張?zhí)煊?何愛娟

先天性外中耳畸形俗稱小耳畸形，是顱面部常見的出生缺陷之一，全世界每10 000名新生兒中有0.83～17.4人罹患該疾病[1]。目前對(duì)于先天性外中耳畸形仍以自體肋軟骨移植耳再造為主要治療手段，但自體肋軟骨獲取創(chuàng)傷大，有繼發(fā)氣胸、胸廓畸形等風(fēng)險(xiǎn)，這些局限性使得軟骨組織工程技術(shù)進(jìn)行耳再造成為方向。19世紀(jì)80年代后，組織工程技術(shù)為人體器官的修復(fù)和重建展開了一個(gè)新篇章[2]，這一技術(shù)融合了生命科學(xué)、材料科學(xué)、信息工程科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等多個(gè)學(xué)科，各學(xué)科之間的相互結(jié)合、相互促進(jìn)，使得軟骨組織工程技術(shù)呈現(xiàn)迅猛發(fā)展的態(tài)勢(shì)[3]。自1997年曹誼林等[4]成功在裸鼠背上再生出人耳郭形態(tài)軟骨以來，組織工程耳再生獲得了諸多重要進(jìn)展，耳郭組織工程軟骨修復(fù)技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)的有效性已被大量實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證[3，5]，臨床應(yīng)用嘗試也獲得了一定進(jìn)展[6,7]，但要實(shí)現(xiàn)真正的臨床轉(zhuǎn)化和廣泛應(yīng)用仍有很多問題待解決。本文就目前軟骨組織工程耳再造取得的研究進(jìn)展、面臨的技術(shù)瓶頸及亟待解決的科學(xué)與技術(shù)問題進(jìn)行綜述，為軟骨組織工程耳再造的后續(xù)研究提供參考。

1 軟骨組織工程耳再造的發(fā)展史

組織工程技術(shù)興起于上世紀(jì)80年代，但直至1992年，人耳形態(tài)的組織工程耳郭再生才首次被Vacanti等[8]報(bào)道;此時(shí)的組織工程耳郭軟骨不僅不夠精致，植入裸鼠體內(nèi)后形變、收縮的比例很高。為了解決形態(tài)維持問題，曹誼林等[4]通過將組織工程耳郭軟骨與鈦網(wǎng)外支架結(jié)合從而解決了組織工程耳郭軟骨的體內(nèi)形態(tài)維持問題。能夠精確塑形，從而構(gòu)建出具有特定形態(tài)的組織器官是組織工程技術(shù)的優(yōu)勢(shì)之一。耳郭形態(tài)復(fù)雜且精致，組織工程耳郭軟骨再生的成功是形態(tài)控制在組織工程領(lǐng)域獲得突破的重要標(biāo)志。隨著材料學(xué)的發(fā)展，到了1998年，Ting等[9]首次嘗試了應(yīng)用纖維蛋白凝膠(天然材料)復(fù)合牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞成功在裸鼠體內(nèi)再生了耳郭形態(tài)軟骨,但由于凝膠材料的力學(xué)強(qiáng)度低、降解速率快，耳郭形態(tài)維持并不理想。盡管如此，這一研究結(jié)果開啟了天然材料在耳郭軟骨組織工程中的應(yīng)用嘗試，為后續(xù)復(fù)合材料的研究與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。隨后，Saim等[5]嘗試應(yīng)用Pluronic F-127水凝膠復(fù)合新鮮耳軟骨細(xì)胞(未經(jīng)體外擴(kuò)增)結(jié)合外科皮下隧道制備技術(shù),進(jìn)行豬自體軟骨注射移植，成功在豬體內(nèi)再生出具有耳輪形態(tài)的軟骨組織。這是組織工程耳郭軟骨再生在大動(dòng)物體內(nèi)獲得成功的重要標(biāo)志,但這一方法也存在諸多局限性，操作過程復(fù)雜、不能再生完整的耳郭形態(tài)軟骨、再生的軟骨不均質(zhì)等,因此，有關(guān)這一方法的應(yīng)用后續(xù)鮮有報(bào)道。

2002年，Haisch等[10]首次報(bào)道利用體外擴(kuò)增技術(shù)獲得足夠量的人鼻中隔軟骨細(xì)胞，且將這些擴(kuò)增細(xì)胞與PLLA-PGLA支架材料復(fù)合后能再生成熟的耳郭形態(tài)軟骨組織。盡管這一研究是建立在裸鼠模型之上的軟骨再生，但細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)的建立及人體細(xì)胞的應(yīng)用不僅解決了細(xì)胞數(shù)量問題，還從動(dòng)物細(xì)胞的探索過渡到了人體細(xì)胞的研究，大大推動(dòng)了軟骨組織工程臨床應(yīng)用的進(jìn)程。隨后，Kamil[11]在2003年通過對(duì)體外構(gòu)建技術(shù)的改良，同時(shí)適當(dāng)延長體外培養(yǎng)時(shí)間，最終在體外構(gòu)建出力學(xué)強(qiáng)度尚可，且具有正常人大小的耳郭形態(tài)軟骨，改寫了既往只能構(gòu)建小體積軟骨的歷史。2004年，為了獲得具有足夠力學(xué)強(qiáng)度的組織工程耳郭軟骨，Shieh等[12]嘗試了應(yīng)用新西蘭大白兔耳軟骨細(xì)胞復(fù)合聚己內(nèi)酯(poly e-caprolactone，PCL)支架材料進(jìn)行組織工程耳郭軟骨再生，最終在裸鼠體內(nèi)再生出力學(xué)強(qiáng)度好、三維形態(tài)精確的耳郭軟骨，初步解決了再生軟骨的力學(xué)強(qiáng)度及形態(tài)維持問題。在動(dòng)物試驗(yàn)獲得成功的基礎(chǔ)上，2009年，Yanaga等[7]通過獲取小耳畸形患者的殘耳軟骨細(xì)胞，體外擴(kuò)增后進(jìn)行自體腹部皮下注射以促進(jìn)其成熟,6個(gè)月后取出雕刻成耳郭支架用于耳再造;術(shù)后早期隨訪發(fā)現(xiàn)，患者的耳郭形態(tài)維持良好，與自體肋軟骨耳再造相比具有更好的彈性。盡管Yanaga的研究中只有4例患者，且再造耳的長期效果如何未見后續(xù)報(bào)道，但這些成果開啟了組織工程耳再造臨床試用的先河。時(shí)隔9年，周廣東等[6]探索性研究出了含PCL內(nèi)核的PGA/PLA-PCL復(fù)合支架，有效解決了組織工程軟骨力學(xué)強(qiáng)度不足、植入體內(nèi)后形態(tài)難以維持這一難題;與此同時(shí)，他們還通過延長體外誘導(dǎo)時(shí)間初步解決了支架材料的體內(nèi)炎癥反應(yīng)問題;在解決力學(xué)強(qiáng)度及炎癥反應(yīng)這兩大難題后，該課題組最終開展了真正意義上的組織工程耳再造臨床試驗(yàn)研究。經(jīng)過2年半的隨訪，他們發(fā)現(xiàn)部分患者獲得了較為滿意的耳再造效果。這項(xiàng)研究成果將組織工程耳再造的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程又向前推進(jìn)了一步。

經(jīng)過近30年的發(fā)展，組織工程耳再造通過逐個(gè)解決軟骨再生面臨的多個(gè)難題，從無免疫動(dòng)物的異體移植到免疫完全的大動(dòng)物自體移植，最后逐漸走到了臨床試驗(yàn)研究，使廣大研究者看到了組織工程技術(shù)在耳再造應(yīng)用中的曙光[13]。這不僅是組織工程耳再造的重要進(jìn)展，更是組織工程領(lǐng)域的重要突破，這些重要成果還推動(dòng)了組織工程軟骨在鼻再造等其它領(lǐng)域的臨床應(yīng)用與研究[14]。

2 組織工程耳再造面臨的難題

軟骨種子細(xì)胞、支架材料、培養(yǎng)體系等仍是組織工程耳郭軟骨再生的三大要素。盡管組織工程軟骨再生技術(shù)在眾多學(xué)科的推動(dòng)下獲得了很多重要發(fā)展，但時(shí)至今日，這三大要素仍有很多技術(shù)瓶頸需要突破，很多科學(xué)問題仍需闡明。

2.1軟骨種子細(xì)胞 早期的軟骨種子細(xì)胞來源主要有軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs)。近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展及研究者對(duì)各種細(xì)胞的深入理解，越來越多具有軟骨再生潛能的細(xì)胞被嘗試應(yīng)用于軟骨修復(fù)重建領(lǐng)域,如:小耳畸形患者的殘耳軟骨細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induce pluripotential stem cells, iPSCs)、經(jīng)血源子宮干細(xì)胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)等,但在組織工程耳郭軟骨再生領(lǐng)域，正常軟骨細(xì)胞、殘耳軟骨細(xì)胞、BMSCs等仍是目前最常用的種子細(xì)胞來源。正常軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程應(yīng)用最早的種子細(xì)胞，也是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞[15]。目前通過體外擴(kuò)增技術(shù)，僅需獲取很小的軟骨組織，體外擴(kuò)增后便可獲得足夠數(shù)量的種子細(xì)胞[16];但軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中極易出現(xiàn)去分化、軟骨再生能力迅速喪失等現(xiàn)象，這無疑給軟骨細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用帶來了巨大挑戰(zhàn)[17]。很多研究者發(fā)現(xiàn)通過利用三維培養(yǎng)、添加細(xì)胞因子等方法可使去分化的軟骨細(xì)胞發(fā)生重分化、功能逆轉(zhuǎn)，這些研究成果為解決軟骨去分化問題提供了重要參考依據(jù)[15,17]。但近兩年來研究發(fā)現(xiàn)，盡管三維培養(yǎng)、重分化誘導(dǎo)等方法可以促進(jìn)去分化軟骨細(xì)胞重分化，但重分化后的軟骨細(xì)胞并不能完全恢復(fù)到天然軟骨細(xì)胞的功能狀態(tài)[17]。因此，如何避免軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中的去分化現(xiàn)象仍是組織工程耳再造面臨的一大挑戰(zhàn)。

除正常軟骨細(xì)胞外，有研究發(fā)現(xiàn)小耳畸形患者的殘耳軟骨細(xì)胞增殖能力及軟骨再生能力均極強(qiáng)[18]，比較殘耳軟骨細(xì)胞與正常耳軟骨細(xì)胞再生的軟骨組織發(fā)現(xiàn)，二者在生化成份及組織特性上并未見明顯差異[19]。由此推測(cè)殘耳軟骨細(xì)胞可能是組織工程耳再造更為理想的種子細(xì)胞。盡管如此，小耳畸形者中有部分存在基因異常[20]，而這些異常是否會(huì)影響組織工程耳郭的長期轉(zhuǎn)歸，目前尚未有研究報(bào)道。

BMSCs具有良好的軟骨分化潛能、體外增殖能力強(qiáng)、獲取創(chuàng)傷小、無供區(qū)繼發(fā)組織缺損、可重復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)，這使得BMSCs成為目前最有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞[21]。但BMSCs在皮下微環(huán)境中的血管化、骨化問題仍是限制其進(jìn)一步應(yīng)用的重要瓶頸[22]。利用軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)技術(shù)可有效防止BMSCs皮下環(huán)境的骨化現(xiàn)象，但這一方法還需獲取患者的軟骨組織，同樣會(huì)造成繼發(fā)組織缺損，因此，共培養(yǎng)技術(shù)的臨床應(yīng)用意義并不大。此外，還有很多研究利用基因敲除、人工材料負(fù)載抗血管因子等方法來抑制BMSCs皮下骨化[22]，但這些試驗(yàn)僅在動(dòng)物體內(nèi)獲得了成功，其人體內(nèi)的安全性、有效性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2支架材料 支架材料是細(xì)胞賴以生存的載體，同時(shí)也是細(xì)胞表型得以維持的重要保障。目前應(yīng)用于組織工程耳郭軟骨再生的支架主要有天然生物材料、人工合成材料及復(fù)合材料三種類型。常用的天然生物材料有藻酸鹽、殼聚糖、膠原、脫細(xì)胞基質(zhì)材料及透明質(zhì)酸等[23，24]。這些材料無明顯的細(xì)胞毒性，生物相容性好，植入體內(nèi)后無明顯炎癥反應(yīng)或僅引起輕微的炎癥反應(yīng)，因此，軟骨細(xì)胞與之復(fù)合植入體內(nèi)后軟骨再生較為穩(wěn)定。然而，這些材料力學(xué)性能較差、體外可塑性差、體內(nèi)降解快、形態(tài)維持困難[8]，因此，在耳郭軟骨再生中的應(yīng)用受到了很大限制。很多研究者嘗試通過交聯(lián)技術(shù)、光敏技術(shù)、溫敏技術(shù)、凍干技術(shù)等來提高膠原材料的可塑性及力學(xué)強(qiáng)度[23,25]，經(jīng)過這些改進(jìn)，材料的性能確實(shí)獲得了較大提高，但要想獲得足夠抵抗耳再造術(shù)后的皮膚張力，且其降解速率與軟骨再生的速度相匹配的理想材料，材料學(xué)家們?nèi)孕枧Α?/p>

除天然材料外，人工合成材料，如：多孔聚乙烯(Medpor)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，在耳郭組織工程中都是較常用的材料。這些合成材料不僅來源廣、易于獲取，更重要的是具有可塑性強(qiáng)、可精確控制形態(tài)、力學(xué)性能好、植入體內(nèi)后形態(tài)維持良好等優(yōu)勢(shì)[8]；人工合成材料的這些特點(diǎn)非常適合作為耳郭形態(tài)軟骨構(gòu)建的支架材料。同樣，這些材料也有不足之處，最大的缺點(diǎn)是組織相容性較差，植入體內(nèi)后材料本身及其降解產(chǎn)物，會(huì)激發(fā)機(jī)體的異物炎癥反應(yīng)從而干擾軟骨的體內(nèi)再生[8]。此外，材料缺乏柔韌可屈曲的生理特性、材料外露、感染等問題也是限制這些材料進(jìn)一步應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此，如何增加人工合成材料的組織相容性仍是面臨的挑戰(zhàn)。

為克服上述天然材料和人工合成材料各自的不足，取長補(bǔ)短，近年來復(fù)合材料已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)[26]。研究者們嘗試了以不同方式(物理或化學(xué)方法)將兩種或者兩種以上的天然材料和人工合成材料進(jìn)行復(fù)合，從而獲得組織相容性較好、形態(tài)可控、力學(xué)性能合適的復(fù)合材料，如：絲蛋白-藻酸鹽三維多孔耳郭支架、膠原/PLA、殼聚糖/PLA和膠原/殼聚糖/PLA等[8]。這些研究成果為軟骨再生提供了更多的材料選擇空間，但這些支架材料在人體內(nèi)的安全性及有效性仍未充分證實(shí)。因此，要實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化仍有待驗(yàn)證，性能更優(yōu)的材料仍有待開發(fā)。

2.3培養(yǎng)體系 組織工程軟骨的再生過程就如同植物生長一樣，除了要有良好的種子(種子細(xì)胞)、合適的土壤(支架)，還要有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)(細(xì)胞因子等)才能枝葉繁茂。目前在耳郭軟骨組織工程中，細(xì)胞的擴(kuò)增和表型維持、軟骨的再生和成熟都依賴細(xì)胞因子的作用，聯(lián)合應(yīng)用多種生長因子重分化誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞或定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨仍是軟骨再生的主流技術(shù)。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等是當(dāng)前軟骨再生體系中最常用的細(xì)胞因子[27，28]，但對(duì)這些細(xì)胞因子的認(rèn)知，大部分是來源于其在間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向分化的作用。因此，這些細(xì)胞因子在天然軟骨細(xì)胞或者分化成熟的軟骨細(xì)胞中如何起作用，何時(shí)起作用、有無空間效應(yīng)，目前仍不明確，在此基礎(chǔ)之上建立的培養(yǎng)體系很難將組織工程軟骨培養(yǎng)到天然軟骨組織的成熟水平。此外，基因修飾技術(shù)(將軟骨生長因子基因通過載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞內(nèi)或者將攜帶軟骨生長因子的載體附著于生物支架上，使其能夠適時(shí)、穩(wěn)定、持續(xù)地表達(dá),從而促進(jìn)軟骨再生)也是改良軟骨再生體系的研究熱點(diǎn)[29,30]，但該技術(shù)的安全性及有效性仍未獲得充分證實(shí)。因此，如何找到理想的軟骨再生體系仍是耳郭軟骨組織工程面臨的重要難題。

3 展望

近年來，盡管耳郭軟骨組織工程獲得了諸多進(jìn)展，但大規(guī)模的臨床應(yīng)用仍未獲得突破，主要原因在于還有很多技術(shù)瓶頸待突破，很多科學(xué)問題仍待解決。軟骨細(xì)胞及BMSCs仍是未來耳郭軟骨組織工程的首選種子細(xì)胞，因此，找到影響軟骨細(xì)胞去分化的關(guān)鍵分子機(jī)制、明確BMSCs皮下環(huán)境骨化的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制可能是解決種子細(xì)胞問題的重要途徑。在支架材料方面，由于天然材料和人工材料都有無法克服的局限性，因此，復(fù)合材料的研發(fā)和應(yīng)用可能是獲得理想支架材料的重要途徑。此外，在軟骨組織構(gòu)建的過程中，結(jié)合應(yīng)用3D打印技術(shù)，不僅能精確控制形態(tài)，還有助于細(xì)胞與材料的相互作用、簡化材料的制備工藝，從而獲得更理想的軟骨再生效果。最后，通過研究天然耳軟骨細(xì)胞的生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制，或者先天性外中耳畸形的發(fā)病機(jī)制，可能是優(yōu)化軟骨再生體系、提高構(gòu)建軟骨的質(zhì)量及功能的重要切入點(diǎn)。組織工程學(xué)是一門交叉學(xué)科，只有多學(xué)科共同發(fā)展、互相促進(jìn)才能加快軟骨組織工程耳再造技術(shù)的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化進(jìn)程。