保護作用。與一些常見的碳水化合物類保護劑如蔗糖、海藻糖和乳糖等二糖相比，銀耳多糖對益生菌的保護效果并沒有優(yōu)勢，但其它二糖并不具備銀耳多糖的益生作用；后續(xù)研究可從優(yōu)化凍干工藝、優(yōu)化保護劑配比和種類以及對銀耳多糖改性等方面提高銀耳多糖對益生菌的凍干保護效果。