羅中業(yè) 梁瑞 劉戴瑤 周凡 劉雙月 劉永新

年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失(age-related hearing loss，ARHL)是隨年齡增長(zhǎng)雙耳高頻聽(tīng)力下降的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失。S期激酶相關(guān)蛋白-2(S-phase kinase-associated protein-2，Skp2)是細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控細(xì)胞衰老。與年輕內(nèi)皮祖細(xì)胞相比，Skp2水平在復(fù)制性衰老的內(nèi)皮祖細(xì)胞中顯著降低[1]。Dong等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在初生小鼠耳蝸中的聽(tīng)覺(jué)上皮和螺旋神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，且其在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育中扮演重要角色; Minoda等[3]在成年豚鼠的聽(tīng)覺(jué)上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Skp2的高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與聽(tīng)覺(jué)功能密切相關(guān)。然而，耳蝸中Skp2的水平是否隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生顯著變化，此變化是否與ARHL有關(guān)，目前尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)觀察不同月齡小鼠耳蝸中Skp2的表達(dá)水平，探討Skp2在小鼠ARHL發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 63只健康1月齡 C57 BL/6J雄鼠，體重 15～16 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006；將小鼠隨機(jī)分為2月齡組、8月齡組和12月齡組，每組21只,正常飼養(yǎng)至相應(yīng)月齡。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 兔Skp2單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)買自美國(guó)Earthox公司；GAPDH購(gòu)買自美國(guó)Affinity 公司；FITC-鬼筆環(huán)肽購(gòu)自中國(guó)上海翊圣生物科技有限公司，抗熒光淬滅劑、MDA試劑盒及SOD試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司；Smart EP&OAE聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)由美國(guó)IHS公司生產(chǎn)。

1.3聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè) 各組小鼠噻拉嗪(100 mg/kg)和氯胺酮(10 mg/kg)混合麻醉后，分別將電極正極置于顱頂正中皮下，負(fù)極連接被測(cè)耳，接地電極連接對(duì)側(cè)耳。SmartEP&OAE聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音(tone burst)刺激，選取8、12、16、24和32 kHz 5個(gè)頻率分別進(jìn)行測(cè)試并記錄ABR閾值；重復(fù)率為39.1次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，疊加1 024次,掃描時(shí)程16.0 ms；聲刺激強(qiáng)度從100 dB SPL開(kāi)始，以5 dB逐次遞減，以最后一次出現(xiàn)ABR波Ⅰ并與上一波形有延續(xù)性的聲強(qiáng)定為ABR閾值。

1.4小鼠耳蝸氧化應(yīng)激水平測(cè)試 小鼠行ABR檢測(cè)后各組取10只處死，并于體式顯微鏡下分離耳蝸；4個(gè)耳蝸合成一份樣本，加入200 μL裂解液(強(qiáng))及2 μL蛋白酶抑制劑，耳蝸組織勻漿破碎；低溫高速離心機(jī) 4 ℃下，12 000 rpm/min離心 10 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)紫外分光光度儀分別檢測(cè)小鼠耳蝸丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平和總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活力。

1.5耳蝸標(biāo)本處理 各組5只小鼠耳蝸以4% 多聚甲醛溶液(PH 7.4)4 ℃下固定24 h，隨后標(biāo)本經(jīng)PBS潤(rùn)洗后置于4% EDTA溶液中脫鈣備用。

1.5.1小鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 每組5個(gè)左側(cè)耳蝸脫鈣后，體式顯微鏡下完整分離基底膜，并平鋪于載玻片。室溫下，組織在鬼筆環(huán)肽(1∶200)溶液中避光染色1 h，封片后熒光顯微鏡下觀察。選取每0.18 mm標(biāo)尺為一個(gè)視野，從基底膜頂部向底部連續(xù)觀察內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cell，IHC)、外毛細(xì)胞(outer hair cell，OHC)，利用耳蝸毛細(xì)胞定量軟件進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5.2免疫熒光染色 每組5個(gè)右側(cè)耳蝸，進(jìn)行石蠟常規(guī)包埋。將蠟塊沿蝸軸正中行5 μm連續(xù)切片，切片脫蠟至水后，用檸檬酸鈉修復(fù)液(PH 6.0)微波爐修復(fù)，山羊血清封閉1 h后，滴加抗Skp2單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加熒光二抗(1∶200)避光孵育1 h后，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下拍照。每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，應(yīng)用Image.J軟件在相同條件下測(cè)量小鼠耳蝸中的柯蒂器、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋三個(gè)部位的Skp2陽(yáng)性產(chǎn)物的光密度值，值越大，陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)烈。

1.6蛋白印跡檢測(cè) 小鼠(6只)處死后，迅速取耳蝸組織，4只耳蝸為一份樣本，加入裂解液RIPA，在低溫制備耳蝸蛋白樣本。SDS-聚丙烯凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，Skp2抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1.5 h，以ECL法發(fā)光顯影，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，內(nèi)參照物為 GAPDH，Skp2/GAPDH 比值代表 Skp2的蛋白表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，以單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠ABR閾值比較 各組ABR檢測(cè)結(jié)果如表1所示，與2月齡組比較，8月齡組、12月齡組小鼠各頻率 ABR閾值均升高(P<0.01)。與8月齡組相比，12月齡組小鼠各頻率ABR閾值顯著升高(P<0.01)。

表1 各組小鼠8～32 kHz各頻率ABR閾值

2.2各組小鼠耳蝸內(nèi)MDA水平和T-SOD活力比較 2月齡小鼠耳蝸中MDA水平最低，12月齡組MDA水平最高；2月齡小鼠耳蝸中T-SOD活力最高，12月齡組耳蝸中T-SOD活力最低。與2月齡組比較，8、12月齡組耳蝸中MDA水平增高(P<0.01)，T-SOD活力降低(P<0.01)；與8月齡組相比較，12月齡組耳蝸中MDA水平升高(P<0.01)，T-SOD活力降低(P<0.01)(表2)。

表2 各組小鼠耳蝸中MDA水平和T-SOD活力(n=5只)

2.3各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞缺失率比較 如圖1所示，2月齡組小鼠耳蝸毛細(xì)胞在全回缺失最少，而12月齡組小鼠耳蝸毛細(xì)胞在全回的缺失則明顯增多；與2月齡組比較，8月齡組小鼠耳蝸?lái)敾孛?xì)胞與2月齡組相差不明顯，越接近底回毛細(xì)胞缺失越多(P<0.01)，底回外毛細(xì)胞缺失最多(P<0.01)，約80%，而內(nèi)毛細(xì)胞損失約20%；而12月齡組小鼠全回內(nèi)、外毛細(xì)胞缺失均明顯升高(P<0.01)，與8月齡組相比較，12月齡組小鼠耳蝸毛細(xì)胞缺失率均明顯增加(P<0.01)，僅底回外毛細(xì)胞缺失相差不明顯。

2.4各組小鼠耳蝸Skp2蛋白的表達(dá) Skp2蛋白在小鼠耳蝸中的毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋均有表達(dá)，2月齡組Skp2蛋白表達(dá)水平最高，尤其在螺旋神經(jīng)節(jié)中；8月齡和12月齡組小鼠上述部位Skp2表達(dá)水平均降低(P<0.01)(圖2)。

圖1 各組小鼠耳蝸外毛細(xì)胞缺失率(a)和內(nèi)毛細(xì)胞缺失率(b)(n=5耳) 注:*與2月齡組比較P<0.01,#與8月齡組比較,P<0.01

圖2 各組小鼠耳蝸Skp2的表達(dá)(免疫熒光染色,標(biāo)尺=50μm) 注:箭頭所示為Skp2陽(yáng)性表達(dá)

2.5各組小鼠耳蝸Skp2蛋白印跡檢測(cè) 12月齡小鼠耳蝸Skp2電泳條帶顯色最淺，半定量分析結(jié)果顯示，隨著年齡增加，小鼠Skp2 蛋白含量逐漸減少(P<0.01)，12月齡組較2月齡組減少將近50%(圖3、表3)。

表3 各組小鼠Skp2表達(dá)的平均光密度值(n=5)及Skp2/GAPDH值

3 討論

目前認(rèn)為ARHL的主要病理改變?yōu)槊?xì)胞、血管紋、傳入螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等細(xì)胞凋亡，從而使小鼠耳蝸功能異常導(dǎo)致其聽(tīng)力損失，耳蝸內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致ARHL的可能機(jī)制之一[4]。ARHL發(fā)病率高，人口數(shù)量龐大，不僅給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成極大的影響，而且會(huì)使患者產(chǎn)生被孤立感，極大地影響患者的生活質(zhì)量[5]。因此，尋找明確的發(fā)病機(jī)制成為防治ARHL的當(dāng)務(wù)之急[6]。

圖3 各組小鼠耳蝸Skp2蛋白電泳條帶

聽(tīng)功能的減退、耳蝸毛細(xì)胞損傷與耳蝸的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，既往研究已經(jīng)表明氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的主要因素[7,8]，隨著年齡的增長(zhǎng)，耳蝸中氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)導(dǎo)致MDA蓄積，而SOD活力降低，抗氧化能力下降，最終導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡。本研究顯示，C57BL/6J小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)，聽(tīng)力逐漸下降，是理想的ARHL模型；隨著月齡增長(zhǎng)小鼠耳蝸MDA水平明顯升高，T-SOD活力明顯降低，而MDA反映耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激水平，SOD的活力反映耳蝸內(nèi)抗氧化能力，證實(shí)了在ARHL小鼠耳蝸存在氧化應(yīng)激損傷，與以往報(bào)道[9,10]一致。

細(xì)胞凋亡的過(guò)程涉及很多細(xì)胞因子。Skp2屬于F-box蛋白家族，相對(duì)分子量48 KD，是細(xì)胞周期的一個(gè)重要調(diào)控蛋白，可以通過(guò)降解細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[11]。Skp2具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用，在細(xì)胞衰老過(guò)程中，發(fā)揮重要作用[12～14]。研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在小鼠胚胎內(nèi)耳的早期發(fā)育階段的聽(tīng)覺(jué)上皮和神經(jīng)元中表達(dá)，其在小鼠聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[2]；此外，在豚鼠耳蝸中過(guò)表達(dá)Skp2，可以促進(jìn)非感覺(jué)細(xì)胞分化、增殖，進(jìn)而產(chǎn)生新的異位感覺(jué)毛細(xì)胞，改善豚鼠的聽(tīng)功能[3]；以上研究均提示，Skp2在維持正常聽(tīng)覺(jué)功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)免疫熒光及Western blot檢測(cè)，觀察到ARHL小鼠耳蝸Skp2表達(dá)隨著小鼠月齡的增長(zhǎng)而減少，小鼠月齡越大，其表達(dá)水平越低；Skp2水平降低主要出現(xiàn)在耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)以及血管紋等維持小鼠聽(tīng)功能的關(guān)鍵部位。推測(cè)，耳蝸氧化應(yīng)激水平的加劇可能影響了Skp2表達(dá)水平下降，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能障礙。

綜上，ARHL小鼠耳蝸Skp2水平降低可能與其耳蝸細(xì)胞的衰老和聽(tīng)功能減退有關(guān)，這可能為臨床治療和預(yù)防ARHL提供新的研究方向。本研究?jī)H觀察到了ARHL小鼠耳蝸Skp2減少及隨月齡增長(zhǎng)T-SOD活力降低、MDA水平升高，尚沒(méi)有更多證據(jù)表明是ARHL小鼠耳蝸中的氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)Skp2表達(dá)水平降低；下一步可通過(guò)調(diào)節(jié)耳蝸中Skp2的表達(dá)水平來(lái)明確其對(duì)老齡小鼠聽(tīng)力損失進(jìn)展的影響，進(jìn)一步明確Skp2減少與老化耳蝸氧化應(yīng)激水平增加的關(guān)系。