李珊，劉永琪，朱垠豪，葛星辰，段明，韓淵懷，3，馬芳芳，3*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801；3. 雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica（L.）Beauv.）為禾本科狗尾草屬的一種重要的雜糧作物，在距今6 000～7 000 年前的新石器時(shí)代中早期完成馴化，成為農(nóng)耕文化的主栽作物，廣泛種植于亞洲與歐洲溫帶和熱帶地區(qū)。中國(guó)是谷子的原產(chǎn)地，主要栽培在北方的干旱半干旱地區(qū)和鹽堿地地區(qū)，常年的播種面積約133. 3 萬(wàn)hm2左右［1］。谷子對(duì)干旱及其他不良環(huán)境的耐受性和適應(yīng)性較強(qiáng)，同時(shí)小米富含蛋白質(zhì)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素、維生素、類(lèi)胡蘿卜素、葉酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且不含麩質(zhì)，對(duì)于患有動(dòng)脈硬化、糖尿病和心臟病的人來(lái)說(shuō)是很好的飲食選擇［2，3］。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），也被稱(chēng)為反式作用因子?，F(xiàn)如今抗逆基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物響應(yīng)逆境脅迫的研究報(bào)道已經(jīng)非常普遍，轉(zhuǎn)錄因子可以單獨(dú)或者與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用于逆境響應(yīng)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中的啟動(dòng)子元件，與之結(jié)合從而激活或者抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高植物對(duì)逆境脅迫的耐性與抗性，促進(jìn)植物在生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成過(guò)程中逐漸形成抵抗逆境的各種應(yīng)答體系［4］。

ZF-HD（Zinc Finger Homeodomain）轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它的顯著特征是包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc fingre，ZF）和一個(gè)同源異形盒結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD），也是由此命名。生物體中都存在同源異形基因，參與調(diào)節(jié)它們的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成以及對(duì)逆境的抗性和耐受性，最早于1984 年在果蠅中發(fā)現(xiàn)［5］。所有同源異形基因都有一個(gè)由180 個(gè)堿基的核酸序列組成的同源異形框（homeobox），這個(gè)區(qū)域非常穩(wěn)定，可以轉(zhuǎn)錄翻譯折疊形成一個(gè)60 個(gè)氨基酸組成的高度保守的三螺旋結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為同源異形盒結(jié)構(gòu)域，能夠與特定的DNA 序列相互作用［6］。根據(jù)HD 蛋白氨基酸序列之間的相似程度將其分為7 個(gè)不同的亞家族，分別為：ATHB8、GL2、ZM-HOX、HAT1、HAT2、KNOX 和BEL。 之后在水稻中共鑒定出107 個(gè)HD 蛋白基因，并將其細(xì)分為10 個(gè)亞家族，分別為ZF-HD、HD-Zip I-IV（Homeodomain-leucine zip?per）、PHD（Homeodomain-finger）、KNOX I-II（Knottedl-like homeobox），WOX（Wuschel-relat?ed homeobox）和BLH 家族［7］。鋅指結(jié)構(gòu)是一種存在于可以調(diào)控基因表達(dá)的DNA 結(jié)合蛋白中的結(jié)構(gòu)，它的典型特征是可以通過(guò)兩對(duì)保守的半胱氨酸和/或組氨酸殘基與Zn2+結(jié)合自我盤(pán)曲折疊形成穩(wěn)定的獨(dú)特的“手指”狀的多肽空間構(gòu)型［8，9］。鋅指蛋白最初在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［10］，Shi等通過(guò)鋅指蛋白中組氨酸（His）與半胱氨酸（Cys）殘基位置與數(shù)目的不同將其分為C2H2、C2HC、C6、C2HC5、C3HC4、C4HC3、C4、C3H 等多種類(lèi)型，其中C2H2類(lèi)型是鋅指蛋白在生物體中存在的主要類(lèi)型［11］。

目前國(guó)內(nèi)外許多研究證明ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、開(kāi)花和抵抗外界不良環(huán)境時(shí)發(fā)揮著重要作用。已有研究表明在擬南芥中共有17個(gè)ZF?HD基因家族成員，它們作為轉(zhuǎn)錄因子，具有獨(dú)特的生理特性，其中13 個(gè)成員在擬南芥花器官發(fā)育階段的表達(dá)量顯著升高［11］；脅迫誘導(dǎo)ZHD1和NAC 轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥ERD1基因的表達(dá)，從而提高擬南芥的抗逆性［12，13］。在水稻中鑒定出7 種與OsDREB1B基因啟動(dòng)子結(jié)合的鋅指TFs，這些TFs 與啟動(dòng)子結(jié)合并相互作用抑制OsDREB1B的表達(dá)，參與對(duì)不同非生物脅迫的反應(yīng)，并在抵抗生物脅迫中發(fā)揮作用［14］。此外在葡萄基因組中共鑒定了13 個(gè)ZHD基因（VvZHD），這些VvZHD基因表達(dá)表現(xiàn)出明顯的時(shí)空特異性，并在不同脅迫和激素處理?xiàng)l件下差異表達(dá)，表明葡萄VvZHDs可能參與調(diào)控葡萄對(duì)各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)［15］。茶葉CsZF?HDs在不同非生物脅迫和激素誘導(dǎo)（干旱、低溫、外源SA、MeJA、ABA 和GA3）下差異表達(dá)［16］。煙草ZH?HD基因家族中NtZF?HD21基因在干旱處理后被誘導(dǎo)高表達(dá)，通過(guò)亞細(xì)胞定位分析和病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）等方法證明了NtZF-HD21 蛋白是一種核蛋白并且NtZF?HD21基因的沉默降低了煙草的抗旱性［17］。通過(guò)對(duì)玉米中24 個(gè)ZF?HD家族基因在干旱、高鹽脅迫處理和ABA 誘導(dǎo)下的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，基因ZmZHD11和ZmZHD12強(qiáng)烈響應(yīng)這3 種處理，并且在干旱處理和高鹽脅迫下表達(dá)量顯著升高，表明這2 個(gè)基因在逆境脅迫下通過(guò)改變ABA 合成代謝和信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)抵抗逆境［18］。在大白菜中大多數(shù)BraZF?HD基因在開(kāi)花和長(zhǎng)日照處理中高表達(dá)，表明BraZF?HD家族基因成員在控制大白菜開(kāi)花方面可能具有冗余和獨(dú)特的功能，此外，這些基因大多在非生物脅迫下被顯著誘導(dǎo)，這意味著它們可能在這些過(guò)程中也發(fā)揮重要作用［19］。通過(guò)上述的研究表明ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)在植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成過(guò)程中遭受逆境時(shí)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

本研究通過(guò)利用生物信息學(xué)方法對(duì)谷子ZFHD 家族蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域以及家族基因系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子、在不同組織及干旱脅迫下的表達(dá)模式等進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步探索ZF?HD家族基因在谷子的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成以及遭受逆境脅迫時(shí)的調(diào)控作用，為進(jìn)一步提高谷子的抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 數(shù)據(jù)獲取

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome. jgi.doe. gov/pz/portal. html）下載谷子（Setaria italicav2. 2）、擬南芥（Arabidopsis thalianaTAIR10）和水稻（Oryza sativav7_JGI）的全基因組序列、CDS序列、蛋白序列。 并從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed）下載水稻和擬南芥ZF-HD 家族蛋白序列。

1. 2 谷子ZF?HD 家族基因的鑒定及在染色體上的定位

利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam. xfam. org/）下載ZF?HD基因的PF04770 結(jié)構(gòu)域種子數(shù)據(jù)stock?holm 文件。利用HMMER 在線軟件中的hmmsearch 在谷子的總蛋白質(zhì)序列中進(jìn)行搜索［20］，篩選閾值小于0. 01 的基因?yàn)楣茸覼F?HD家族基因。 使用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中Batch search（http：//pfam. xfam. org/search#searchBatchBlock）對(duì)HM?MER 得到的候選基因進(jìn)行驗(yàn)證。

利用谷子的基因組注釋文件，對(duì)鑒定驗(yàn)證后的ZF?HD家族基因所處染色體條數(shù)，基因長(zhǎng)度，在染色體上的起始位點(diǎn)等信息進(jìn)行提取，利用TB?tools［21］對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行可視化，得到基因染色體分布圖。

1. 3 谷子ZF?HD 蛋白的基本信息和理化性質(zhì)分析

利用ExPASY-ProtParam 在線軟件（https：//web. expasy. org/ protparam/）分析統(tǒng)計(jì)谷子ZFHD 家族中所有的蛋白序列的氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)和分子量等理化性質(zhì)。

1. 4 谷子與擬南芥、水稻ZF?HD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 7. 0［22］軟水件對(duì)谷子與擬南芥、水稻中ZF-HD 蛋白序列進(jìn)行聚類(lèi)和進(jìn)化分析，采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，泊松模型（Poisson Model）計(jì)算遺傳距離，步長(zhǎng)檢測(cè)法（Bootstrp method）檢測(cè)建樹(shù)的質(zhì)量，檢測(cè)次數(shù)為1 000（bootstrap：1 000 replica?tions），其它參數(shù)選擇默認(rèn)。利用FigTree 軟件對(duì)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)進(jìn)行編輯和美化。

利用谷子ZF?HD家族基因的CDS 序列和核酸序列文件，通過(guò)GSDS 在線軟件（http：//gsds.cbi. pku. edu. cn/）分析谷子ZF?HD基因核酸序列中外顯子-內(nèi)含子（exon-intron）的分布，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1. 5 谷子ZF?HD 家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線軟件MEME［23］（http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)谷子ZF-HD 蛋白氨基酸序列中的保守Motifs 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選擇預(yù)測(cè)的Motifs的個(gè)數(shù)（Select the number of motifs）為8 個(gè)，并使用TBtools 工具對(duì)谷子ZF-HD 蛋白氨基酸序列上的保守motifs 的數(shù)量、外置進(jìn)行可視化，對(duì)于分析ZF-HD 蛋白序列中發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)域是否缺失，功能是否喪失有一定的作用。

1. 6 谷子ZF?HD 基因啟動(dòng)子區(qū)域啟動(dòng)子元件分析

選取谷子ZF?HD基因核酸序列起始密碼子上游1 500 bp 長(zhǎng)度的序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，將其輸入到PlantCARE 在線軟件（http：//bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html）中得到每個(gè)谷子ZF?HD基因啟動(dòng)子區(qū)域中所有的啟動(dòng)子元件，篩選出一些重要的響應(yīng)元件，通過(guò)TBtools進(jìn)行可視化分析。

1. 7 谷子與擬南芥、水稻ZF?HD 基因共線性及選擇壓力分析

通過(guò)用MCScanX［24］軟件獲取谷子ZF?HD基因與擬南芥、水稻全基因組中的共線性基因，分析查找共線性基因在染色體上的位置。 利用TB?tools 工具展現(xiàn)這些共線性基因間的關(guān)系。 利用Tbtools 中Simple Ka/Ks Calculator（NG）工具計(jì)算共線性基因之間的Ka/Ks值，分析谷子ZF?HD基因家族進(jìn)化過(guò)程中受到的選擇壓力作用。

1. 8 谷子ZF?HD 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)PSORT Prediction（http：//psort1. hgc.jp/form. html）對(duì)谷子的ZF-HD 蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1. 9 ZF?HD 家族基因在谷子不同組織以及干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

從Phytozome 公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載ZF?HD家族基因的在谷子根、葉、幼芽、穗不同組織的表達(dá)量FP?KM 值，分析ZF?HD家族基因各個(gè)組織中的表達(dá)差異性和特異性；利用本實(shí)驗(yàn)室已有的谷子田間自然干旱脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)ZF?HD家族基因在不同抗旱性品種早中晚3 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況進(jìn)行分析。具體處理為：將干旱敏感品種AN04 和抗旱品種YG1 種植于旱棚，出苗3 周后進(jìn)行自然干旱處理，對(duì)照組土壤含水量始終維持在65% 左右，當(dāng)干旱處理組大部分谷子葉片有萎蔫狀態(tài)，土壤含水量下降到15%～20% 時(shí)，在同天早上8 點(diǎn)（M）、中午12 點(diǎn)（N）和晚上8 點(diǎn)（E）剪取葉片，液氮速凍保存，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1. 10 實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序公司測(cè)序返回的RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的完整性和濃度。 使用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進(jìn)行基因組DNA 污染的消除和第一鏈cDNA的合成。 采用2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 分析，β?actin作為內(nèi)參［25］。反應(yīng)體系共10 μL，包括2×Super Mix 5 μL，dd H2O 3. 4 μL，cDNA 1 μL，正向引物以及反向引物各0. 3 μL。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性下15 s，60 ℃退火20 s，40 個(gè)循環(huán)；65～95 ℃條件下檢測(cè)熔點(diǎn)曲線。通過(guò)分析cDNA 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得每個(gè)基因的擴(kuò)增效率，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，引物名稱(chēng)及序列詳見(jiàn)表1。

表1 qRT?PCR 引物序列Table 1 Primers for qRT?PCR

2 結(jié)果與分析

2. 1 谷子ZF?HD 家族基因鑒定及染色體定位

利用ZF?HD家族基因的HMMER 模型在谷子中篩選并鑒定到16 個(gè)ZF?HD家族成員。利用功能注釋文件所獲取谷子ZF?HD家族基因在染色體上的具體位置信息繪制染色體分布圖。從圖1 可以看出，谷子共有9 條染色體，ZF?HD家族成員不均勻的分布在除4 號(hào)染色體外的其它8 條染色體上，2 號(hào)染色體分布的家族成員最多（4 個(gè)）。

圖1 ZF?HD 基因染色體定位Fig.1 Chromosome location of ZF?HD genes in foxtail millet

2. 2 谷子ZF?HD 蛋白基本信息和理化性質(zhì)分析

從表2 中可以看出，谷子ZF-HD 蛋白氨基酸長(zhǎng)度在87～719 之間，其中Seita. 8G007100基因編碼的蛋白序列最短，Seita. 9G115100基因編碼的蛋白序列最長(zhǎng)；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)介于6. 42～9. 15 之間，其中有10 個(gè)家族蛋白質(zhì)等電點(diǎn)大于7 呈堿性，6 個(gè)家族蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)小于7 呈酸性；蛋白質(zhì)分子量在9. 32～76. 18 kDa 之間。

表2 谷子ZF?HD 蛋白的序列特征Table 2 Sequence characteristics of ZF?HD proteins in foxtail millet

2. 3 谷子與擬南芥、水稻ZF-HD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建

利用谷子、擬南芥和水稻中分別16、17、15 條ZF-HD 蛋白序列、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，可以進(jìn)一步確定3 個(gè)物種間ZF?HD基因的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和進(jìn)化關(guān)系。圖2 顯示：3 個(gè)物種共48 個(gè)ZF-HD 氨基酸序列構(gòu)建所得的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可分為6 大類(lèi)：ZHDⅠ、ZHDⅡ、ZHDⅢ、ZHDⅣ、ZHDⅤ、MIF。進(jìn)化樹(shù)顯示ZHDⅢ亞族中只存在3 個(gè)擬南芥ZF-HD家族蛋白成員，沒(méi)有谷子和水稻ZF-HD 家族蛋白成員。 進(jìn)化樹(shù)中除了Seita. 7G307300 和Sei?ta. 8G007100、Seita. 2G204400 和Seita. 6G160500、Seita. 2G204500 和Seita. 6G161100、Seita. 2G200300和Seita. 5G273000 屬于旁系同源蛋白，其它ZFHD 家族蛋白均與水稻ZF-HD 家族蛋白聚為分支末端，表明谷子與水稻ZF-HD 蛋白的同源性顯著高于擬南芥。

圖2 谷子、擬南芥、水稻ZF-HD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of ZF-HD proteins in foxtail millet，Abidopsis and rice

2. 4 谷子ZF?HD 家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖3），16 個(gè)谷子ZF?HD基因家族中有87. 5% 的基因不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，只有外顯子，基因Seita. 2G204400和Seita. 2G200300的核酸序列中包含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

圖3 谷子ZF?HD 基因的基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of ZF?HD genes in foxtail millet

2. 5 谷子ZF?HD 家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

本試驗(yàn)對(duì)谷子ZF-HD 蛋白序列中8 個(gè)Motif進(jìn)行預(yù)測(cè)，從圖4 中可以看出谷子ZF-HD 蛋白序列中4 個(gè)Motif 保守性較高，保守Motif 1 和Motif 3組成了ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子中富含半肌氨酸和組氨酸二聚化的鋅指結(jié)構(gòu)域，保守Motif 2 和Motif 4，組成了ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子的同源異形結(jié)構(gòu)域。所有ZF-HD 家族蛋白進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分成2 大分枝，分枝I 中4 個(gè)成員都只含有保守Motif 1 和Motif 3，分枝II 中有10 個(gè)ZF-HD 家族蛋白序列都含有Motif 1、2、3 和4，Seita. 2G200300 蛋白序列中缺少保守Motif 1、2、4，Seita. 5G273000 蛋白序列中缺少保守Motif 2。

圖4 谷子ZF-HD 家族蛋白氨基酸序列保守基序Fig.4 Conserved motifs of amino acid sequences of ZF-HD family proteins in foxtail millet

2. 6 谷子ZF?HD 基因啟動(dòng)子元件分析

利用PlantCARE 在線軟件對(duì)谷子ZF?HD家族基因啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，篩選保留重要的響應(yīng)啟動(dòng)子元件，通過(guò)TBtools 可視化的結(jié)果如下圖5。谷子16 個(gè)ZF?HD基因都含有光照響應(yīng)啟動(dòng)子元件，同時(shí)還存在許多其它豐富的啟動(dòng)子元件，例如：ABA、MeJA、水楊酸、生長(zhǎng)素、赤霉素等激素響應(yīng)元件；低溫誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)等非生物脅迫響應(yīng)元件，其中9 個(gè)谷子ZF?HD基因含有干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件。

圖5 谷子ZF?HD 家族基因啟動(dòng)子元件Fig.5 Promoter elements of ZF?HD family genes in foxtail millet

2. 7 ZF?HD 基因的共線性分析及選擇壓力分析

谷子16 個(gè)ZF?HD家族基因分別、擬南芥、水稻的全基因組進(jìn)行共線性分析，結(jié)果如圖6 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷子ZF ? HD家族基因只有Sei?ta. 1G290100和Seita. 6G185900分別與擬南芥AT2G18350和AT5G65410存在共線性，有14 個(gè)谷子ZF?HD與水稻中13 個(gè)ZF?HD基因存在共線性，Seita. 2G200300和Seita. 5G273000在水稻和擬南芥中都不存在共線性基因。谷子ZF?HD基因家族中共鑒定出4 對(duì)片段重復(fù)基因，沒(méi)有串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象。為確定是否有選擇壓力作用于谷子ZF?HD家族基因，以擬南芥和水稻ZF?HD基因?yàn)閰⒄?，估算了進(jìn)化過(guò)程中谷子ZF?HD基因的選擇壓力。通過(guò)計(jì)算共線性基因選擇壓力值，發(fā)現(xiàn)谷子與水稻共線性基因的進(jìn)化選擇壓力值都小于1，表明谷子與水稻的共線性基因在進(jìn)化中經(jīng)歷了純化選擇，谷子ZF?HD家族中所有重復(fù)事件基因的Ka/Ks 值也均小于1，說(shuō)明這些基因均在純化選擇的作用下進(jìn)化。

圖6 水稻、擬南芥與谷子ZF?HD 基因的染色體共線性關(guān)系Fig.6 Collinear relationship of ZF?HD genes among rice，Arabidopsis and foxtail millet chromosome

2. 7 谷子ZF?HD 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用PSORT Prediction 在線軟件對(duì)谷子ZFHD 家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示（表4）：有7 個(gè)ZF-HD 家族蛋白成員定位在細(xì)胞質(zhì)中，5 個(gè)成員定位到細(xì)胞核，Seita. 2G200300 蛋白定位在質(zhì)膜上，其余蛋白定位在微體（過(guò)氧化物酶體）上。

2. 8 谷子ZF?HD 基因的表達(dá)模式分析

通過(guò)Phytozome 公共數(shù)據(jù)庫(kù)，查找并整理出ZF?HD基因家族成員在谷子根、葉、幼芽、穗4 個(gè)組織中表達(dá)量FPKM 值，利用TBtools 繪制表達(dá)熱圖。 組織表達(dá)分析結(jié)果顯示（圖7-A）：除了Sei?ta. 2G200300和Seita. 5G273000在谷子各組織中表達(dá)量幾乎為零外，其余基因在谷子根、葉、幼芽、穗中或多或少都存在差異表達(dá)。 在根中，Sei?ta. 7G307300的表達(dá)量最高，Seita. 8G007100次之，其余基因的表達(dá)量都較低。Seita. 1G290100和Seita. 2G204400在穗中的表達(dá)量最高。 在葉中，Seita. 2G204500的表達(dá)量最高，Seita. 6G161100的表達(dá)量次之。eita. 2G204500在幼芽中的表達(dá)最高，Seita. 2G204400表達(dá)量次之。

利用本實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)田間自然干旱脅迫下，谷子ZF?HD家族基因在不同抗旱性品種（AN04：干旱敏感品種，YG1：抗旱品種）早（M）、中（N）、晚（E）3 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。如圖7-B 所示：16 個(gè)ZF?HD家族基因根據(jù)表達(dá)情況的不同聚為3 類(lèi)，分別是在早、中、晚3 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)高表達(dá)和差異表達(dá)。 早上Sei?ta. 7G307300和Seita. 1G290100在AN04 對(duì)照與自然干旱處理之間差異表達(dá)，Seita. 3G098100、Sei?ta. 6G160500、Seita. 7G307300和Seita. 8G007100在YG1 對(duì)照與自然干旱處理間差異表達(dá)。中午Sei?ta. 7G10200和Seita. 9G115100在YG1 自然干旱處理后表達(dá)量顯著升高。 晚上Seita. 8G080800、Seita. 2G204400和Seita. 2G236300在YG1 自然干旱處理后表達(dá)量顯著升高，Seita. 2G204500和Sei?ta. 3G134200在自然干旱處理后的AN04 中表達(dá)量下降，相反在自然干旱處理后的YG1 中表達(dá)量上升。

圖7 谷子ZF?HD家族基因的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of ZF?HD family genes in foxtail millet

本研究從谷子ZF?HD家族基因中挑選了差異表達(dá)較為明顯的3 個(gè)基因Seita. 2G236300、Sei?ta. 3G098100、Seita. 3G134200進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。從圖8 中可以看出，晚上YG1 在干旱脅迫處理后，基因Seita. 2G236300的表達(dá)量顯著升高。早上干旱處理后的AN04 中基因Seita. 3G098100表達(dá)量較對(duì)照升高，而在YG1 中表達(dá)量降低；相反晚上干旱處理后的AN04 中基因Seita. 3G134200表達(dá)量較對(duì)照降低，而在YG1 中表達(dá)量升高。同時(shí)qRT-PCR 表達(dá)模式與RNA-Seq 數(shù)據(jù)集一致，驗(yàn)證了RNA-seq 數(shù)據(jù)的可靠性，也進(jìn)一步說(shuō)明這些基因的表達(dá)可能存在晝夜節(jié)律，并且在谷子干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中起到重要作用。

圖8 不同處理下3 個(gè)ZF?HD 家族基因表達(dá)模式的qRT-PCR 分析Fig.8 Relative expression patterns of three ZF?HD family genes under different treatments

3 討論

ZF?HD基因可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力［26］。 研究發(fā)現(xiàn)ZF?HD基因家族只存在于陸生植物中［19］，這類(lèi)基因可能在陸生植物祖先與單細(xì)胞藻類(lèi)趨異后得到了進(jìn)化。本研究利用生物信息學(xué)分析，在谷子中共鑒定出16 個(gè)ZF?HD家族成員，不均勻的分布在除4 號(hào)染色體外的其他染色體上。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中家族基因聚類(lèi)結(jié)果與Wei［27］等人對(duì)擬南芥ZFHD基因家族所分的亞家族相一致，其中ZHDⅢ亞族中只存在擬南芥ZF-HD 家族蛋白成員，可能是擬南芥進(jìn)化過(guò)程中所產(chǎn)生的一個(gè)特有的ZF-HD亞家族。谷子ZF?HD基因家族中Seita. 7G307300和Seita. 8G007100、Seita. 2G204400和Sei?ta. 6G160500、Seita. 2G204500和Seita. 6G16110 0、Seita. 2G200300和Seita. 5G273000屬于旁系同源基因，其他ZF?HD家族基因均與水稻ZF?HD家族基因聚為同一分支末端，屬于直系同源基因。表明谷子與水稻ZF?HD 蛋白的同源性顯然高于擬南芥，親緣關(guān)系更近，并且植物漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，大部分ZF?HD基因均按照物種特異性的方式進(jìn)行擴(kuò)展，該現(xiàn)象在植物其他基因家族的研究中也得到了廣泛驗(yàn)證［28］。16 個(gè)谷子ZF?HD基因家族中有87. 5% 的基因不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，與擬南芥［9］、茶樹(shù)［16］中ZF?HD家族基因缺乏內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相一致，這是ZF?HD基因家族的特點(diǎn)。缺乏內(nèi)含子結(jié)構(gòu)使得ZF?HD基因不能進(jìn)行選擇性剪接，從而使ZF-HD 蛋白高度保守，在進(jìn)化過(guò)程中功能不會(huì)發(fā)生太大的變化，比較固定［29］。保守基序分析將ZF-HD 家族蛋白成員分為兩大類(lèi)，Ⅰ類(lèi)蛋白缺少M(fèi)otif2 和Motif4，并且這些基因在進(jìn)化樹(shù)中聚類(lèi)在MIF 分組中，這與研究發(fā)現(xiàn)的MIF 亞家族中的基因只擁有鋅指結(jié)構(gòu)域但是不具有C 末端的同源域結(jié)構(gòu)域一致［30］。Ⅱ類(lèi)蛋白中兩個(gè)基因蛋白序列中保守Motif 的缺失可能是其在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中丟失造成的?；騿?dòng)子元件分析顯示ZF?HD基因家族均含有光照響應(yīng)元件以及豐富的低溫誘導(dǎo)、干旱等非生物脅迫響應(yīng)元件，ABA、水楊酸等激素響應(yīng)元件。 在對(duì)番茄［31］，玉米［18］ZF-HD 基因家族啟動(dòng)子元件分析中同樣發(fā)現(xiàn)許多逆境響應(yīng)元件，并通過(guò)非生物脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因家族中部分基因確實(shí)響應(yīng)逆境脅迫，這表明ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子這被賦予響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)控內(nèi)源激素的潛在功能，但這些基因在谷子中的具體功能還需要通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證?；蚣易宄蓡T間常常發(fā)生基因復(fù)制事件，從而使基因功能具有特異性和多樣性，這是推動(dòng)植物進(jìn)化的主要?jiǎng)恿χ唬?2，33］谷子中ZF?HD家族基因共鑒定出4對(duì)片段重復(fù)基因，沒(méi)有串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，說(shuō)明片段重復(fù)是谷子ZF?HD家族基因擴(kuò)增的主要方式。并且重復(fù)事件基因的Ka/Ks也值均小于1，說(shuō)明這些基因均在純化選擇的作用下進(jìn)化［34］。谷子ZF-HD家族蛋白成員亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)有7個(gè)蛋白被預(yù)測(cè)定位到了細(xì)胞質(zhì)中，5個(gè)蛋白定位到在細(xì)胞核中。

表4谷子ZF?HD家族蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 4 Prediction of subcellular localization of ZF?HDfamily proteins in foxtail millet

基因表達(dá)模式能夠一定程度上反應(yīng)基因功能［35］。已有研究發(fā)現(xiàn)小麥［36］、白菜［19］及擬南芥［11］的ZF?HD基因在花中的表達(dá)量很高，陸地棉［37］ZF?HD基因家族大部分在胚珠和纖維中表達(dá)，玉米［18］ZF?HD基因家族大部分在雄穗、雌穗和幼胚中高度表達(dá)。本研究中ZF?HD家族基因大多在谷子穗和莖中高表達(dá)，說(shuō)明ZF?HD家族基因在不同植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的不同部位發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)ZF?HD基因家族響應(yīng)干旱脅迫，例如在擬南芥受到干旱脅迫時(shí)ZHD1基因被誘導(dǎo)高表達(dá)從而提高擬南芥的抗旱性［12］，煙草ZH?HD基因家族中NtZF?HD21基因的沉默降低了煙草的抗旱性［17］。田間自然干旱脅迫下，谷子ZF?HD家族基因在不同抗旱性品種AN04和YG1早（M）、中（N）、晚（E）3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，不同基因的表達(dá)模式存在較大差異，部分基因的表達(dá)存在晝夜節(jié)律的變化，且在抗、感品種中對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)模式也不盡相同，表明ZF?HD家族基因具有組織表達(dá)特異性和時(shí)空特異性，并參與谷子干旱脅迫應(yīng)答響應(yīng)過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究共鑒定出16 個(gè)谷子ZF-HD 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，分布在8 條染色體上，分為5 個(gè)亞家族，大部分家族成員無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，在核外和細(xì)胞核中均有分布。谷子ZF?HD基因家族具有明顯的組織表達(dá)特異性，并參與谷子干旱脅迫應(yīng)答響應(yīng)過(guò)程。本研究將加深我們對(duì)ZF?HD基因家族在谷子中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的了解，為完善谷子抗逆分子機(jī)制研究，提高谷子抗逆性提供理論基礎(chǔ)。