陳星州 周?chē)?guó)英 陳行鋼 江玲玉 包安華 劉君昂

(中南林業(yè)科技大學(xué) 南方人工林病蟲(chóng)害防治國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)沙 410004)

油茶(Camelliaoleifera)作為農(nóng)村興林富民的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和脫貧攻堅(jiān)的民生產(chǎn)業(yè)，在我國(guó)種植面積不斷擴(kuò)大。炭疽病是油茶栽培區(qū)主要病害之一，引起油茶落果、落蕾，甚至整株衰亡，在湖南省油茶種植區(qū)引起的落果率平均為20%，有時(shí)可高達(dá)40%～50%(喻錦秀等， 2014)。前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)油茶炭疽病的病原菌種類(lèi)復(fù)雜多樣，果生刺盤(pán)孢(Colletotrichumfructicola)是目前各產(chǎn)區(qū)油茶炭疽病的優(yōu)勢(shì)病原菌(李河， 2018)。

自然條件下，植物體會(huì)受到多種病原體的攻擊，因此植物形成了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，植物和病原體之間的相互作用現(xiàn)在被描述為一種共同進(jìn)化的軍備競(jìng)賽，被稱(chēng)之為之字形模型(Jonesetal.,2006)。當(dāng)病原體攻擊植物細(xì)胞時(shí)首先會(huì)促發(fā)植物一般防御機(jī)制，這個(gè)過(guò)程被指定為PAMP(pathogen-associated molecular pattern)觸發(fā)免疫模式或者觸發(fā)免疫(PAMP-triggered immunity,PTI)(Kushalappaetal.,2016)。另外，病原體也會(huì)通過(guò)將效應(yīng)子分泌到宿主細(xì)胞中來(lái)干擾PTI，植物通過(guò)直接或間接識(shí)別病原體效應(yīng)物的抗性(R)蛋白激活第二層免疫系統(tǒng)，這被稱(chēng)為效應(yīng)物觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity,ETI)。病原體通常會(huì)進(jìn)化出新的效應(yīng)子，并轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中干擾植物的免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)病原體定殖(Dangletal., 2013； Yanetal., 2018)。例如果生刺盤(pán)孢在早期侵染蘋(píng)果(Maluspumila)樹(shù)時(shí)分泌的效應(yīng)子CfEC96，缺失該基因的果生刺盤(pán)孢突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、附著胞的形成均不受影響，但是突變體對(duì)蘋(píng)果葉和果實(shí)的毒力減弱(Shangetal., 2020)。真菌效應(yīng)子都具有相似的分子特征:無(wú)糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol, GPI)的錨定位點(diǎn)，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有將蛋白輸送到線(xiàn)粒體或其他胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào)，含有N-端信號(hào)肽，富含半胱氨酸，氨基酸殘基<300個(gè)，序列高度特異(Ramachandranetal., 2017)。對(duì)于真菌效應(yīng)子的研究目前主要集中于稻瘟菌(Magnaportheoryzea)、番茄葉霉菌(Cladosporiumfulvum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等，但對(duì)于炭疽菌效應(yīng)子的研究報(bào)道較少。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的高速發(fā)展以及測(cè)序技術(shù)的不斷更新，利用生物信息學(xué)手段對(duì)效應(yīng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析逐漸成為篩選真菌候選效應(yīng)子的重要方法，并且有證據(jù)證明轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)可以預(yù)測(cè)毒力因子(Jonesetal., 2018)。

本研究綜合利用BUSCA、Target P、big-PI Predictor、GO、KEGG功能富集和PHI等生物信息分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)果生刺盤(pán)孢分泌蛋白和候選效應(yīng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，并通過(guò)煙草(Nicotianabenthamiana)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證候選效應(yīng)子的功能，擬為果生刺盤(pán)孢致病相關(guān)基因研究提供理論依據(jù)，同時(shí)為油茶種植的病害管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型本氏煙草(Nicotianabenthamia)種子、果生刺盤(pán)孢菌、質(zhì)粒pEGAD載體由中南林業(yè)科技大學(xué)森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101由南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供。

1.2 果生刺盤(pán)孢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測(cè)序樣品包括果生刺盤(pán)孢分生孢子組織以及由分生孢子侵染油茶葉片96 h后的病斑組織，每組樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。參考基因組為ColletotrichumfructicolaNara gc5基因組(BioProject Accession： PRJNA225509)。差異表達(dá)基因的篩選閾值為相對(duì)表達(dá)量|log2(fc)|≥1且FDR≤0.05，最終得到7 850個(gè)侵染前后差異表達(dá)的基于蛋白氨基酸序列用于后續(xù)分析。

1.3 果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白的生物信息學(xué)分析

將同時(shí)含有N端信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位為胞外分泌類(lèi)型、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域、無(wú)GPI錨定位點(diǎn)4個(gè)特征的蛋白質(zhì)定義為果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白。

BUSCA(http∥busca.biocomp.unibo.it)(Castrenseetal., 2018)可同時(shí)對(duì)果生刺盤(pán)孢轉(zhuǎn)錄組中編碼的全部蛋白序列的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、GPI錨定位點(diǎn)進(jìn)行分析。利用TargetP 1.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)上述定位到胞外的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證分析(Emanuelssonetal., 2007)。利用LipoP 1.0 Server(www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)對(duì)經(jīng)典分泌蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)的氨基酸組成進(jìn)行分析(Junckeretal., 2003)。

1.4 果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白的功能注釋

利用GO(http:∥www.geneontology.org)、KEGG(http:∥www.genome.jp/kegg/)(Kanehisaetal., 2019)、PHI(http:∥www.phi-base.org/)(Martinetal., 2019)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)經(jīng)典分泌蛋白序列進(jìn)行BLASTP比對(duì)，對(duì)其功能進(jìn)行注釋。

1.5 果生刺盤(pán)孢候選效應(yīng)子的預(yù)測(cè)分析

對(duì)果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白進(jìn)一步分析篩選，其篩選標(biāo)準(zhǔn)為氨基酸長(zhǎng)度<300且?guī)в?個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基(Jonesetal., 2018)，并利用Effector P(http:∥effectorp.csiro.au/)在線(xiàn)分析軟件對(duì)上述蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析(Pengetal.,1999)。

1.6 候選效應(yīng)子qRT-PCR定量分析

隨機(jī)選取9個(gè)候選效應(yīng)子，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證候選效應(yīng)子的基因表達(dá)情況(表1)。按照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說(shuō)明，分別提取分生孢子和葉片中的菌絲RNA。按照FastKing一步法除基因組cDNA試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)操作步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄； 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 作為模板，按照SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR 分析。將分生孢子中目的基因表達(dá)量定為1，通過(guò)擴(kuò)增獲得Ct值來(lái)計(jì)算目的基因在侵染時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，Actin為內(nèi)參基因(李司政等， 2020)。每個(gè)基因設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

表1 9個(gè)候選效應(yīng)子基因qRT-PCR的特異性引物序列Tab.1 9 candidate effectors gene-specific primer sequences designed for qRT-PCR

1.7 候選效應(yīng)子功能驗(yàn)證

以cDNA作為模板，從上述9個(gè)候選效應(yīng)子中隨機(jī)選取4個(gè)，擴(kuò)增其全長(zhǎng)基因片段。構(gòu)建pEGAD-CfEP(Colletotrichumfructicolaeffector protein)表達(dá)載體(表2)。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，選取測(cè)序正確的菌落提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌感受態(tài)內(nèi)。

攜帶重組載體的農(nóng)桿菌加入LB液體培養(yǎng)基中，搖床28 ℃、200 r·min培養(yǎng)24～48 h。6 000 r·min-1離心2 min收集菌液，棄上清液，加入適量煙草注射液[MES(10 mmol·L-1，pH5.6)、MgCl2(10 mmol·L-1)、AS(10 mmol·L-1)]懸浮農(nóng)桿菌，稀釋菌液至OD600值為0.5～1.0； 將懸浮液置于28 ℃，避光孵育2～3 h。使用1 mL的無(wú)菌注射器(去除針頭)，吸取適量懸浮菌液，利用滲入法將其注射到條件至適宜的本氏煙草葉片的背面。注射完成后，將煙草置于25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，2～3天后觀(guān)察煙草葉片表型，觀(guān)察葉片壞死情況。

剪下煙草葉片，利用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(3，3-diaminobenzidine,DAB)對(duì)煙草葉片進(jìn)行組織染色，具體參照何燕華等(2014)的方法。

表2 4個(gè)候選效應(yīng)子基因全長(zhǎng)克隆引物序列Tab.2 4 candidate effector gene-primer sequences designed for full-length cloning

2 結(jié)果與分析

2.1 果生刺盤(pán)孢分泌蛋白的預(yù)測(cè)

2.1.1 經(jīng)典分泌蛋白的預(yù)測(cè)分析 本研究利用BUSCA軟件同時(shí)對(duì)果生刺盤(pán)孢轉(zhuǎn)錄組中編碼的7 850條蛋白質(zhì)氨基酸序列的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、GPI錨定位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，分析的7 850條序列中有436個(gè)氨基酸序列含有N端信號(hào)肽，所占比例為5.55%； 其中含有分泌型信號(hào)肽的蛋白質(zhì)中有390個(gè)蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域； 在沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)螺旋的蛋白質(zhì)中有354個(gè)蛋白序列不具有GPI錨定位點(diǎn)； 具有以上3個(gè)特征的354個(gè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位均為胞外分泌類(lèi)型。進(jìn)一步用TargetP 1.1 Server對(duì)分泌到胞外的蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證分析可知，含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)345個(gè)，所占比例為97.46%。綜合上述分析，在果生刺盤(pán)孢侵染階段的轉(zhuǎn)錄組所編碼的7 850條蛋白質(zhì)氨基酸序列中，有345個(gè)符合經(jīng)典分泌蛋白特征，所占比例為4.39%。

2.1.2 經(jīng)典分泌蛋白的特征分析 1) 氨基酸長(zhǎng)度 經(jīng)典分泌蛋白氨基酸長(zhǎng)度在各區(qū)間段分布較為均勻，而符合效應(yīng)子篩選條件(<300 aa)的蛋白約占蛋白總數(shù)的36%，數(shù)量相對(duì)較少(圖1A)。

2) 信號(hào)肽長(zhǎng)度 在345個(gè)經(jīng)典分泌蛋白中，信號(hào)肽長(zhǎng)度(氨基酸殘基數(shù))最大為33個(gè)氨基酸，最小的為15個(gè)氨基酸； 其中，有64個(gè)蛋白含有長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，為數(shù)量最多(圖1B)。

圖1 經(jīng)典分泌蛋白的特征分析Fig.1 Characteristic analysis of classic secreted proteinsA： 氨基酸長(zhǎng)度分析； B： 信號(hào)肽長(zhǎng)度分析。A： Amino acid length analysis； B： Signal peptide length analysis.

3) 信號(hào)肽切割位點(diǎn)氨基酸出現(xiàn)頻率及分布 根據(jù)信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的不同，可將信號(hào)肽分為信號(hào)肽酶Ⅰ型(SPⅠ)和信號(hào)肽酶Ⅱ型(SPⅡ)。SPⅠ分泌型信號(hào)肽的典型結(jié)構(gòu)特征是C端切割位點(diǎn)(-3～-1位置)為A-X-A； SPⅡ?yàn)橹鞍仔盘?hào)肽，典型結(jié)構(gòu)是C端切割位點(diǎn)(-3～-1位置)為L(zhǎng)-(A/S)-(A/G)。305個(gè)經(jīng)典分泌蛋白含有SPⅠ型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，40個(gè)含有SPⅡ型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)。

信號(hào)肽中氨基酸殘基的分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，20種氨基酸的出現(xiàn)頻率從高到低依次為ASPVLTGQIDNREFKCHYMW。其中，非極性氨基酸G、A、V、L、P的出現(xiàn)頻率相對(duì)較頻繁，A所占比例最大，為22.88%。此外，分泌蛋白在-1位的氨基酸種類(lèi)較為保守，以非極性疏水氨基酸為主(A最多，所占比例高達(dá)66.09%)； 其次為-3位(P最多，所占比例為44.93%)(圖2)。

圖2 果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白中氨基酸的比例Fig.2 The ratio of amino acids in C. fructicola classic secreted proteins

2.2 果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白的功能預(yù)測(cè)

2.2.1 GO功能注釋 利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)345個(gè)經(jīng)典分泌蛋白進(jìn)行功能注釋分析，共得到465條GO術(shù)語(yǔ)信息； 其中分子功能(molecular function)>生物途徑(biological process)>細(xì)胞組分(cellular component)。在分子功能中最多的是催化活性(catalytic activity)，占22.18%(圖3A)； 在生物途徑中，最多的是初級(jí)代謝過(guò)程(primary metabolic process)，占25.0%(圖3B)； 在細(xì)胞組分中，最多的是細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器(intracellular membrane-bounded organelle)，占37.93%(圖3C)。各組分中占比較多的蛋白質(zhì)功能均與真菌的致病力以及生長(zhǎng)發(fā)育有著直接或間接的聯(lián)系。

2.2.2 KEGG功能富集 利用KEGG對(duì)經(jīng)典分泌蛋白345條氨基酸序列進(jìn)行分析，最終得到164條Pathway信息。其中最多的是代謝途徑(metabolic pathways)占26.2%，其次是次生代謝產(chǎn)物(biosynthesis of secondary metabolites)及淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)分別占10.98%和6.10%(圖4)。在經(jīng)典分泌蛋白中，碳水化合物代謝、抗氧化通路及水解酶基因等明顯富集。有研究表明侵染過(guò)程中果生刺盤(pán)孢行使包括“增長(zhǎng)”“細(xì)胞”“對(duì)刺激的響應(yīng)”“代謝過(guò)程”和“信號(hào)傳遞”功能的蛋白明顯增多(Keetal.,2014)，這與本研究結(jié)果相似。

2.2.3 PHI功能注釋 通過(guò)利用PHI(pathogen-host interaction data-base)致病菌數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)已經(jīng)獲得的345條經(jīng)典分泌蛋白進(jìn)行功能注釋?zhuān)囌页鼋?jīng)典分泌蛋白在致病菌中多行使何種功能。最終檢索得到80條結(jié)果，其中31個(gè)比對(duì)序列通過(guò)反向遺傳技術(shù)驗(yàn)證了其與致病的相關(guān)性，包括缺失后致死相關(guān)的基因1個(gè)，缺失后喪失致病力的基因4個(gè)，缺失后降低毒力的基因25個(gè)，還包含了1個(gè)已知效應(yīng)子(表3)，該效應(yīng)子發(fā)現(xiàn)于稻瘟病菌中，但在本研究檢索中未發(fā)現(xiàn)已知的炭疽病效應(yīng)子的信息，大多數(shù)已知致病基因同時(shí)在多個(gè)不同宿主致病菌中被發(fā)現(xiàn)，其中有一些蛋白在宿主為其他哺乳動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)的致病菌中也有發(fā)現(xiàn)，但數(shù)量較少(3.75%)，例如鼠類(lèi)的念珠菌(Candidaalbicans)病。

2.3 果生刺盤(pán)孢效應(yīng)子預(yù)測(cè)分析

真菌效應(yīng)子由于缺乏保守的氨基酸序列特征，預(yù)測(cè)一般采用相對(duì)寬泛的標(biāo)準(zhǔn)(Sperschneideretal., 2015)。大多數(shù)已知的真菌效應(yīng)子應(yīng)具有信號(hào)肽、分子量小以及富含半胱氨酸殘基等特點(diǎn)。本文在已預(yù)測(cè)了果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白的基礎(chǔ)上，以氨基酸長(zhǎng)度<300且半胱氨酸殘基的數(shù)量≥4為篩選條件，進(jìn)一步對(duì)效應(yīng)子進(jìn)行篩選。123個(gè)分泌蛋白氨基酸長(zhǎng)度符合篩選條件； 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，有65個(gè)分泌蛋白同時(shí)滿(mǎn)足半胱氨酸殘基≥4的條件； 即果生刺盤(pán)孢在侵染階段有65個(gè)候選效應(yīng)子差異表達(dá)，占轉(zhuǎn)錄本蛋白總數(shù)的0.8%，占經(jīng)典分泌蛋白總數(shù)的18.84%。對(duì)效應(yīng)子氨基酸長(zhǎng)度分析發(fā)現(xiàn)，有64個(gè)效應(yīng)子氨基酸長(zhǎng)度小于200 aa，59個(gè)長(zhǎng)度在200～300 aa之間。對(duì)效應(yīng)子半胱氨酸殘基數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其主要集中在4～8之間，其中以4個(gè)和6個(gè)較多，分別占27.7%和24.61%。對(duì)候選效應(yīng)子進(jìn)行功能分析，有36個(gè)候選效應(yīng)子在ColletotrichumfructicolaNara gc5參考基因組中具有注釋?zhuān)渲邪◣锥≠|(zhì)結(jié)合蛋白、短鏈脫氫酶、酪氨酸酶以及含有CFEM結(jié)構(gòu)域的蛋白(含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)僅存在于真菌中)等。除此之外，另有29個(gè)為假定蛋白(hypothetical protein)。

此外，前人報(bào)道Effector P作為一類(lèi)真菌效應(yīng)子的在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件，綜合考慮了所預(yù)測(cè)蛋白的序列長(zhǎng)度、分子量、蛋白電荷、半胱氨酸絲氨酸和色氨酸含量外，同時(shí)將真菌蛋白質(zhì)在植物中的表達(dá)特征作為效應(yīng)子預(yù)測(cè)的優(yōu)選項(xiàng)，從而大幅度提高了效應(yīng)子預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。利用Effector P在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件對(duì)65個(gè)候選效應(yīng)子分析發(fā)現(xiàn)，有31個(gè)符合Effector P效應(yīng)子標(biāo)準(zhǔn)，而其中除了14個(gè)獲得注釋外，其他17個(gè)均為假定蛋白。

2.4 果生刺盤(pán)孢候選效應(yīng)子的表達(dá)量分析

采用隨機(jī)抽樣的方法選取9個(gè)候選效應(yīng)子基因進(jìn)行qRT-PCR分析(圖5)。9個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與在RNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的趨勢(shì)相似。侵染時(shí)期9個(gè)候選蛋白基因，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果相符，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)是可靠的。同時(shí)也符合效應(yīng)子一般在侵染階段會(huì)大量表達(dá)的情況。

圖5 果生刺盤(pán)孢中9個(gè)候選效應(yīng)子的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of nine candidate effectors from C. fructicola transcriptomeRNA-Seq和qRT-PCR比較驗(yàn)證結(jié)果。誤差條表示平均值的誤差值。Comparison of RNA-Seq and qRT-PCR validation results.Error bars represent the standard error of the mean.

圖6 果生刺盤(pán)孢中4個(gè)候選效應(yīng)子的功能驗(yàn)證Fig.6 Functional verification of 4 candidate effectors in C. fructicola

2.5 果生刺盤(pán)孢候選效應(yīng)子的功能驗(yàn)證

利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證選取的4個(gè)候選效應(yīng)子均能誘使煙草葉片發(fā)黃或皺縮(圖6)，且與陽(yáng)性對(duì)照Bax蛋白造成的結(jié)果一致，而注射空載體的區(qū)域未發(fā)生相應(yīng)變化。DAB染色實(shí)驗(yàn)注射候選效應(yīng)子區(qū)域和Bax蛋白區(qū)域均有深褐色沉淀，注射空載體區(qū)域未發(fā)生變化，這一結(jié)果也表明注射區(qū)域煙草細(xì)胞出現(xiàn)損傷，有大量H2O2沉積。以上結(jié)果均表明，果生刺盤(pán)孢候選效應(yīng)子基因成功導(dǎo)入煙草中，并激活煙草細(xì)胞的防御反應(yīng)，誘使煙草細(xì)胞凋亡，與其他研究人員驗(yàn)證的大多數(shù)效應(yīng)子功能相符。

3 討論

3.1 果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白預(yù)測(cè)與篩選

分泌蛋白作為一類(lèi)重要的致病因子，與植物病原真菌的致病性密切關(guān)聯(lián)，隨著越來(lái)越多病原真菌基因組測(cè)序的完成，應(yīng)用生物信息手段對(duì)其分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，有利于全面了解其致病機(jī)制。而隨著生物信息學(xué)分析軟件的不斷更新，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)的日益豐富，對(duì)于蛋白基本特征的預(yù)測(cè)手段也越來(lái)越多，越來(lái)越準(zhǔn)確。通過(guò)分析草莓(Fragariaananassa)與果生刺盤(pán)孢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(包括24、48、96 h 3個(gè)時(shí)間段)，并利用Signal P、TMHMM、TargetP和big-PI predictor預(yù)測(cè)工具分別對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、GPI錨定位和亞細(xì)胞定位分析最后得到52個(gè)候選效應(yīng)子(Emanuelssonetal., 2000)，在分析過(guò)程中還含有多個(gè)來(lái)自其他植物病原體的已知效應(yīng)子，如基因CGGC5_2199(Cmu1的同源物)，可抵消水楊酸(SA)宿主的依賴(lài)性免疫，降低SA前體分支糖酸鹽的水平(Zhangetal., 2018)，基因CGGC5_10914(Ecp6的同源物)可以螯合幾丁質(zhì)寡糖以防止引起植物免疫力(Djameietal., 2011)，其結(jié)果與本文的分析結(jié)果相似。綜上所述，本文利用BUSCA分析軟件可以同時(shí)分析多種結(jié)構(gòu)，在一定程度上減輕了預(yù)測(cè)工作的難度，同時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性較高。

3.2 果生刺盤(pán)孢經(jīng)典分泌蛋白功能注釋及分析

真菌在侵染寄主植物時(shí)會(huì)分泌大量的毒力因子，如效應(yīng)子、植物細(xì)胞降解酶和次生代謝物生成酶等。多數(shù)情況下，并不是單一的毒力因子起作用而是多種酶類(lèi)共同作用，致使真菌成功侵染寄主植物，此外除了毒力因子之外，真菌會(huì)產(chǎn)生許多幫助其生長(zhǎng)增殖的酶類(lèi)，以致于更好地完成侵染。為研究候選效應(yīng)子在侵染階段中的作用，本文利用GO、KEGG、PHI 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)果生刺盤(pán)孢侵染階段轉(zhuǎn)錄組中345個(gè)分泌蛋白進(jìn)行功能注釋分析分別獲得465條GO術(shù)語(yǔ)信息、164條Pathway信息和80條致病相關(guān)基因，與前人分析獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中富含小分泌蛋白、碳水化合物活性酶和次生代謝產(chǎn)物合成酶的結(jié)果相符(Jongeetal., 2010)； 就KEGG功能富集結(jié)果表明，大多數(shù)蛋白與真菌代謝途徑有關(guān)，其次真菌的次生代謝產(chǎn)物的合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)的合成、淀粉和蔗糖代謝和酪氨酸代謝功能有明顯的富集。因此，推測(cè)大多數(shù)蛋白的代謝途徑都與真菌致病能力和維持真菌自身的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，如酪氨酸酶就與部分真菌孢子形成以及穩(wěn)定性、毒力和黑色素形成有密切的關(guān)系(Liangetal., 2018)； Halaouli等(2006)對(duì)膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，碳水化合物代謝、抗氧化通路及水解酶基因等明顯富集，這與本文結(jié)果相似。

3.3 果生刺盤(pán)孢候選效應(yīng)子的定量分析及功能驗(yàn)證

在345個(gè)經(jīng)典分泌蛋白中篩選得到17個(gè)未被注釋的候選效應(yīng)子，隨機(jī)選取9個(gè)候選效應(yīng)子在侵染階段都有明顯的表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相似都上調(diào)表達(dá)，這與Zhang等(2016)研究結(jié)果相似。選取的4個(gè)候選效應(yīng)子在煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)中也表現(xiàn)出具有誘使細(xì)胞壞死的功能，這進(jìn)一步證實(shí)了本文所獲得的候選效應(yīng)子的可靠性?；诂F(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，今后可深入研究候選效應(yīng)子的功能和作用機(jī)制，包括利用亞細(xì)胞定位技術(shù)探究其作用位點(diǎn)、候選效應(yīng)子的信號(hào)肽功能、篩選與候選效應(yīng)子相匹配的靶標(biāo)蛋白等。

4 結(jié)論

果生刺盤(pán)孢侵染油茶葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分析篩選得到17個(gè)候選效應(yīng)子，qRT-PCR驗(yàn)證了其中9個(gè)候選效應(yīng)子的表達(dá)情況同時(shí)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)，鑒定出其中4個(gè)候選效應(yīng)子具有誘導(dǎo)煙草葉片細(xì)胞壞死的功能。利用生物信息的手段設(shè)置合理的篩選條件對(duì)病原真菌侵染植物階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，能有效篩選得到病原真菌效應(yīng)子，這為植物與病原真菌的互作提供研究思路。