周紫晶 范付華 尚先文 覃慧娟 王聰慧 丁貴杰 譚健暉

(1.貴州大學(xué)貴州省森林資源與環(huán)境研究中心 貴州省高原山地林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州大學(xué)林學(xué)院 貴陽(yáng) 550025；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 南寧 530002)

植物的次生生長(zhǎng)即植物器官周長(zhǎng)的增加，莖干的次生生長(zhǎng)是由維管形成層的細(xì)胞分裂造成的，形成層向內(nèi)形成木質(zhì)部，向外產(chǎn)生韌皮部(Mellerowiczetal., 2001; Spiceretal., 2010)。木質(zhì)部的形成包括初生維管組織成束排列、初生維管束內(nèi)或次生維管形成層中的細(xì)胞增殖、木質(zhì)部分化的啟動(dòng)、細(xì)胞擴(kuò)張的調(diào)節(jié)、次生細(xì)胞壁的沉積和細(xì)胞程序性死亡(Nieminenetal., 2004)。次生木質(zhì)部和韌皮部的生長(zhǎng)，導(dǎo)致莖的直徑增加，該過(guò)程是木材積累的主要來(lái)源(Zhaoetal., 2005)。次生壁作為木材生物質(zhì)主要組成成分，由纖維素、半纖維素(木聚糖、葡甘露聚糖)和木質(zhì)素等構(gòu)成，并沉積在一些特殊的細(xì)胞中，如管胞元件、纖維等厚壁細(xì)胞中，為植物提供機(jī)械支持和保護(hù)(Zhongetal., 2015b)。

植物激素是植物自身代謝所產(chǎn)生的一類(lèi)有機(jī)物質(zhì)，對(duì)植物細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育起到重要調(diào)控作用。生長(zhǎng)素即吲哚乙酸(IAA)是一類(lèi)具有一個(gè)不飽和芳香族環(huán)和一個(gè)乙酸側(cè)鏈組成的植物內(nèi)源激素，是最早發(fā)現(xiàn)的一種植物激素，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育各過(guò)程，促進(jìn)木本植物的形成層活動(dòng)和木材形成(Savidge, 1983; 1988)。研究者通過(guò)高親和力傳感器檢測(cè)生長(zhǎng)素信號(hào)，證明其在形成層干細(xì)胞中處于中等水平，在形成層分化的子代細(xì)胞中增加，表明生長(zhǎng)素信號(hào)在形成層分化中的關(guān)鍵作用，生長(zhǎng)素信號(hào)的局部增強(qiáng)是次生生長(zhǎng)所必需的(Bargmannetal., 2013; Mulleretal., 2016; Brackmannetal., 2018)。大量證據(jù)表明，生長(zhǎng)素通過(guò)極性運(yùn)輸參與形成層、木質(zhì)部及韌皮部的分化(Glweileretal., 1998; Yaoetal., 2020)，通過(guò)施加外源生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)形成層的分化(Chenetal., 2019)，誘導(dǎo)分化完整且功能正常的次生木質(zhì)部細(xì)胞(Bjorklundetal., 2007)，且以劑量依賴的方式影響木質(zhì)部和韌皮部的產(chǎn)生和大小，以及次生壁的厚度(Tuominenetal., 1997; Ugglaetal., 1998)。

馬尾松(Pinusmassoniana)是我國(guó)特有的速生樹(shù)種和南方主要造林樹(shù)種之一，具有分布廣、用途廣泛、全樹(shù)綜合利用程度高等特點(diǎn)，在木材加工業(yè)中具有重要的利用價(jià)值(丁貴杰等, 1994)。目前對(duì)馬尾松生長(zhǎng)發(fā)育的研究中，多以施肥、接菌以及營(yíng)林技術(shù)措施等為主要研究方向(吳修蓉等, 2019; 張婷等, 2016; 郭麗玲等, 2019)，對(duì)于噴施外源激素，僅見(jiàn)外源激素對(duì)馬尾松應(yīng)壓木形成影響的研究(陳海燕等, 2015)，未見(jiàn)關(guān)于施加外源激素促進(jìn)其次生生長(zhǎng)機(jī)理的報(bào)道。對(duì)馬尾松的次生生長(zhǎng)進(jìn)行深入研究，解析莖干次生生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理，可以為培育速生高產(chǎn)的馬尾松新品系提供一定的理論參考。本研究通過(guò)施加外源IAA，測(cè)定馬尾松幼苗生長(zhǎng)、生理生化、解剖結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄組水平的變化等，揭示外源IAA對(duì)馬尾松苗期莖干次生生長(zhǎng)的影響，為闡明馬尾松苗期莖干次生生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及激素處理

試驗(yàn)材料為貴州都勻馬鞍山馬尾松國(guó)家林木良種基地提供的馬尾松1.5代種子園半同胞良種繁育的2年生苗木。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的2年生苗木種植于花盆(高17 cm，口徑16 cm)中。緩苗期后進(jìn)行IAA噴施處理，處理時(shí)間160天，一共4種處理： 1)噴施1 mg·L-1濃度IAA； 2)噴施50 mg·L-1濃度IAA； 3)噴施100 mg·L-1濃度IAA； 4)對(duì)照組(噴施蒸餾水)。采取全株噴施的方法，每7天噴施1次激素，噴施至葉片濕潤(rùn)、葉尖有液滴即可。

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定及莖干解剖結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)所有苗木進(jìn)行苗高和地徑的觀測(cè)，每40天測(cè)量1次，共進(jìn)行4次觀測(cè)。苗高用卷尺測(cè)量(精度為0.1 cm)，地徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量(精度為0.01 mm)。苗高和地徑增長(zhǎng)量分別為處理后苗高和地徑值減去初始值(處理前)所得。選擇處理160天的馬尾松莖部材料進(jìn)行石蠟切片觀察，取地徑處0.5 cm長(zhǎng)莖段材料置于FAA固定液中保存，采用石蠟切片的方法制作永久切片(周乃富等, 2018)，番紅固綠染色后用顯微鏡拍照觀察。

1.3 莖干木質(zhì)素、纖維素及半纖維素含量的測(cè)定

木質(zhì)素含量通過(guò)木質(zhì)素含量試劑盒(G0708W48)采用乙?；y(cè)定； 纖維素含量采用纖維素含量試劑盒(G0715W48)測(cè)定； 半纖維素含量采用半纖維素含量試劑盒(G0716W48)測(cè)定。試劑盒均采購(gòu)于蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.4 莖干內(nèi)源激素含量的測(cè)定

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖干以及對(duì)照組(CK)作為試驗(yàn)材料進(jìn)行內(nèi)源激素(生長(zhǎng)素類(lèi)、赤霉素類(lèi)和油菜素內(nèi)酯類(lèi))含量的測(cè)定。取出超低溫保存的生物樣本，用研磨儀研磨(30 Hz，1 min)至粉末狀； 稱取50 mg研磨后的樣本，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用1 mL甲醇︰水︰甲酸(體積比15∶4∶1)進(jìn)行提??； 提取液濃縮后用100 μL 80%甲醇溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)(ExionLCTM AD，https:∥sciex.com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry，MS/MS)(QTRAP? 6500+，https:∥sciex.com.cn/)?；跇?biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建MWDB(Metware Database)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。定量是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM)分析完成(Panetal., 2010)。

1.5 莖干轉(zhuǎn)錄組分析

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖干以及對(duì)照組(CK)作為試驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用 TRIzol(Invitrogen)法提取總RNA，通過(guò)Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，CA，USA)進(jìn)行數(shù)量和完整性評(píng)估，用Illumina NovaSeq6000進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)測(cè)控使用SeqPrep(https:∥github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https:∥github.com/najoshi/sickle)進(jìn)行，使用Trinity(https:∥github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)對(duì)所有 clean data進(jìn)行從頭組裝，然后利用TransRate(http:∥hibberdlab.com/transrate)和BUSCO(Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs，http:∥busco.ezlab.org )對(duì)獲得的初始組裝序列進(jìn)行優(yōu)化過(guò)濾并再次評(píng)估。將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與六大數(shù)據(jù)庫(kù)： NR(ftp:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db)、Swiss-Prot(http:∥ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/swissprot)、Pfam(http:∥pfam.xfam.org/)、COG(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)、GO(http:∥geneontology.org/)和 KEGG(http:∥www.genome.jp/kegg)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得在各數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，并對(duì)各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用軟件RSEM(http:∥deweylab.github.io/RSEM/)對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，使用EDGER軟件包(http:∥www.r-project.org/)鑒定差異表達(dá)基因，將滿足FDR≤0.05且|log2FC|≥1條件的基因確定為顯著差異。

利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋?zhuān)⑺媒Y(jié)果繪制基因GO注釋柱形圖。顯著富集的GO term閾值為P≤0.05。使用KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)超幾何檢驗(yàn)來(lái)確定顯著富集的pathway，其Q≤0.05的pathway定義為顯著富集pathway。所有樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)可在National Center for Biotechnology Information(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)獲得，注冊(cè)號(hào)為PRJNA743934。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 差異基因的RT-qPCR驗(yàn)證

在差異基因中隨機(jī)挑選9個(gè)基因，用軟件primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表1), 在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(FP441)和Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒(FP209)，在四通道梯度熒光定量PCR儀(CFX96 Touch)上評(píng)估差異基因的表達(dá)水平變化。以UBC作為內(nèi)參基因(Fanetal., 2014)，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)含量(Livaketal., 2001)，采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢測(cè)法分析基因表達(dá)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA處理對(duì)馬尾松幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

為了確定外源IAA是否會(huì)影響馬尾松的正常生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)2年生馬尾松幼苗進(jìn)行不同濃度水平的IAA噴施處理，每40天進(jìn)行1次苗高和地徑的測(cè)量，一共進(jìn)行4次測(cè)量。結(jié)果如圖1所示，噴施IAA對(duì)2年生馬尾松的苗高有促進(jìn)作用但是不顯著，而對(duì)地徑有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，且隨著處理時(shí)間的增加，地徑的增長(zhǎng)量也在隨之增加，濃度為100 mg·L-1時(shí)地徑增長(zhǎng)量最大(3.72 mm)，平均增長(zhǎng)量比對(duì)照多33.8%。

圖1 不同濃度IAA處理下馬尾松幼苗苗高(a)和地徑(b)的增長(zhǎng)量Fig.1 Growth of height(a) and ground diameter(b) of P. massoniana seedlings treated with different concentrations of IAA在同一處理時(shí)間，不同字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)，下同。At the same treatment time, different letters indicate significant difference at 0.05 level(P<0.05), the same below.

2.2 IAA處理對(duì)馬尾松幼苗莖干解剖結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步了解外源IAA在馬尾松莖干次生生長(zhǎng)中的潛在作用，對(duì)不同濃度生長(zhǎng)素IAA處理160天的馬尾松莖部材料進(jìn)行石蠟切片觀察，結(jié)果(圖2)表明噴施IAA對(duì)馬尾松莖的木質(zhì)部、韌皮部厚度以及木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，且隨著IAA濃度的升高，各指標(biāo)也隨之增加，在濃度為100 mg·L-1時(shí)各指標(biāo)值最大，木質(zhì)部和韌皮部厚度最大值分別為3.27 mm和0.25 mm，木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)最多為164層。

2.3 IAA處理對(duì)馬尾松幼苗莖干木質(zhì)素、纖維素及半纖維素含量的影響

選擇處理160天的馬尾松莖部材料進(jìn)行木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量的測(cè)定，結(jié)果(表2)表明噴施IAA對(duì)馬尾松莖的木質(zhì)素、纖維素以及半纖維素含量具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。木質(zhì)素含量隨著IAA濃度的增加而增加，在IAA濃度為100 mg·L-1時(shí)最大，達(dá)124.94 mg·g-1； 纖維素和半纖維素含量在1 mg·L-1濃度IAA處理時(shí)最大，分別為292.35 mg·g-1和207.13 mg·g-1，之后呈不顯著差異下降，但都比對(duì)照顯著增加(P<0.05)。

2.4 IAA處理對(duì)馬尾松幼苗莖干內(nèi)源激素含量的影響

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖干以及對(duì)照組(CK)作為試驗(yàn)材料進(jìn)行內(nèi)源激素(生長(zhǎng)素類(lèi)、赤霉素類(lèi)和油菜素內(nèi)酯類(lèi))含量的測(cè)定。結(jié)果如表3所示，生長(zhǎng)素類(lèi)有9類(lèi)測(cè)出含量，其中IAA處理的馬尾松莖干中的IAA、oxIAA、ICAld和MEIAA含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，IAA-Leu和IAA-Asp含量則是處理組極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，處理組的TRP含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。赤霉素類(lèi)只有2類(lèi)測(cè)出含量，但是處理組與對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異。油菜素內(nèi)酯類(lèi)有5類(lèi)測(cè)出含量，其中處理組的BR、CS和28-homoCS含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.5 IAA處理后馬尾松幼苗莖干的轉(zhuǎn)錄組分析

2.5.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)與基因表達(dá)分析

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖部材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)CK和IAA處理的6個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，總共獲得超7.2×107個(gè)原始讀數(shù)，過(guò)濾低質(zhì)量讀數(shù)后，得到了占比高達(dá)98%以上的高質(zhì)量讀數(shù)(Q20≥98.17%, Q30≥94.39%)，GC含量在44.47%～45.16%之間(表4)，由此可見(jiàn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析(FDR<0.05 且|log2FC|>1)后得到778個(gè)呈顯著差異表達(dá)的基因，其中482個(gè)基因?yàn)轱@著上調(diào)表達(dá)，296個(gè)基因?yàn)轱@著下調(diào)表達(dá)。

表3 IAA處理后馬尾松幼苗莖干內(nèi)源激素含量①Tab.3 Endogenous hormone contents in stems of P. massoniana seedlings treated with IAA

表4 IAA處理后馬尾松幼苗莖部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)①Tab.4 Statistics of stem transcriptome data of P. massoniana seedlings treated with IAA

2.5.2 差異基因的GO富集分析 對(duì)CK和IAA 2個(gè)組別的差異基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果(圖3)顯示差異基因可以概括為3大類(lèi)： 生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)。生物過(guò)程中富集最多的2個(gè)類(lèi)別為細(xì)胞過(guò)程(cellular process)和代謝過(guò)程(metabolic process)； 細(xì)胞成分中大多數(shù)基因與細(xì)胞組分(cell part)和膜組分(membrane part)相關(guān)； 在分子功能中, 類(lèi)別最多為結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)(圖3)。

圖3 GO富集分類(lèi)Fig.3 GO enrichment classification

2.5.3 差異基因的KEGG富集分析 對(duì)CK和IAA 2個(gè)組別的差異基因進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果(圖4)顯示差異基因參與的KEGG途徑可歸為5大類(lèi)別、12個(gè)亞類(lèi)，總計(jì)14個(gè)途徑。從顯著性上來(lái)看，顯著富集的一共為5個(gè)KEGG途徑，分別為甜菜色素生物合成(betalain biosynthesis)、植物-病原互作(plant-pathogen interaction)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、晝夜節(jié)律-植物(circadian rhythm-plant)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)。

2.5.4 次生生長(zhǎng)相關(guān)基因的鑒定與表達(dá) 為了探索IAA處理對(duì)2年生馬尾松苗莖部次生生長(zhǎng)在分子水平上的影響，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因中挑選出與次生生長(zhǎng)相關(guān)的若干基因(表5)，主要是與激素、木質(zhì)素和纖維素合成等相關(guān)的差異表達(dá)基因。其中與激素相關(guān)的是油菜素內(nèi)酯受體BRL1和赤霉素調(diào)控蛋白GASA6，IAA處理使得這2個(gè)基因在馬尾松上均被誘導(dǎo)表達(dá)； 與木質(zhì)素合成相關(guān)的是CAD基因，該基因被注釋到木質(zhì)素生物合成途徑上，IAA處理后其顯著上調(diào)表達(dá)； 與纖維素合成相關(guān)的是纖維素合酶CESA2，同樣在IAA處理后其表達(dá)被顯著誘導(dǎo)。

圖4 KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

表5 次生生長(zhǎng)相關(guān)基因的鑒定與表達(dá)Tab.5 Identification and expression of genes related to secondary growth

2.5.5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證 通過(guò)RT-qPCR對(duì)隨機(jī)挑選的差異基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本相似(圖5)，如IAA處理?xiàng)l件下的TRINITY_DN10179_c0_g1、TRINITY_DN8564_c0_g2和TRINITY_DN5190_c1_g1在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中均為下調(diào)表達(dá)，而其他6個(gè)如TRINITY_DN2065_c0_g1、TRINITY_DN11133_c0_g2等則為上調(diào)表達(dá)，通過(guò)RT-qPCR同樣得到相似結(jié)果，這表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是真實(shí)可靠的。

圖5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of differentially expressed genes by RT-qPCR

3 討論

生長(zhǎng)素作為一類(lèi)重要的植物激素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用。木質(zhì)部和韌皮部的形成始于維管形成層，生長(zhǎng)素是形成層活動(dòng)中的必要條件。早期的研究表明生長(zhǎng)素可能以劑量依賴的方式影響木質(zhì)部和韌皮部的產(chǎn)生和大小(Tuominenetal., 1997; Ugglaetal., 1998)。在本研究中，IAA處理顯著促進(jìn)馬尾松的木質(zhì)部發(fā)育，且與IAA濃度之間為正相關(guān)關(guān)系，對(duì)韌皮部也起到顯著的促進(jìn)作用，但不同濃度間的促進(jìn)作用差異不顯著，表明IAA可能以劑量依賴的方式對(duì)馬尾松木質(zhì)部產(chǎn)生影響，而對(duì)韌皮部的影響則不同。在楊樹(shù)(Populus)的相關(guān)研究上，生長(zhǎng)素處理的幼苗木質(zhì)部發(fā)育得到顯著改善，但韌皮部發(fā)育沒(méi)有受到影響(Yuanetal., 2019)。由此可見(jiàn)對(duì)于不同植物而言，生長(zhǎng)素對(duì)木質(zhì)部的影響基本一致，但對(duì)韌皮部的作用則存在差異，這是一個(gè)值得深入探討的研究點(diǎn)。通過(guò)對(duì)IAA處理后的2年生馬尾松莖部進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)部厚度及細(xì)胞層數(shù)都得到了顯著增加，推測(cè)細(xì)胞分裂是木質(zhì)部發(fā)育被促進(jìn)的主要途徑。

植物激素對(duì)于次生生長(zhǎng)的影響往往都不是單一發(fā)揮作用的，激素串?dāng)_對(duì)植物生長(zhǎng)至關(guān)重要。生長(zhǎng)素、赤霉素以及油菜素內(nèi)酯都是對(duì)植物次生生長(zhǎng)產(chǎn)生重要影響的植物激素，且3類(lèi)激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)系是密切相關(guān)的(Zhengetal., 2019)。本研究通過(guò)對(duì)馬尾松幼苗施加外源IAA后，與對(duì)照相比不僅內(nèi)源生長(zhǎng)素含量有顯著變化，油菜素內(nèi)酯和赤霉素含量也有所不同。有研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素與油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)的植物生理反應(yīng)具有相似性，且二者會(huì)共同調(diào)控一些基因的表達(dá)(Chaiwanonetal., 2015)。本研究對(duì)馬尾松進(jìn)行IAA處理后油菜素內(nèi)酯含量得到極顯著提高(P<0.01)，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)BRL1在IAA處理后顯著上調(diào)表達(dá)。BRL1是BRI1的同源基因，編碼一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的受體樣蛋白激酶(LRR-RLK)(Zhouetal., 2004)，為功能性油菜素內(nèi)酯受體，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)的維管分化中發(fā)揮重要作用(Cano-Delgadoetal., 2004)。在擬南芥和水稻(Oryzasativa)中已證明生長(zhǎng)素能夠提高油菜素內(nèi)酯受體的表達(dá)水平(Nemhauseretal., 2004; Sakamotoetal., 2013)。GASA是赤霉素信號(hào)途徑下游的靶基因，是一類(lèi)受赤霉素調(diào)控的基因，研究發(fā)現(xiàn)GASA主要定位在細(xì)胞壁(Ben-Nissanetal., 2004)。在擬南芥中，GASA6能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)(Zhongetal., 2015a)，其表達(dá)不僅僅受赤霉素調(diào)控，也受生長(zhǎng)素的調(diào)控(Tayloretal., 1994)，本研究得到的結(jié)果與之相似。綜上，IAA對(duì)油菜素內(nèi)酯和赤霉素的相關(guān)反應(yīng)和基因表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一定影響，并由此作用于馬尾松的次生生長(zhǎng)。

對(duì)于大多數(shù)植物而言，纖維素是由纖維素合酶(CesA)組成的玫瑰狀纖維素合酶復(fù)合物在質(zhì)膜上合成的(Malekietal., 2016)。植物中，許多CesA基因組成纖維素合酶基因家族。其中，CesA2被認(rèn)為是次生細(xì)胞壁形成的主要基因(Lietal., 2013)，在火炬松(Pinustaeda)中發(fā)現(xiàn)PtCesA2與次生木質(zhì)部的發(fā)育相關(guān)(Nairnetal., 2005)，在楊樹(shù)中發(fā)現(xiàn)PtrCesA2在次生細(xì)胞壁豐富的木質(zhì)部組織中高度表達(dá)(Joshietal., 2004)，并且在楊樹(shù)中過(guò)表達(dá)PmCesA2導(dǎo)致了細(xì)胞壁多糖組成的改變，次生細(xì)胞壁和木質(zhì)部寬度增加，從而提高了纖維素和木質(zhì)素的含量(Malekietal., 2020)。研究發(fā)現(xiàn)，外源施加生長(zhǎng)素處理能夠使楊樹(shù)的纖維素含量比對(duì)照提高32%(Yuetal., 2017)。在本研究中，對(duì)馬尾松進(jìn)行外源IAA處理后發(fā)現(xiàn)CesA2基因顯著上調(diào)表達(dá)，木質(zhì)部寬度增加，纖維素以及木質(zhì)素含量顯著提高(P<0.05)，因此推測(cè)IAA與CesA2基因、次生細(xì)胞壁生長(zhǎng)之間存在一定的相關(guān)性，以此來(lái)對(duì)馬尾松的次生生長(zhǎng)起著促進(jìn)作用。

在植物的次生生長(zhǎng)過(guò)程中，木質(zhì)素也是組成次生壁的主要生物聚合物之一。而肉桂醇脫氫酶(CAD)則是催化肉桂酸衍生物轉(zhuǎn)化為植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素聚合物單醇基的一個(gè)關(guān)鍵基因(Panetal., 2014)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)構(gòu)建“無(wú)終止子”結(jié)構(gòu)來(lái)下調(diào)CAD基因后得到的水稻品系木質(zhì)素含量顯著降低(Ponniahetal., 2017)； 過(guò)表達(dá)CAD得到的轉(zhuǎn)基因青蒿(Artemisiaannua)木質(zhì)素含量則明顯高于野生型植株(Maetal., 2018)。本研究IAA處理后顯著誘導(dǎo)了CAD的表達(dá)，且與對(duì)照相比IAA處理后的馬尾松木質(zhì)素含量得到了顯著提高(P<0.05)，推測(cè)IAA可能通過(guò)調(diào)控CAD基因表達(dá)，促進(jìn)木質(zhì)素積累，從而促進(jìn)了馬尾松的次生生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)2年生馬尾松進(jìn)行外源IAA噴施處理，發(fā)現(xiàn)IAA能夠?qū)︸R尾松的次生生長(zhǎng)起到顯著的促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)、解剖結(jié)構(gòu)、木質(zhì)素、纖維素及半纖維素含量等方面，對(duì)馬尾松進(jìn)行內(nèi)源激素含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)IAA處理不僅能夠提高內(nèi)源生長(zhǎng)素的含量，赤霉素以及油菜素內(nèi)酯含量也得到提高。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后得到778個(gè)差異表達(dá)的基因(482個(gè)顯著上調(diào)，296個(gè)顯著下調(diào))，在差異基因中獲得與馬尾松次生生長(zhǎng)相關(guān)的基因(BRL1、GASA6、CAD和CESA2等)。本研究對(duì)IAA與馬尾松次生生長(zhǎng)之間的關(guān)系進(jìn)行了一定的探索，為闡明馬尾松苗期莖干次生生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為今后馬尾松大徑材和優(yōu)質(zhì)紙漿材的獲得提供一定的理論參考。