周 州，羅 舒，宋 怡，歐亞龍，許曉燕

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

銀耳（Tremella fuciformis） 是一種藥用價(jià)值極高的食藥兼用真菌，既是天然功能食品，又是食品加工中的天然添加劑[1]，有“菌中之冠”的美稱。銀耳多糖是重要的生物活性物質(zhì)，可以通過激活免疫細(xì)胞來提高機(jī)體的免疫功能，使吞噬細(xì)胞吞噬能力提升，增加淋巴細(xì)胞活性從而提高其抗腫瘤、預(yù)防腸道疾病等功效[2]。銀耳倍受消費(fèi)者喜愛，因而近年來以銀耳為原料研制的食品推陳出新，如銀耳保健醋、銀耳姜汁乳飲料、銀耳餅干等[3-5]。

枸杞是眾所周知的進(jìn)補(bǔ)中藥材，相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)走入千家萬戶，受到消費(fèi)者青睞。枸杞多糖是枸杞的主要生物活性成分，被證實(shí)具有保護(hù)生殖系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、抗輻射及抗缺氧等功效[6]。郭華等[7]研究表明，枸杞多糖具有增進(jìn)紫杉醇對人卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞的抗癌能力。

《本草綱目》記載蘆根有清熱生津、除煩、止嘔、利尿的功效?，F(xiàn)代的研究表明，蘆根中含有VB1、VB2、VC以及蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、天冬酰胺等多種營養(yǎng)物質(zhì)[8]，同時(shí)蘆根多糖具有抗氧化、抗結(jié)石、改善脂質(zhì)代謝、保護(hù)肝臟腎臟等多種作用[9]。自古至今，民間常有蘆根綠豆飲、蘆根飲等自制保健飲品。

基于具有減緩女性卵巢早衰功能的臨床試驗(yàn)組方，以組方中的主要原料銀耳、枸杞、蘆根為研究對象，制備了一種固體飲料，產(chǎn)品命名為卵復(fù)春。通過介紹該固體飲料制備工藝過程和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，提供最佳提取工藝、濃縮方式、顆粒性質(zhì)及穩(wěn)定性結(jié)果，以期為相關(guān)功能食品的研究與生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳、枸杞、蘆根等中藥材，購自四川千方中藥飲片有限公司；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，批號為PS010303，購自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2860s紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公；DZF-6020真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52AA/52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JOYA-8000T噴霧干燥機(jī)，上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司；KXH-101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠；AL104電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；YP1201N電子稱，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHH-250SD藥品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱，上海建恒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖測定方法

參考《中國藥典》第一部（2015版）中硫酸蒽酮法進(jìn)行測定[10]。

1.3.2 提取工藝

1） 單因素試驗(yàn)

浸泡時(shí)間：稱定銀耳等藥材共66 g，加水660 mL，分別浸泡0、30 min、60 min、90 min后回流提取60 min，共2次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至2 000 mL，測定總多糖含量。

料液比：稱定銀耳等藥材共66 g，分別按料液比 1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 加水，浸泡 60 min后回流提取60 min，共2次。過濾，合并濾液，濃縮，定容2 000 mL測定總多糖含量。

提取時(shí)間：稱定銀耳等藥材共66 g，加水660 mL，浸泡60 min后，按30 min、60 min、90 min、120 min回流提取，共2次，過濾，合并濾液，濃縮，定容至2 000 mL，測定總多糖含量。

提取次數(shù)：稱定銀耳等藥材共66 g，加水660 mL，浸泡60 min后回流提取60 min，分別提取1次、2次、3次、4次。過濾，合并濾液，濃縮，定容至2 000 mL，測定總多糖含量。

2） 正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素，各設(shè)3個(gè)水平，按照L9（34）正交表安排試驗(yàn)，見表1。

表1 提取工藝因素水平Tab.1 Factors and levels of extraction technology

如表1所示水平因素進(jìn)行試驗(yàn)，以多糖和干膏得率為指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行綜合評價(jià)。

設(shè)定多糖含量權(quán)重為70%，干膏得率權(quán)重為30%，綜合評分（Z，%） 計(jì)算公式為：

式中：X為多糖含量（mg·g-1）；Y為干膏得率（%）。

1.3.3 除雜工藝

產(chǎn)品形式為方便食品，因此提取液僅需除去固體微粒。蘆根、銀耳、枸杞等藥材采用水提法，有較多的雜質(zhì)，因此采用高速離心法（16 000 r·min-1離心15 min）除去水提取液中的固體微粒體系。

1.3.4 濃縮工藝

藥材提取液需要進(jìn)一步濃縮成一定相對密度的浸膏。采用減壓濃縮的方法，將提取液在濃縮溫度70℃～80℃、真空度0.08 MPa～0.1 MPa的條件下進(jìn)一步濃縮，制成一定相對密度1.08～1.10（60℃） 的浸膏[11-12]。

1.3.5 干燥工藝

藥材浸膏采用中藥常用的噴霧干燥方法[13]繼續(xù)加工。該方法浸膏粘壁損失少、顆粒干燥。確定噴霧干燥工藝為：控制進(jìn)料溫度50℃～60℃，料液密度1.08?1.10（60℃），進(jìn)風(fēng)溫度為185℃?195℃，出風(fēng)溫度為95℃?105℃。

1.3.6 制粒

采用濕法制粒。加入47.4%麥芽糊精作為填充劑，以70%乙醇制備軟材，20目篩制粒，60℃干燥至水分<4%，16目篩整粒。

1.3.7 臨界相對濕度測定

分別取濕法制粒所得顆粒14份，每份約0.5 g，置于已干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定。將14份樣品分為7組，每組各2份，分別為樣品1和樣品2。將稱量瓶蓋揭開，將7組樣品分別置于7種不同相對濕度的干燥器中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中放置72 h。取出稱量瓶，加蓋后精密稱定，計(jì)算吸濕百分率，繪制相對濕度曲線圖。

吸濕百分率（H，%）計(jì)算公式為：

式中：W1表示吸濕前樣品重量（mg）；W2表示吸濕后樣品重量（mg）。

1.3.8 顆粒流動(dòng)性

采用測定休止角的方法考察顆粒流動(dòng)性。具體方法為固定漏斗法：將3只漏斗豎直串連并固定于水平放置的坐標(biāo)紙上方，測量漏斗口距坐標(biāo)紙的距離；小心地將制成的顆粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中，直到坐標(biāo)紙上形成的顆粒圓錐體尖端接觸到漏斗口為止。由坐標(biāo)紙讀出圓錐底部的直徑（D），重復(fù)測定5次，休止角（tgα，°）計(jì)算公式為：

式中：H指漏斗口距坐標(biāo)紙的距離（cm）；D為圓錐底部直徑（cm）。

1.3.9 包裝

本品顆粒具有一定的吸濕性，采用鋁塑復(fù)合袋進(jìn)行包裝。

1.3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1） 加速試驗(yàn)

將中試產(chǎn)品置于加速條件，即溫度（40±2）℃、相對濕度（75±2）%條件下放置6個(gè)月，每月取樣檢查。

2） 長期試驗(yàn)

將中試產(chǎn)品，置于室溫條件下放置18個(gè)月，每月取樣檢查。

3） 感官評價(jià)法

取適量中試產(chǎn)品置于白色瓷盤中，在自然光下觀察色澤和狀態(tài)，嗅其氣味；用溫開水漱口后品其滋味。

4）水分及重金屬測定方法

水分測定按照GB 5009.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定[14]的方法進(jìn)行；重金屬鉛、砷、汞的測定分別按照GB/T 5009.11食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定[15]、GB 5009.12食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測定[16]和GB/T 5009.17食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測定[17]的方法進(jìn)行。

5） 微生物測定

分別按照GB 4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定[18]、GB 4789.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)[19]、GB 4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)[20]、GB 4789.10食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)[21]和GB 4789.15食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)[22]進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

得到的總多糖含量以每克生藥含量計(jì)，單因素試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

表2 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experiment results of extraction technology

由表2可知，浸泡時(shí)間為60 min時(shí)，總多糖得率最高；料液比為1∶10時(shí)，總多糖含量最高；提取90 min時(shí)，總多糖含量最高；隨著提取次數(shù)的增加，總多糖含量逐漸增大。

2.1.2 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal test results of extraction technology

如表3所示，影響蘆根等藥材提取的因素順序?yàn)椋篈>C>B，3種因素的影響在方差上顯著意義不大，通過直觀分析可知以A3B1C2組合最佳。因B的影響差異較小，故驗(yàn)證試驗(yàn)采用A3B1C2和A3B1C3進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Verification of experimental results

如表4結(jié)果顯示，驗(yàn)證試驗(yàn)中A3B1C2組合最優(yōu)。綜合正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，表明組合A3B1C2為最佳組合。

2.2 臨界相對濕度的測定結(jié)果

臨界相對濕度分析結(jié)果見表5，臨界相對濕度曲線見圖1。

表5 各種相對濕度條件下顆粒吸濕結(jié)果Tab.5 Moisture absorption results of particles under various relative humidity conditions

圖1 臨界相對濕度曲線圖Fig.1 Critical relative humidity curve

由表5可知，隨著相對濕度的提高，顆粒吸濕百分率有逐漸增大的趨勢。由圖1可知，本品顆粒的臨界相對濕度為64.3%。因此推測本品在生產(chǎn)過程中，當(dāng)室溫為25℃時(shí)，要求生產(chǎn)車間（包括制粒車間和分裝車間）的相對濕度應(yīng)控制在60%以下。

2.3 顆粒流動(dòng)性結(jié)果

試驗(yàn)得出3個(gè)樣品的休止角分別為35.68°、35.72°、35.89°，平均值為35.76°。本品顆粒休止角小于40°，說明流動(dòng)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

恒溫恒濕加速試驗(yàn)結(jié)果見表6，長期試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表6 恒溫恒濕加速試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Constant temperature and humidity accelerated test results

表7 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Long-term stability test results

由表6、表7可以看出，制得的成品在加速期（起始時(shí)間、1個(gè)月后、2個(gè)月后、3個(gè)月后、6個(gè)月后）和長期（起始時(shí)間、1個(gè)月后、2個(gè)月后、3個(gè)月后、6個(gè)月后、9月個(gè)月后、12月個(gè)月后、18月個(gè)月后）的感官均良好，水分隨著時(shí)間增加略有增長，但是均符合GB 5009.3國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。測試期內(nèi)，成品重金屬含量變化趨勢一致，總砷含量為0.01 mg·kg-1，鉛含量為 0.1 mg·kg-1，總汞含量為00.1 mg·kg-1。微生物限量變化趨勢一致，菌落總數(shù)含量<1×10 CFU·g-1、霉菌<1×10 CFU·g-1、大腸桿菌<1×10 CFU·g-1，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均未檢出。

3 結(jié)論

通過對蘆根、銀耳、枸杞等藥材的提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，對成品顆粒的臨界相對濕度和流動(dòng)性以及穩(wěn)定性進(jìn)行考察，獲得了卵復(fù)春固體飲料制備方法。

試驗(yàn)表明，以粗多糖為指標(biāo)的藥材組合最佳提取工藝條件為：料液比1∶15、提取時(shí)間60 min、提取4次。該制備方法制得的卵復(fù)春固體飲料顆粒臨界相對濕度為64.3%（25℃），顆粒休止角<40°，且穩(wěn)定性良好，能夠?yàn)橥愃幨惩词称烽_發(fā)提供工藝參考。