彭 欣 王瀚棠 郭春暉 楊振德,2 周 靜 王 雪 丁芷柔

(1.廣西大學林學院 南寧 530001； 2.廣西森林生態(tài)與保育重點實驗室 南寧 530001)

生物入侵是21世紀最棘手的三大環(huán)境問題(生物入侵、全球變化和生境喪失)之一。隨著經(jīng)濟全球化、國際旅游業(yè)和現(xiàn)代交通的飛速發(fā)展，入侵生物在各國之間傳播擴散，新疫情不斷突發(fā)，已入侵種頻繁暴發(fā)成災，給世界各國造成了嚴重的經(jīng)濟損失和生態(tài)災難，也給人民健康和社會穩(wěn)定帶來了巨大影響，做好生物入侵的跨國研究與科學防范十分重要，迫在眉睫。為了更好闡明生物入侵的生態(tài)學過程和分子機制，我國于2018年11月啟動了IAS1000計劃(1 000種入侵物種基因組計劃)(錢萬強等， 2018)。

桉樹(Eucalyptus)是世界三大速生豐產(chǎn)樹種之一，已有5大洲96個國家和地區(qū)種植桉樹，我國桉樹種植面積居世界第3位。但是，隨著桉樹廣泛種植，其害蟲的種類和數(shù)量迅速增加。Hurley等(2016)研究表明，桉樹人工林害蟲入侵率自20世紀80年代中期以來增長近5倍。桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybeinvasa)屬膜翅目(Hymenoptera)小蜂總科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)，是30多種桉屬植物的外來入侵害蟲，主要危害桉樹嫩枝，使新葉的葉脈、葉柄和嫩枝產(chǎn)生典型的腫塊狀蟲癭，嚴重侵染甚至可導致植株枯死。該蜂于2000年在中東和地中海地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)， 2014年擴散到5大洲29個國家， 2018年劇增至45個國家(Mendeletal.， 2004； Zhengetal.， 2014； Leetal.， 2018)。我國于2007年在與越南交界的東興市首次發(fā)現(xiàn)桉樹枝癭姬小蜂(吳耀軍等， 2009)，現(xiàn)已蔓延至廣西、海南、廣東、福建、四川、江西、云南、臺灣8省(區(qū))(Zhengetal.， 2014； 2018a； 張華峰等， 2013)，其中長江以南的福建、廣東、廣西、海南等地為其最佳適生區(qū)(黃夢伊等， 2020)。桉樹枝癭姬小蜂入侵擴散的規(guī)模和速度前所未有，已成為全球桉樹的一種重要入侵性林業(yè)害蟲。

Mendel等(2004)在采樣過程中始終未發(fā)現(xiàn)桉樹枝癭姬小蜂雄蟲樣本，世界各地也罕有桉樹枝癭姬小蜂雄蟲出現(xiàn)，所以一般認為桉樹枝癭姬小蜂的主要生殖方式是產(chǎn)雌孤雌生殖； 但近幾年在土耳其、印度和中國相繼有桉樹枝癭姬小蜂雄蟲的報道(Doanlar， 2005； Guptaetal.， 2009； 陳華燕等， 2009)。Zheng等(2018b)研究發(fā)現(xiàn)，溫度、光周期和冷熱適應對桉樹枝癭姬小蜂后代性別比例和生殖策略均無顯著影響。楊纖纖(2017)研究發(fā)現(xiàn)，我國桉樹枝癭姬小蜂雌雄蟲間存在交配行為，可通過兩性生殖方式產(chǎn)生后代。極具優(yōu)勢的產(chǎn)雌孤雌生殖方式使得桉樹枝癭姬小蜂能在入侵地快速擴張種群，從而保障其在新環(huán)境中成功入侵定殖。此外，桉樹枝癭姬小蜂是一種卵熟型寄生蜂，雌性蜂在羽化時卵巢中的卵幾乎全部發(fā)育成熟，卵產(chǎn)出后迅速孵化出幼蟲(Zhengetal.， 2018a)。Mendel等(2004)研究得出，桉樹枝癭姬小蜂在溫室中從卵發(fā)育到成蟲的整個過程平均需要132.6天。桉樹枝癭姬小蜂一般在國外1年發(fā)生2～3代，國內1年發(fā)生4～6代，世代重疊(寇冀蒙， 2020)。我國不同地理環(huán)境下桉樹枝癭姬小蜂每年發(fā)生的代數(shù)存在差異，廣西、廣東每年可發(fā)生4～5代(羅基同等， 2011； 朱方麗等， 2013)， 贛南和福建每年可發(fā)生3～4代(張華峰， 2013； 曾凡玉等， 2015)。桉樹枝癭姬小蜂的這些生物學習性是其在我國迅速入侵擴散的重要原因。

簡單重復序列(simple sequence repeat， SSR)又稱微衛(wèi)星(microsatellite)，是一類由1～6個核苷酸組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列，其在所有高等生物的編碼區(qū)和非編碼區(qū)均可發(fā)生(Tautzetal., 1984； Guptaetal.，1996)。SSR因符合孟德爾遺傳模式，具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復性好、操作簡易等優(yōu)點，已被廣泛用于遺傳圖譜繪制、遺傳多樣性分析、動植物分類與變異水平分析等研究領域(Madesisetal.， 2013)?；诒磉_序列標簽開發(fā)的SSR又稱EST-SSR，由于其來源于基因表達區(qū)，因此EST-SSR既有基因組SSR(G-SSR)標記的優(yōu)點，又有直接標記功能基因反映相關基因多樣性的優(yōu)勢，同時相較于G-SSR，EST-SSR具有更高的保守性和在近緣種間的通用性，可節(jié)約開發(fā)成本(孫陶澤等， 2019； Scottetal.， 2000； Bérubéetal.， 2007)。細胞色素C氧化酶亞基I基因(cytochrome C oxidase subunit I, COI)來源于線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)，mtDNA具有母系遺傳、相對保守、無內含子、進化速率較快(昆蟲中線粒體基因的進化速度大概是核蛋白編碼基因的2～9倍)、較少發(fā)生序列缺失和插入等特點(Linetal.， 2004)，已被廣泛用于昆蟲種類鑒定以及隱種發(fā)現(xiàn)等領域(劉慎思等， 2012)。

隱種是昆蟲系統(tǒng)分類和種群遺傳研究共同關注的重點問題，隱種鑒定不僅對于入侵生物學的理論研究具有重要意義，而且對入侵種的防控也具有重要指導價值，有助于生物防治中采用正確的生物型，一些地區(qū)害蟲生物防治方法失效可能是該害蟲中存在隱種所致(Maponderaetal.， 2012； Schr?deretal.， 2020； Dittrich-Schr?deretal.， 2020)。如全球入侵性害蟲煙粉虱(Bemisiatabaci)在我國有19個隱種，包含17個本地種和2個外來種(MED和MEAM1)(Huetal.， 2018)。因此，開展害蟲防治前應對不同隱種進行鑒定區(qū)分。線粒體COI 標記表明，桉樹枝癭姬小蜂具有3種不同的線粒體單倍群，即隱種A、B、C，其中隱種A 主要分布于歐洲、中東、南美和非洲大部分地區(qū)，隱種B與隱種A共同分布于老撾、南非、泰國和越南等地，而隱種C 僅在澳大利亞本土范圍出現(xiàn)(Dittrich-Schr?deretal.， 2018)。雖然桉樹枝癭姬小蜂入侵我國已有14年歷史，文獻報道江西贛州的桉樹枝癭姬小蜂屬于隱種B(Dittrich-Schr?deretal.， 2018； Nugnesetal.， 2015)，但關于中國種群的桉樹枝癭姬小蜂是否存在其他類型隱種尚不清楚。

鑒于此，本研究基于桉樹枝癭姬小蜂3個地理種群轉錄組測序數(shù)據(jù)篩選EST-SSR位點，以8個地理種群的桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本用于EST-SSR的開發(fā)，并對14個地理種群的桉樹枝癭姬小蜂進行隱種鑒定，以期為桉樹枝癭姬小蜂種群遺傳學研究開發(fā)可靠的EST-SSR標記，為該害蟲在生物防治中采用正確的生物型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及轉錄組測序

桉樹枝癭姬小蜂樣本采集時間為2016―2020年，14個地理種群樣本采樣信息見表1。樣本采集后立即放入無水乙醇中固定，于-80 ℃冰箱中保存。由于采集到的桉樹枝癭姬小蜂雄性成蟲樣本有限，且使用單倍體雄蟲開發(fā)SSR引物無法體現(xiàn)共顯性分子標記的優(yōu)勢(區(qū)分二倍體雜合子)，不能很好展現(xiàn)SSR引物的多態(tài)性，故本研究僅選用桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲進行后續(xù)試驗分析。

選取8個樣本量充足的地理種群，每個地理種群有3個桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本DNA用于后續(xù)EST-SSR的開發(fā)，對采集到的全部14個地理種群320個桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本進行隱種鑒定。用于轉錄組測序的桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本分別采自廣西梧州、廣西南寧1、四川攀枝花，分為3組，每組3個生物學重復，每個重復樣本量0.5 g。轉錄組測序委托北京百邁客生物科技有限公司進行，測序平臺為Illumina HiSeqTM2000。

1.2 DNA提取

采用動物組織DNA提取試劑盒(北京擎科新業(yè)生物技術有限公司)，參照說明書提取單頭桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲總基因組DNA，使用NanoDrop以260 nm/280 nm和260 nm/230 nm比值測定DNA的質量和濃度，檢測合格的DNA分裝3管，于-20 ℃冰箱中保存。

表1 桉樹枝癭姬小蜂14個地理種群采樣信息Tab.1 Sampling information of 14 geographic populations of L. invasa

1.3 SSR位點鑒定

利用軟件MISA(https:∥webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索unigenes的微衛(wèi)星標記，按照以下標準從unigenes中查找 EST-SSR位點： 單核苷酸重復≥10次，二核苷酸重復≥6次，三核苷酸重復≥5次，四核苷酸重復≥5次，五核苷酸重復≥5次，六核苷酸重復≥5次。如果2個SSR序列的距離短于100 bp，會被合并當作一個EST-SSR標記。

1.4 EST-SSR引物設計與篩選

以上述篩選的EST-SSR位點為基礎，利用Primer Premier 3(Untergasseretal.， 2012)軟件在EST-SSR序列兩側進行引物批量設計，引物長度設為18～26 bp，最適長度為23 bp，擴增目的片段為重復序列前1個到后5個堿基片段，擴增產(chǎn)物長度在100～400 bp之間。從中選取400個EST-SSR位點進行初篩，所需引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。從廣西防城港2、四川攀枝花、廣西南寧1種群中各取1個樣本DNA用于初篩，每對引物用上述3個樣本DNA進行PCR擴增并應用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、清晰可見，與目的片段大小一致的引物。PCR反應體系為25.0 μL，包含2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL(北京擎科新業(yè)生物技術有限公司)，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加9.5 μL ddH2O補足體系； PCR反應程序為98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，適宜溫度退火10 s，72 ℃延伸10 s，反應35個循環(huán)后，72 ℃延伸2 min。為了盡可能表現(xiàn)出位點的多態(tài)性，從廣西防城港2、廣西南寧1、廣西南寧2、廣西梧州、四川德陽、四川攀枝花、福建三明、江西贛州8個種群中各選取3個樣本(共24個樣本)DNA對有效擴增的引物進行二次篩選，并用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態(tài)性。PCR反應體系與程序同上。

1.5 桉樹枝癭姬小蜂G-SSR多態(tài)性引物驗證

結合Dittrich-Schr?der等(2018)開發(fā)的14對多態(tài)性G-SSR引物(LiSS1—LiSS14)，對我國8個地理種群24個樣本DNA進行PCR擴增，PCR擴增體系和程序同上，擴增產(chǎn)物通過8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行多態(tài)性檢測。

1.6 隱種鑒定

利用線粒體COI基因序列引物LiLCO1490(5′-ATTTGATCTGGAATTTTAGG-3′)HCO2198(5′-TAAA CTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal.， 1994； Dittrich-Schr?deretal.， 2018)對14個地理種群320個桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本進行PCR擴增，PCR反應體系為50.0 μL，包含2×T5 Super PCR Mix 25.0 μL(北京擎科新業(yè)生物技術有限公司)，正反向引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，加19.0 μL ddH2O補足體系； PCR反應程序為98 ℃預變性3 min，98 ℃變性40 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，反應35個循環(huán)后，72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠、純化后送至上海生工生物工程股份有限公司進行雙端測序。

以Dittrich-Schr?der等(2018)鑒定出的桉樹枝癭姬小蜂隱種A、B、C的COI基因序列(GenBank登錄號分別為MH093212、MH093120和MH093002)為參考，利用PhyloSuite v1.1.15軟件(Zhangetal.， 2020)對14個地理種群320個桉樹枝癭姬小蜂樣本COI基因序列進行MAFFT比對并用Gblocks程序提取保守序列； 比對完成的序列利用MEGAX v7.0軟件(Kumaretal.， 2016)以Kimura 2-parameter模型建立 Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 桉樹枝癭姬小蜂轉錄組的測序與組裝

轉錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后獲得277 048 525條clean reads，包含82.86 G個核苷酸，Q20為97.45%，Q30為93.62%，GC含量為43.30%，表明測序結果良好，可信度高。組裝后共得到44 878個unigene，平均長度為1 082.76 bp，N50為1 976 bp。隨著序列長度增加，unigene數(shù)量逐漸減少(表2)。

2.2 桉樹枝癭姬小蜂轉錄組中SSR位點分布特點

對桉樹枝癭姬小蜂轉錄組的44 878條unigenes序列(總長約 48 592 kb)進行搜索，檢測到14 190個EST-SSR位點，平均每3.42 kb出現(xiàn)1個SSR位點。不同重復類型的EST-SSR在總EST-SSR中所占比例情況(表3)為： 單苷酸重復所占比例最高(9 881個，69.63%)，其次為二核苷酸重復(2 295個，16.17%)和三核苷酸重復(1 917個，13.51%)，四、五、六核苷酸重復共97個，占0.69%。轉錄組EST-SSR重復次數(shù)在4～24次之間，單核苷酸重復次數(shù)在10～24次之間，二核苷酸重復次數(shù)在6～12次之間，三核苷酸重復次數(shù)在5～8次之間，四核苷酸重復次數(shù)在5～10次之間，五核苷酸重復次數(shù)在5～11次之間，六核苷酸重復次數(shù)在5～8次之間。在單核苷酸重復類型(表4)中，A/T類型具有絕對優(yōu)勢，占98.03%； 在二核苷酸重復類型中，GA/TC最多，其次為AG/CT，分別占26.27%和23.14%； 在三核苷酸重復類型中，TGC/GCA類型最多，占13.67%，其次為CAG/CTG(12.52%)、AGC/GCT(10.02%)。

表2 桉樹枝癭姬小蜂轉錄組組裝質量Tab.2 Transcriptome assembly quality of L. invasa

表3 桉樹枝癭姬小蜂不同類型EST-SSRs重復次數(shù)統(tǒng)計Tab.3 Repeated number statistics of EST-SSRs of different types in L. invasa

2.3 EST-SSR位點篩選及G-SSR引物多態(tài)性

從EST-SSR庫中選取400個微衛(wèi)星位點，包含二核苷酸重復160個、三核苷酸重復220個、四核苷酸重復20個，經(jīng)初篩共得到205對條帶單一、清晰可見，與目的片段大小一致的引物，擴增效率為51.25%。利用8個地理種群24個樣本進行二次篩選共得到10個多態(tài)性良好的EST-SSR位點，位點詳情及引物序列見表5，c127471引物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見圖1。國外14對G-SSR引物均能有效擴增得到目的片段，其中僅有LiSS2、LiSS5、LiSS13存在多態(tài)性，這3對多態(tài)性G-SSR引物用于后續(xù)種群遺傳學研究。

表4 桉樹枝癭姬小蜂EST-SSRs重復基元類型統(tǒng)計Tab.4 Statistics on repeat motifs type of EST-SSRs in L. invasa

表5 桉樹枝癭姬小蜂10對多態(tài)性EST-SSRs與國外3對多態(tài)性G-SSRs引物信息①Tab.5 Information of 10 polymorphic EST-SSRs and 3 polymorphic G-SSRs primers of L. invasa

圖1 桉樹枝癭姬小蜂c127471引物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.1 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis image of L. invasa c127471 primerM： DNA分子量標記DNA molecular weight marker； GXNN1： 廣西南寧1 Nanning 1, Guangxi； JXGZ： 江西贛州 Ganzhou, Jiangxi； FJSM： 福建三明 Sanming, Fujian； SCPZH： 四川攀枝花 Panzhihua, Sichuan； SCDY： 四川德陽 Deyang, Sichuan； GXWZ： 廣西梧州 Wuzhou, Guangxi； GXNN2： 廣西南寧2 Nanning 2, Guangxi； GXFCG2： 廣西防城港2 Fangchenggang 2, Guangxi.

2.4 中國種群桉樹枝癭姬小蜂隱種鑒定

經(jīng)序列比對,最終得到320條605 bp的COI基因序列(GeneBank登錄號為MZ378835—MZ379154)； 聚類結果顯示，隱種A有104個樣本，隱種B有216個樣本，暫未發(fā)現(xiàn)隱種C樣本(圖2)。江西贛州、廣西防城港1、廣西防城港2、廣西南寧1、廣西南寧2、四川攀枝花、廣西梧州種群同時存在隱種A、B，四川德陽、福建三明、海南儋州、云南昆明、廣西來賓、廣西玉林、廣西欽州種群僅存在隱種B； 不同種群隱種A、B所占比例存在明顯差異，江西贛州、廣西防城港1、廣西梧州種群以隱種A樣本為主，其他種群以隱種B樣本為主(表6)。

2.5 全球桉樹枝癭姬小蜂隱種統(tǒng)計

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載全球5大洲18個國家共511條桉樹枝癭姬小蜂COI基因序列數(shù)據(jù)，對全球各國家和大洲進行隱種統(tǒng)計(表7)，可以看出老撾、泰國、越南和南非均存在不同程度的隱種A、B混合現(xiàn)象，澳大利亞存在隱種B、C，美洲和歐洲僅存在隱種A。

圖2 基于桉樹枝癭姬小蜂COI基因序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree constructed based on L. invasa COI gene sequence樣本序號后面的大寫字母A、B代表各樣本所屬的隱種類型； 樣本MH093212、MH093120和MH093002分別為隱種A、B、C的參考序列。The capital letters A, B after the samples No.represent the cryptic species type of each samples; Samples MH093212, MH093120 and MH093002 are the reference sequences of cryptic species A, B and C, respectively.

表6 桉樹枝癭姬小蜂隱種鑒定結果統(tǒng)計Tab.6 Statistical of L. invasa cryptic species identification result

3 討論

隨著經(jīng)濟全球化、國際旅游業(yè)和現(xiàn)代交通飛速發(fā)展，外來物種入侵日益嚴重。生物入侵不僅會對生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性造成嚴重破壞，而且會對當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的穩(wěn)定產(chǎn)生負面影響。SSR是種群遺傳學研究中常用的分子標記之一，但是SSR用于非模式生物必須先進行多態(tài)性引物開發(fā)， 尤其是傳統(tǒng)G-SSR發(fā)掘方法在微小的昆蟲中應用較為困難(魏丹丹等， 2014)，這極大限制了對非模式昆蟲的研究。隨著二代測序技術的快速發(fā)展，基于轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR克服了微衛(wèi)星位點獲取困難、成本高等弊端，從而促進了對非模式昆蟲微衛(wèi)星的研究進展。

桉樹枝癭姬小蜂轉錄組44 878個unigenes中共發(fā)掘出14 190個EST-SSR位點，EST-SSR出現(xiàn)頻率為31.62%(EST-SSR個數(shù)與unigenes個數(shù)之比)，這與梨網(wǎng)蝽(Stephanitisnashi)(40.37%)(謝瑾燕等， 2019)、中華蜜蜂(Apisceranacerana)(30.87%)(熊翠玲等， 2017)等的EST-SSR出現(xiàn)頻率相當； 但與橘小實蠅(Bactroceradorsalis)(4.23%)(魏丹丹等， 2014)、齒緣刺獵蝽(Sclominaerinacea)(5.67%)(黎東海等， 2019)、東方黏蟲(Mythimnaseparata)(11.51%)(李微等， 2017)、窄足真蚋[Simulium(Eusimulium)angustipes](68.33%)(郭歡等， 2018)等昆蟲差異較大。造成這種差異的主要原因可能是物種不同，也可能與EST-SSR篩選標準以及RNA質量有一定關系。

SSR長度是影響其多態(tài)性的重要因素，當SSR長度≥20 bp時多態(tài)性較高，SSR長度在12～20 bp之間時多態(tài)性中等，而SSR長度在12 bp以下時多態(tài)性較低(Temnykhetal.， 2001)。轉錄組是生物體某個細胞或組織在特定時間內的表達情況，EST-SSR核心序列重復次數(shù)往往不高，同時具有較高的保守性，因此EST-SSR多態(tài)性通常比G-SSR低(魏丹丹等， 2014； 郭歡等， 2018)。桉樹枝癭姬小蜂的EST-SSR長度集中在10～15 bp之間，占76.76%，僅有4.49%的EST-SSR長度≥20 bp，且多為單核苷酸重復類型，因此桉樹枝癭姬小蜂可能具有較低的遺傳多態(tài)性。

表7 全球桉樹枝癭姬小蜂隱種比例統(tǒng)計Tab.7 Statistics on the proportion of cryptic species of L. invasa in the world

為了得到質量較高且多態(tài)性良好的引物，引物篩選時本研究優(yōu)先選擇核心重復序列較長的EST-SSR位點設計引物，共選取400對EST-SSR引物進行開發(fā)； 其中一半引物擴增失敗，分析其原因可能是引物序列中的內含子阻止了引物退火，或者在引物側翼區(qū)域存在一個較大的內含子干擾PCR擴增(Sahaetal.， 2004)； 有205對擴增得到預期大小條帶，占合成引物的51.25%，引物擴增效率低于意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)(91.67%)(郭睿等， 2018)、星天牛(Anoplophorachinensis)(88.33%)(韓小紅等， 2019)、沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)(100%)(張鵬飛等， 2016)，但高于齒緣刺獵蝽(29.63%)(黎東海等， 2019)、意大利蝗(Calliptamusitalicus)(25.00%)(桑迪等， 2020)。

SSR多態(tài)性并非完全取決于SSR引物自身的多態(tài)性，與物種自身遺傳多樣性高低也有著密切聯(lián)系。Dittrich-Schr?der等(2018)利用14對桉樹枝癭姬小蜂G-SSR引物(LiSS1—LiSS14)研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞原始種的遺傳多樣性顯著高于其他入侵地區(qū)，且僅有部分G-SSR引物在入侵地區(qū)桉樹枝癭姬小蜂樣品中存在多態(tài)性。國外14對G-SSR引物中僅有3對引物在我國桉樹枝癭姬小蜂樣本具有多態(tài)性，說明國外G-SSR引物僅有少數(shù)可用于我國桉樹枝癭姬小蜂種群遺傳學研究，因此在進行種群遺傳學研究前，需要開發(fā)更多的多態(tài)性SSR引物進行聯(lián)合分析才能得出準確的結論。

據(jù)報道，我國江西贛州的桉樹枝癭姬小蜂均屬于隱種B(Nugnesetal.， 2015)，但筆者于2016年采樣時發(fā)現(xiàn)江西贛州種群中93.75%的桉樹枝癭姬小蜂為隱種A。出現(xiàn)這種情況一方面是由于以往研究采集的樣本量較少，有漏采隱種A的可能；另一方面可能是因為采樣點不同造成的。本研究廣西防城港2個采樣點相隔僅40 km，但是其隱種比例卻完全相反，廣西防城港1種群桉樹枝癭姬小蜂樣本的93.75%為隱種A，而廣西防城港2種群桉樹枝癭姬小蜂樣本的96.88%為隱種B，這說明我國桉樹枝癭姬小蜂的隱種分布可能并非自然傳播形成，而是人為活動的結果，且不同隱種的桉樹枝癭姬小蜂可能存在完全不同的入侵擴散路線，從而使得不同種群桉樹枝癭姬小蜂的隱種比例分布不均?？傮w來說，我國桉樹枝癭姬小蜂隱種B在數(shù)量上更占優(yōu)勢，隱種B可能比隱種A更先入侵我國。由于我國桉樹枝癭姬小蜂隱種類型與東南亞各國相近，故推測我國桉樹枝癭姬小蜂可能起源于東南亞。

隨著桉樹枝癭姬小蜂在世界范圍入侵擴散程度加劇，其隱種混合將成為未來的大趨勢。部分亞洲和非洲國家桉樹枝癭姬小蜂隱種大量混合，勢必使得當?shù)胤N群成為桉樹枝癭姬小蜂在世界范圍傳播擴散的橋頭堡種群，隱種混合可能導致滲透雜交而產(chǎn)生更適應環(huán)境的新基因型(Dittrich-Schr?deretal.， 2018)。我國大面積單一品種的桉樹種植區(qū)為桉樹枝癭姬小蜂快速適應新環(huán)境提供了良好條件，江西贛州、四川攀枝花、廣西梧州、廣西防城港1、廣西南寧1等種群均出現(xiàn)隱種混合現(xiàn)象，這些地理種群將有可能成為桉樹枝癭姬小蜂在我國持續(xù)傳播擴散的橋頭堡種群，隨著各地隱種混合加劇，桉樹枝癭姬小蜂的入侵性有可能進一步增強。

4 結論

本研究篩選出10對適合我國桉樹枝癭姬小蜂種群遺傳學研究的EST-SSR引物。我國存在A、B 2種類型的桉樹枝癭姬小蜂隱種，其中隱種A首次在我國發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂隱種鑒定可為該害蟲在生物防治中采用正確的生物型提供依據(jù)。