周紫晶 范付華 尚先文 覃慧娟 王聰慧 丁貴杰 譚健暉

(1.貴州大學貴州省森林資源與環(huán)境研究中心 貴州省高原山地林木培育重點實驗室 貴州大學林學院 貴陽 550025；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 南寧 530002)

植物的次生生長即植物器官周長的增加，莖干的次生生長是由維管形成層的細胞分裂造成的，形成層向內形成木質部，向外產(chǎn)生韌皮部(Mellerowiczetal., 2001; Spiceretal., 2010)。木質部的形成包括初生維管組織成束排列、初生維管束內或次生維管形成層中的細胞增殖、木質部分化的啟動、細胞擴張的調節(jié)、次生細胞壁的沉積和細胞程序性死亡(Nieminenetal., 2004)。次生木質部和韌皮部的生長，導致莖的直徑增加，該過程是木材積累的主要來源(Zhaoetal., 2005)。次生壁作為木材生物質主要組成成分，由纖維素、半纖維素(木聚糖、葡甘露聚糖)和木質素等構成，并沉積在一些特殊的細胞中，如管胞元件、纖維等厚壁細胞中，為植物提供機械支持和保護(Zhongetal., 2015b)。

植物激素是植物自身代謝所產(chǎn)生的一類有機物質，對植物細胞分化、生長發(fā)育起到重要調控作用。生長素即吲哚乙酸(IAA)是一類具有一個不飽和芳香族環(huán)和一個乙酸側鏈組成的植物內源激素，是最早發(fā)現(xiàn)的一種植物激素，調控植物生長發(fā)育各過程，促進木本植物的形成層活動和木材形成(Savidge, 1983; 1988)。研究者通過高親和力傳感器檢測生長素信號，證明其在形成層干細胞中處于中等水平，在形成層分化的子代細胞中增加，表明生長素信號在形成層分化中的關鍵作用，生長素信號的局部增強是次生生長所必需的(Bargmannetal., 2013; Mulleretal., 2016; Brackmannetal., 2018)。大量證據(jù)表明，生長素通過極性運輸參與形成層、木質部及韌皮部的分化(Glweileretal., 1998; Yaoetal., 2020)，通過施加外源生長素能夠促進形成層的分化(Chenetal., 2019)，誘導分化完整且功能正常的次生木質部細胞(Bjorklundetal., 2007)，且以劑量依賴的方式影響木質部和韌皮部的產(chǎn)生和大小，以及次生壁的厚度(Tuominenetal., 1997; Ugglaetal., 1998)。

馬尾松(Pinusmassoniana)是我國特有的速生樹種和南方主要造林樹種之一，具有分布廣、用途廣泛、全樹綜合利用程度高等特點，在木材加工業(yè)中具有重要的利用價值(丁貴杰等, 1994)。目前對馬尾松生長發(fā)育的研究中，多以施肥、接菌以及營林技術措施等為主要研究方向(吳修蓉等, 2019; 張婷等, 2016; 郭麗玲等, 2019)，對于噴施外源激素，僅見外源激素對馬尾松應壓木形成影響的研究(陳海燕等, 2015)，未見關于施加外源激素促進其次生生長機理的報道。對馬尾松的次生生長進行深入研究，解析莖干次生生長調控機理，可以為培育速生高產(chǎn)的馬尾松新品系提供一定的理論參考。本研究通過施加外源IAA，測定馬尾松幼苗生長、生理生化、解剖結構以及轉錄組水平的變化等，揭示外源IAA對馬尾松苗期莖干次生生長的影響，為闡明馬尾松苗期莖干次生生長的分子調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及激素處理

試驗材料為貴州都勻馬鞍山馬尾松國家林木良種基地提供的馬尾松1.5代種子園半同胞良種繁育的2年生苗木。選擇生長狀態(tài)一致的2年生苗木種植于花盆(高17 cm，口徑16 cm)中。緩苗期后進行IAA噴施處理，處理時間160天，一共4種處理： 1)噴施1 mg·L-1濃度IAA； 2)噴施50 mg·L-1濃度IAA； 3)噴施100 mg·L-1濃度IAA； 4)對照組(噴施蒸餾水)。采取全株噴施的方法，每7天噴施1次激素，噴施至葉片濕潤、葉尖有液滴即可。

1.2 生長指標的測定及莖干解剖結構觀察

對所有苗木進行苗高和地徑的觀測，每40天測量1次，共進行4次觀測。苗高用卷尺測量(精度為0.1 cm)，地徑用游標卡尺測量(精度為0.01 mm)。苗高和地徑增長量分別為處理后苗高和地徑值減去初始值(處理前)所得。選擇處理160天的馬尾松莖部材料進行石蠟切片觀察，取地徑處0.5 cm長莖段材料置于FAA固定液中保存，采用石蠟切片的方法制作永久切片(周乃富等, 2018)，番紅固綠染色后用顯微鏡拍照觀察。

1.3 莖干木質素、纖維素及半纖維素含量的測定

木質素含量通過木質素含量試劑盒(G0708W48)采用乙酰化法測定； 纖維素含量采用纖維素含量試劑盒(G0715W48)測定； 半纖維素含量采用半纖維素含量試劑盒(G0716W48)測定。試劑盒均采購于蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.4 莖干內源激素含量的測定

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖干以及對照組(CK)作為試驗材料進行內源激素(生長素類、赤霉素類和油菜素內酯類)含量的測定。取出超低溫保存的生物樣本，用研磨儀研磨(30 Hz，1 min)至粉末狀； 稱取50 mg研磨后的樣本，加入適量內標，用1 mL甲醇︰水︰甲酸(體積比15∶4∶1)進行提取； 提取液濃縮后用100 μL 80%甲醇溶液復溶，過0.22 μm濾膜，置于進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)(ExionLCTM AD，https:∥sciex.com.cn/)和串聯(lián)質譜(Tandem Mass Spectrometry，MS/MS)(QTRAP? 6500+，https:∥sciex.com.cn/)?；跇藴势窐嫿∕WDB(Metware Database)數(shù)據(jù)庫，對質譜檢測的數(shù)據(jù)進行定性分析。定量是利用三重四級桿質譜的多反應監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM)分析完成(Panetal., 2010)。

1.5 莖干轉錄組分析

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖干以及對照組(CK)作為試驗材料進行轉錄組測序。采用 TRIzol(Invitrogen)法提取總RNA，通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，CA，USA)進行數(shù)量和完整性評估，用Illumina NovaSeq6000進行測序。原始數(shù)據(jù)測控使用SeqPrep(https:∥github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https:∥github.com/najoshi/sickle)進行，使用Trinity(https:∥github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)對所有 clean data進行從頭組裝，然后利用TransRate(http:∥hibberdlab.com/transrate)和BUSCO(Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs，http:∥busco.ezlab.org )對獲得的初始組裝序列進行優(yōu)化過濾并再次評估。將轉錄組測序獲得的所有轉錄本與六大數(shù)據(jù)庫： NR(ftp:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db)、Swiss-Prot(http:∥ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/swissprot)、Pfam(http:∥pfam.xfam.org/)、COG(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)、GO(http:∥geneontology.org/)和 KEGG(http:∥www.genome.jp/kegg)數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得在各數(shù)據(jù)庫的注釋信息，并對各數(shù)據(jù)庫注釋情況進行統(tǒng)計。使用軟件RSEM(http:∥deweylab.github.io/RSEM/)對基因的表達水平進行定量分析，使用EDGER軟件包(http:∥www.r-project.org/)鑒定差異表達基因，將滿足FDR≤0.05且|log2FC|≥1條件的基因確定為顯著差異。

利用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO注釋，并將所得結果繪制基因GO注釋柱形圖。顯著富集的GO term閾值為P≤0.05。使用KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫通過超幾何檢驗來確定顯著富集的pathway，其Q≤0.05的pathway定義為顯著富集pathway。所有樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)可在National Center for Biotechnology Information(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)獲得，注冊號為PRJNA743934。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 差異基因的RT-qPCR驗證

在差異基因中隨機挑選9個基因，用軟件primer 5.0設計引物(表1), 在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(FP441)和Talent熒光定量檢測試劑盒(FP209)，在四通道梯度熒光定量PCR儀(CFX96 Touch)上評估差異基因的表達水平變化。以UBC作為內參基因(Fanetal., 2014)，每個樣品做3次重復，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計算基因相對含量(Livaketal., 2001)，采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢測法分析基因表達的差異。

2 結果與分析

2.1 IAA處理對馬尾松幼苗生長的促進作用

為了確定外源IAA是否會影響馬尾松的正常生長發(fā)育，對2年生馬尾松幼苗進行不同濃度水平的IAA噴施處理，每40天進行1次苗高和地徑的測量，一共進行4次測量。結果如圖1所示，噴施IAA對2年生馬尾松的苗高有促進作用但是不顯著，而對地徑有顯著的促進作用(P<0.05)，且隨著處理時間的增加，地徑的增長量也在隨之增加，濃度為100 mg·L-1時地徑增長量最大(3.72 mm)，平均增長量比對照多33.8%。

圖1 不同濃度IAA處理下馬尾松幼苗苗高(a)和地徑(b)的增長量Fig.1 Growth of height(a) and ground diameter(b) of P. massoniana seedlings treated with different concentrations of IAA在同一處理時間，不同字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)，下同。At the same treatment time, different letters indicate significant difference at 0.05 level(P<0.05), the same below.

2.2 IAA處理對馬尾松幼苗莖干解剖結構的影響

為了進一步了解外源IAA在馬尾松莖干次生生長中的潛在作用，對不同濃度生長素IAA處理160天的馬尾松莖部材料進行石蠟切片觀察，結果(圖2)表明噴施IAA對馬尾松莖的木質部、韌皮部厚度以及木質部細胞層數(shù)具有顯著的促進作用(P<0.05)，且隨著IAA濃度的升高，各指標也隨之增加，在濃度為100 mg·L-1時各指標值最大，木質部和韌皮部厚度最大值分別為3.27 mm和0.25 mm，木質部細胞層數(shù)最多為164層。

2.3 IAA處理對馬尾松幼苗莖干木質素、纖維素及半纖維素含量的影響

選擇處理160天的馬尾松莖部材料進行木質素、纖維素和半纖維素含量的測定，結果(表2)表明噴施IAA對馬尾松莖的木質素、纖維素以及半纖維素含量具有顯著的促進作用(P<0.05)。木質素含量隨著IAA濃度的增加而增加，在IAA濃度為100 mg·L-1時最大，達124.94 mg·g-1； 纖維素和半纖維素含量在1 mg·L-1濃度IAA處理時最大，分別為292.35 mg·g-1和207.13 mg·g-1，之后呈不顯著差異下降，但都比對照顯著增加(P<0.05)。

2.4 IAA處理對馬尾松幼苗莖干內源激素含量的影響

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖干以及對照組(CK)作為試驗材料進行內源激素(生長素類、赤霉素類和油菜素內酯類)含量的測定。結果如表3所示，生長素類有9類測出含量，其中IAA處理的馬尾松莖干中的IAA、oxIAA、ICAld和MEIAA含量極顯著高于對照組(P<0.01)，IAA-Leu和IAA-Asp含量則是處理組極顯著低于對照組(P<0.01)，處理組的TRP含量顯著低于對照組(P<0.05)。赤霉素類只有2類測出含量，但是處理組與對照組之間均無顯著差異。油菜素內酯類有5類測出含量，其中處理組的BR、CS和28-homoCS含量極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.5 IAA處理后馬尾松幼苗莖干的轉錄組分析

2.5.1 轉錄組測序數(shù)據(jù)質控統(tǒng)計與基因表達分析

選擇100 mg·L-1濃度IAA處理160天的馬尾松莖部材料進行轉錄組測序。通過Illumina測序技術對CK和IAA處理的6個cDNA文庫進行測序，總共獲得超7.2×107個原始讀數(shù)，過濾低質量讀數(shù)后，得到了占比高達98%以上的高質量讀數(shù)(Q20≥98.17%, Q30≥94.39%)，GC含量在44.47%～45.16%之間(表4)，由此可見轉錄組數(shù)據(jù)質量良好，可用于后續(xù)分析。進行基因的差異表達分析(FDR<0.05 且|log2FC|>1)后得到778個呈顯著差異表達的基因，其中482個基因為顯著上調表達，296個基因為顯著下調表達。

表3 IAA處理后馬尾松幼苗莖干內源激素含量①Tab.3 Endogenous hormone contents in stems of P. massoniana seedlings treated with IAA

表4 IAA處理后馬尾松幼苗莖部轉錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計①Tab.4 Statistics of stem transcriptome data of P. massoniana seedlings treated with IAA

2.5.2 差異基因的GO富集分析 對CK和IAA 2個組別的差異基因進行GO分析，結果(圖3)顯示差異基因可以概括為3大類： 生物過程(biological process)、細胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)。生物過程中富集最多的2個類別為細胞過程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)； 細胞成分中大多數(shù)基因與細胞組分(cell part)和膜組分(membrane part)相關； 在分子功能中, 類別最多為結合(binding)和催化活性(catalytic activity)(圖3)。

圖3 GO富集分類Fig.3 GO enrichment classification

2.5.3 差異基因的KEGG富集分析 對CK和IAA 2個組別的差異基因進行KEGG分析，結果(圖4)顯示差異基因參與的KEGG途徑可歸為5大類別、12個亞類，總計14個途徑。從顯著性上來看，顯著富集的一共為5個KEGG途徑，分別為甜菜色素生物合成(betalain biosynthesis)、植物-病原互作(plant-pathogen interaction)、泛素介導的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、晝夜節(jié)律-植物(circadian rhythm-plant)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)。

2.5.4 次生生長相關基因的鑒定與表達 為了探索IAA處理對2年生馬尾松苗莖部次生生長在分子水平上的影響，從轉錄組數(shù)據(jù)差異表達基因中挑選出與次生生長相關的若干基因(表5)，主要是與激素、木質素和纖維素合成等相關的差異表達基因。其中與激素相關的是油菜素內酯受體BRL1和赤霉素調控蛋白GASA6，IAA處理使得這2個基因在馬尾松上均被誘導表達； 與木質素合成相關的是CAD基因，該基因被注釋到木質素生物合成途徑上，IAA處理后其顯著上調表達； 與纖維素合成相關的是纖維素合酶CESA2，同樣在IAA處理后其表達被顯著誘導。

圖4 KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

表5 次生生長相關基因的鑒定與表達Tab.5 Identification and expression of genes related to secondary growth

2.5.5 差異表達基因的RT-qPCR驗證 通過RT-qPCR對隨機挑選的差異基因的表達量進行分析，結果顯示這些基因的表達趨勢與轉錄組測序結果基本相似(圖5)，如IAA處理條件下的TRINITY_DN10179_c0_g1、TRINITY_DN8564_c0_g2和TRINITY_DN5190_c1_g1在轉錄組測序結果中均為下調表達，而其他6個如TRINITY_DN2065_c0_g1、TRINITY_DN11133_c0_g2等則為上調表達，通過RT-qPCR同樣得到相似結果，這表明轉錄組測序結果是真實可靠的。

圖5 差異表達基因的RT-qPCR驗證Fig.5 Verification of differentially expressed genes by RT-qPCR

3 討論

生長素作為一類重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育過程中起著極其重要的作用。木質部和韌皮部的形成始于維管形成層，生長素是形成層活動中的必要條件。早期的研究表明生長素可能以劑量依賴的方式影響木質部和韌皮部的產(chǎn)生和大小(Tuominenetal., 1997; Ugglaetal., 1998)。在本研究中，IAA處理顯著促進馬尾松的木質部發(fā)育，且與IAA濃度之間為正相關關系，對韌皮部也起到顯著的促進作用，但不同濃度間的促進作用差異不顯著，表明IAA可能以劑量依賴的方式對馬尾松木質部產(chǎn)生影響，而對韌皮部的影響則不同。在楊樹(Populus)的相關研究上，生長素處理的幼苗木質部發(fā)育得到顯著改善，但韌皮部發(fā)育沒有受到影響(Yuanetal., 2019)。由此可見對于不同植物而言，生長素對木質部的影響基本一致，但對韌皮部的作用則存在差異，這是一個值得深入探討的研究點。通過對IAA處理后的2年生馬尾松莖部進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)木質部厚度及細胞層數(shù)都得到了顯著增加，推測細胞分裂是木質部發(fā)育被促進的主要途徑。

植物激素對于次生生長的影響往往都不是單一發(fā)揮作用的，激素串擾對植物生長至關重要。生長素、赤霉素以及油菜素內酯都是對植物次生生長產(chǎn)生重要影響的植物激素，且3類激素在植物生長發(fā)育過程中的關系是密切相關的(Zhengetal., 2019)。本研究通過對馬尾松幼苗施加外源IAA后，與對照相比不僅內源生長素含量有顯著變化，油菜素內酯和赤霉素含量也有所不同。有研究發(fā)現(xiàn)生長素與油菜素內酯誘導的植物生理反應具有相似性，且二者會共同調控一些基因的表達(Chaiwanonetal., 2015)。本研究對馬尾松進行IAA處理后油菜素內酯含量得到極顯著提高(P<0.01)，轉錄組分析發(fā)現(xiàn)BRL1在IAA處理后顯著上調表達。BRL1是BRI1的同源基因，編碼一個富含亮氨酸重復序列的受體樣蛋白激酶(LRR-RLK)(Zhouetal., 2004)，為功能性油菜素內酯受體，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)的維管分化中發(fā)揮重要作用(Cano-Delgadoetal., 2004)。在擬南芥和水稻(Oryzasativa)中已證明生長素能夠提高油菜素內酯受體的表達水平(Nemhauseretal., 2004; Sakamotoetal., 2013)。GASA是赤霉素信號途徑下游的靶基因，是一類受赤霉素調控的基因，研究發(fā)現(xiàn)GASA主要定位在細胞壁(Ben-Nissanetal., 2004)。在擬南芥中，GASA6能夠促進細胞伸長(Zhongetal., 2015a)，其表達不僅僅受赤霉素調控，也受生長素的調控(Tayloretal., 1994)，本研究得到的結果與之相似。綜上，IAA對油菜素內酯和赤霉素的相關反應和基因表達會產(chǎn)生一定影響，并由此作用于馬尾松的次生生長。

對于大多數(shù)植物而言，纖維素是由纖維素合酶(CesA)組成的玫瑰狀纖維素合酶復合物在質膜上合成的(Malekietal., 2016)。植物中，許多CesA基因組成纖維素合酶基因家族。其中，CesA2被認為是次生細胞壁形成的主要基因(Lietal., 2013)，在火炬松(Pinustaeda)中發(fā)現(xiàn)PtCesA2與次生木質部的發(fā)育相關(Nairnetal., 2005)，在楊樹中發(fā)現(xiàn)PtrCesA2在次生細胞壁豐富的木質部組織中高度表達(Joshietal., 2004)，并且在楊樹中過表達PmCesA2導致了細胞壁多糖組成的改變，次生細胞壁和木質部寬度增加，從而提高了纖維素和木質素的含量(Malekietal., 2020)。研究發(fā)現(xiàn)，外源施加生長素處理能夠使楊樹的纖維素含量比對照提高32%(Yuetal., 2017)。在本研究中，對馬尾松進行外源IAA處理后發(fā)現(xiàn)CesA2基因顯著上調表達，木質部寬度增加，纖維素以及木質素含量顯著提高(P<0.05)，因此推測IAA與CesA2基因、次生細胞壁生長之間存在一定的相關性，以此來對馬尾松的次生生長起著促進作用。

在植物的次生生長過程中，木質素也是組成次生壁的主要生物聚合物之一。而肉桂醇脫氫酶(CAD)則是催化肉桂酸衍生物轉化為植物細胞壁中木質素聚合物單醇基的一個關鍵基因(Panetal., 2014)。研究發(fā)現(xiàn)通過構建“無終止子”結構來下調CAD基因后得到的水稻品系木質素含量顯著降低(Ponniahetal., 2017)； 過表達CAD得到的轉基因青蒿(Artemisiaannua)木質素含量則明顯高于野生型植株(Maetal., 2018)。本研究IAA處理后顯著誘導了CAD的表達，且與對照相比IAA處理后的馬尾松木質素含量得到了顯著提高(P<0.05)，推測IAA可能通過調控CAD基因表達，促進木質素積累，從而促進了馬尾松的次生生長。

4 結論

通過對2年生馬尾松進行外源IAA噴施處理，發(fā)現(xiàn)IAA能夠對馬尾松的次生生長起到顯著的促進作用，主要表現(xiàn)在生長、解剖結構、木質素、纖維素及半纖維素含量等方面，對馬尾松進行內源激素含量測定后發(fā)現(xiàn)IAA處理不僅能夠提高內源生長素的含量，赤霉素以及油菜素內酯含量也得到提高。轉錄組測序后得到778個差異表達的基因(482個顯著上調，296個顯著下調)，在差異基因中獲得與馬尾松次生生長相關的基因(BRL1、GASA6、CAD和CESA2等)。本研究對IAA與馬尾松次生生長之間的關系進行了一定的探索，為闡明馬尾松苗期莖干次生生長的分子調控機制奠定基礎，為今后馬尾松大徑材和優(yōu)質紙漿材的獲得提供一定的理論參考。