張佩，王成，楊軍

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院手外科，廣東 珠海 519100)

肌腱是骨骼與肌肉之間力量傳遞的重要組織，常應(yīng)對較大的力量負(fù)荷，在活動過程中易造成急性損傷，因此在臨床工作中肌腱損傷十分常見。肌腱移植在外科重建和修復(fù)治療中的應(yīng)用十分廣泛，肌腱移植材料需求量也日益增加。目前的肌腱移植材料主要包括自體肌腱、異體肌腱、人工肌腱和組織工程肌腱等，其中同種異體肌腱因來源豐富、供區(qū)并發(fā)癥少等優(yōu)點在臨床及科研工作中應(yīng)用廣泛[1]。移植成功率的提高取決于細(xì)胞活性、生物力學(xué)及免疫原性等方面。深低溫保存是同種異體肌腱常見的處理方法之一，低溫下能夠?qū)?xì)胞進行加工儲存，保證細(xì)胞和組織機構(gòu)及功能的完整性。但低溫冷凍在一定程度上會破壞細(xì)胞，嚴(yán)重的細(xì)胞應(yīng)激還可導(dǎo)致不可逆的損傷，通過添加保護劑可以實現(xiàn)有效的緩沖，降低溶液的冰點，避免細(xì)胞暴露于有害濃度下，而且保護劑還可穿透細(xì)胞膜保護細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)[2]。同時，在解凍和復(fù)溫時，還需要考慮細(xì)胞濃度、冷凍保護劑的選擇和濃度以及解凍速率等。在冷凍保存前和冷凍保存后均需評估細(xì)胞的活力和功能，以便進一步優(yōu)化冷凍保存過程[3]。為實現(xiàn)最佳移植效果，需進一步提高對低溫生物學(xué)的認(rèn)識。現(xiàn)就深低溫保存同種異體肌腱的基礎(chǔ)研究進展予以綜述。

1 深低溫保存定義

深低溫(深低溫冰箱-70～-80 ℃,液氮-196 ℃)保存是保持肌腱固有特性的良好儲存手段。低溫可以抑制正常機體組織細(xì)胞代謝活動，使其不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)過程，理論上，在此溫度下的所有生物活動均會停止，包括一些導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生物化學(xué)活動，深低溫保存肌腱可為臨床提供具有細(xì)胞活性和彈性良好的供體，且深低溫保存同種異體肌腱移植效果與自體肌腱差異較小[4]。

深低溫保存包括普通程序降溫和玻璃化。普通程序降溫是逐步降溫，而玻璃化保存法是一種采用高濃度冷凍保護劑和單步快速降溫的技術(shù)，可使細(xì)胞內(nèi)外同時玻璃化，減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成造成的滲透性損害。玻璃化是一個動態(tài)過程，需要具有較特定閾值更快的冷卻、升溫速率，但這取決于所使用的玻璃化溶液的組成和總濃度。深低溫保存法不僅能夠有效消除肌腱免疫原性，還能很大程度地保留細(xì)胞活性，同時維持力學(xué)性能。

2 冷凍保護劑

常規(guī)的冷卻方案在低溫保存過程中可形成冰晶并增加溶質(zhì)濃度，溶質(zhì)濃度升高引起的損害可以通過使用冷凍保護劑來減輕。冷凍保護劑可與細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)合，防止冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，減輕快速結(jié)冰帶來的不可逆性細(xì)胞損害，同時還可避免細(xì)胞脫水引起滲透性增高造成的破壞作用。Sass等[5]用常見的冷凍保護劑二甲基亞砜和甘油低溫保存肌腱，并比較天然肌腱和低溫保存肌腱的生存活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低溫保存和解凍處理后，肌腱成纖維細(xì)胞的增殖能力并未發(fā)生顯著變化。Hochstrat等[6]研究發(fā)現(xiàn)，使用二甲基亞砜低溫保存肌腱組織可保持細(xì)胞活力，而在0.9%氯化鈉溶液中保存的肌腱則無殘留的代謝活性，在冷凍過程中細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)被完全破壞。李雯瑛[7]將外周血造血干細(xì)胞深低溫保存于二甲基亞砜和羥乙基淀粉保護劑中，細(xì)胞存活率高，且回收后外周血造血干細(xì)胞在體內(nèi)能夠快速恢復(fù)活性。Isildar等[8]使用二甲基亞砜和10%1,2-丙二醇制備了兩種不同的冷凍保護液用于保存臍帶組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在冷凍保護劑中保存的臍帶組織的形態(tài)學(xué)和免疫表型與新鮮臍帶組織無顯著差異，同時可分離相似的間充質(zhì)干細(xì)胞，且從10% 1,2-丙二醇冷凍保護液中分離的細(xì)胞的增殖速率較新鮮組織分離的細(xì)胞低，但均可觀察到成骨和成脂分化。由此可知，加入冷凍保護劑的深低溫保存細(xì)胞的增殖分化能力良好，與新鮮組織細(xì)胞的增殖分化能力的差異較小。同時，冷凍保護劑種類、濃度及配比也會影響保存效果，實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)組織及細(xì)胞的特性選擇合適的冷凍保護劑。

3 深低溫保存對同種異體肌腱細(xì)胞活力的影響

3.1肌腱細(xì)胞 傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，肌腱僅由肌腱細(xì)胞(即肌腱的固有細(xì)胞)組成，經(jīng)深低溫處理后，細(xì)胞受損并失去活性，僅發(fā)揮生長支架的作用；隨后對自體肌腱愈合機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，肌腱細(xì)胞主動參與內(nèi)在性愈合過程[9]。由于肌腱細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞液含量少，深低溫保存時冰晶形成少，因此對細(xì)胞器及細(xì)胞膜的損傷也較小。孫燕琨等[10]研究表明，與新鮮對照肌腱相比，經(jīng)深低溫保存的肌腱活細(xì)胞的數(shù)量有所減少，但形態(tài)相似，同時可分裂、增殖并合成膠原纖維。另有研究表明，冷凍解凍后的肌腱細(xì)胞數(shù)量與新鮮肌腱相近，同時細(xì)胞水腫、成纖維細(xì)胞增殖等過程也與新鮮肌腱相似[11-12]。楊宇升等[13]研究表明，同種異體肌腱經(jīng)深低溫保存后早期組織學(xué)愈合過程較自體肌腱延遲，但24周后愈合程度與新鮮肌腱基本相同。由此可知，經(jīng)深低溫保存后，肌腱細(xì)胞的活性和數(shù)量均受到一定損傷，但仍能生長、增殖并參與愈合過程。

3.2肌腱干細(xì)胞 肌腱由纖維膠原束平行排列組成，組織內(nèi)血供少，組成的成纖維細(xì)胞為成體細(xì)胞，代謝較低且自我修復(fù)過程緩慢，增殖分化能力也十分有限。與成纖維細(xì)胞相比，肌腱干細(xì)胞具有獨特的優(yōu)勢[14]。肌腱干細(xì)胞是一種新型細(xì)胞，已成功地從人類、小鼠和新西蘭兔肌腱及韌帶組織中分離出來[15-16]。Zhang和Wang[17]研究表明，與肌腱細(xì)胞相比，肌腱干細(xì)胞具有不同的特性，包括細(xì)胞標(biāo)記表達、增殖和分化潛能以及細(xì)胞培養(yǎng)時的形態(tài)等方面的差異。體外的肌腱干細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞；體內(nèi)的肌腱干細(xì)胞可分化形成肌腱、軟骨及骨組織[18]。而肌腱細(xì)胞幾乎不存在分化潛能。還有研究發(fā)現(xiàn)，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，肌腱干細(xì)胞的增殖更快，可表達更多肌腱相關(guān)基因與蛋白，組織學(xué)也可較早觀察到膠原纖維束的規(guī)則排列，同時具有更豐富的細(xì)胞外基質(zhì)[19]。Ni等[20]研究表明，肌腱干細(xì)胞可表達更多的與肌腱分化相關(guān)的信使RNA，具有肌腱干細(xì)胞的纖維蛋白結(jié)構(gòu)較無肌腱干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)修復(fù)更早進行?？梢姡‰旄杉?xì)胞具有強大的增殖分化能力，在促進肌腱的修復(fù)和愈合過程中起關(guān)鍵作用。

深低溫處理會損傷肌腱干細(xì)胞，并對其功能產(chǎn)生一定影響。但Mitchell等[21]研究表明，深低溫保存肌腱干細(xì)胞與新鮮肌腱的活力、數(shù)量、形態(tài)、早期凋亡率、體外遷移能力以及分化能力無顯著差異，解凍后24 h的肌腱干細(xì)胞仍處于原代，而解凍72 h后的大部分肌腱干細(xì)胞處于第四代增殖。因此，肌腱干細(xì)胞在肌腱損傷修復(fù)過程中極其重要。肌腱干細(xì)胞具有與正常細(xì)胞相似的生長、增殖和代謝過程，能夠定向分化為肌腱細(xì)胞，分泌膠原纖維，維持完整的肌腱結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮正常的生理功能，進一步促進肌腱損傷的愈合[22]。

4 深低溫保存對同種異體肌腱生物力學(xué)性能的影響

肌腱的主要功能是力量傳遞，因此肌腱移植術(shù)后的抗拉強度和韌性是決定手術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一。目前暫未對深低溫保存中肌腱的生物力學(xué)性能的損傷達成共識。有學(xué)者認(rèn)為，深低溫保存對肌腱生物力學(xué)性能無影響[12,23-24]。Lee和Elliott[25]研究表明，雖然冷凍可以改變肌腱的微觀結(jié)構(gòu)，但在肌束和纖維水平上，新鮮肌腱與冷凍肌腱的所有參數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明冷凍對肌腱力學(xué)無影響，不會引起相應(yīng)的機械或結(jié)構(gòu)變化。Chen等[26]認(rèn)為，新鮮冷凍的伸肌腱是伸肌機制重建的可行選擇，盡管同種異體肌腱的細(xì)胞活力偏低，但其生物力學(xué)性能顯著恢復(fù)。Negrín等[27]在重建內(nèi)側(cè)髕韌帶的生物力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，同種異體肌腱移植承受的最大拉伸力、剛度和伸長率等足以使其在體內(nèi)進行重建并發(fā)揮正常功能。然而，有部分研究認(rèn)為深低溫保存可導(dǎo)致肌腱的結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能發(fā)生顯著變化。如Giannini等[28]將22例深低溫處理的脛骨后肌腱與新鮮對照肌腱進行比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)深低溫處理肌腱的極限荷載、極限應(yīng)力以及極限應(yīng)變均較新鮮肌腱有所降低，對肌腱力學(xué)性能有一定影響。Lansdown等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保存過程中，冷凍溫度、冷凍介質(zhì)種類及濃度以及多次凍融循環(huán)，可以改變結(jié)構(gòu)特性，并導(dǎo)致不同的生物力學(xué)結(jié)果?？梢?，深低溫保存過程中多種因素會對力學(xué)性能產(chǎn)生影響。

4.1冷凍溫度 與常溫相比，低溫可通過抑制代謝和顯著延緩離體組織儲存過程中降解的生理過程來穩(wěn)定生物結(jié)構(gòu)。Hohmann等[30]研究表明，無論冷凍或解凍的溫度如何，冷凍后肌腱的機械性能均會發(fā)生一定變化，低溫保存后，肌腱彈性增大。Oswald等[31]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)液氮處理肌腱的蠕變應(yīng)變和初始破壞應(yīng)變均顯著提高，且最大應(yīng)變顯著降低。因此，在低溫保存前對肌腱進行快速冷凍可降低肌腱的負(fù)荷能力。與極低冷凍溫度下的低溫保存類似，經(jīng)液氮處理的肌腱損傷可能由迅速降溫的冷凍過程引起。因此，在同種異體肌腱移植的滅菌過程中，由于可能對肌腱性能產(chǎn)生負(fù)面影響，故不應(yīng)使用液氮處理。緩慢、溫和的凍存過程可減少冰晶形成，而冷凍溫度的影響可能與液體丟失、滲透性改變以及其他物理損傷相關(guān)。評估反復(fù)冷凍和解凍溫度的研究顯示，冷凍對肌腱性能無影響[32]。

4.2冷凍介質(zhì) 在目前的冷凍保存方法中，0 ℃以下組織及器官結(jié)構(gòu)不受控制的冰晶形成是唯一最關(guān)鍵的因素，嚴(yán)重限制了冷凍和解凍過程中的儲存效果。低溫保存通常置于磷酸鹽緩沖液中，不添加任何低溫保護劑[33]。Chen等[34]研究表明，等滲緩沖溶液保證了細(xì)胞處于流體狀態(tài)時的活力。冷凍可導(dǎo)致冰晶形成，破壞肌腱細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，使生物力學(xué)性能發(fā)生改變，而通過使用基于玻璃化的無冰冷凍保存技術(shù)可以較好地解決冰晶形成的問題。Hochstrat等[6]研究表明，二甲基亞砜對肌腱細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)具有積極作用，與磷酸鹽緩沖液中儲存的肌腱相比，二甲基亞砜儲存可以增強肌腱的生物力學(xué)特征；二甲基亞砜在冷凍過程中保持了肌腱細(xì)胞的活力，電鏡下，磷酸鹽緩沖液凍存肌腱的膠原纖維形態(tài)更不規(guī)則，而二甲基亞砜凍存的肌腱則保留了膠原結(jié)構(gòu)。肌腱組織中主要為Ⅰ型膠原，Ding等[35]證明，凍融使膠原蛋白溶液形成微孔結(jié)構(gòu)，孔隙主要被水填充，在凍結(jié)過程中，微孔結(jié)構(gòu)變得更小、更有規(guī)則，導(dǎo)致膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而使用二甲基亞砜作為保護劑可以減少膠原結(jié)構(gòu)變化。加入冷凍保護劑可以減少低溫帶來的冰晶損傷，使低溫保存肌腱的結(jié)構(gòu)與新鮮肌腱更接近，以維持正常的生物力學(xué)性能。

4.3凍融循環(huán) 新鮮冷凍是同種異體移植最常用的保存方法，與單次凍融循環(huán)相比，重復(fù)經(jīng)歷多個周期凍融對人肌腱的生物力學(xué)性能有一定影響。多次凍融循環(huán)會改變肌腱結(jié)構(gòu)特性，導(dǎo)致生物力學(xué)性能變化[29]。Suto等[36]研究表明，反復(fù)的凍融循環(huán)會降低骨和肌腱結(jié)構(gòu)中骨細(xì)胞的存活率，但不會影響肌腱的機械性能。Hochstrat等[6]表明，新鮮肌腱與冷凍一次的肌腱具有相似的動態(tài)楊氏模量。應(yīng)用兩個以上的凍融循環(huán)可能加劇肌腱組織的損傷，顯著降低其最大負(fù)荷[25]。黃洪杰等[37]研究證實，凍融周期應(yīng)少于3次，反復(fù)凍存復(fù)溫會加劇肌腱組織損傷，使其易發(fā)生斷裂。Chen等[34]研究表明，反復(fù)凍融可改變新西蘭兔跟腱的組織結(jié)構(gòu)，使跟腱的最大負(fù)荷、最大負(fù)荷能量和最大應(yīng)力等部分生物力學(xué)性能顯著降低。Arnout等[38]研究表明，3個周期內(nèi)的凍融循環(huán)對生物力學(xué)性能無影響。相比之下，多次凍融循環(huán)削弱了同種異體肌腱移植的生物力學(xué)性能，使移植物更容易疲勞，甚至斷裂[37]。

深低溫保存對肌腱生物力學(xué)的影響與多種因素有關(guān)，包括冷凍溫度、冷凍介質(zhì)、凍融循環(huán)以及凍存時間、個體差異等。深低溫在維持細(xì)胞代謝的同時也會對力學(xué)性能造成負(fù)面影響。針對不同個體及不同部位的移植要求，在保證功能的前提下盡可能多地保留肌腱力學(xué)特性。

5 深低溫保存對同種異體肌腱免疫原性的影響

雖然自體肌腱移植一般不會發(fā)生排斥反應(yīng)，但自體肌腱來源非常有限，無法滿足臨床需求。由于同種異體肌腱較豐富且不會導(dǎo)致新的創(chuàng)傷，近年來已成為研究熱點。如果不去除同種異體肌腱的免疫原性，移植后將發(fā)生嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致手術(shù)失敗，嚴(yán)重者甚至危及生命。因此，降低宿主與移植物的免疫排斥反應(yīng)是目前亟待解決的問題。

5.1免疫機制 肌腱主要由肌腱細(xì)胞、膠原纖維以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，其中肌腱細(xì)胞為抗原性的主要來源。未經(jīng)處理的異體肌腱移植后可出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞，引起毒性反應(yīng)，導(dǎo)致受體內(nèi)產(chǎn)生以細(xì)胞免疫為主的免疫排斥反應(yīng)。產(chǎn)生細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)的主要途徑有：①供體抗原呈遞細(xì)胞被受體T淋巴細(xì)胞直接識別；②受體T淋巴細(xì)胞識別肌腱細(xì)胞膜上被加工處理后的組織相容性復(fù)合物[39]。深低溫保存可改變肌腱細(xì)胞膜上的組織相容性抗原，從而降低異體肌腱的抗原性。有研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞主要通過細(xì)胞免疫和體液免疫的聯(lián)合作用參與機體免疫排斥反應(yīng)[40]，因此臨床可以通過CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的比值間接描述免疫排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

5.2免疫相關(guān)細(xì)胞及蛋白的表達 自體肌腱移植是肌腱損傷后功能恢復(fù)重建的重要治療手段。自體肌腱移植術(shù)后并發(fā)癥少，且無顯著不良反應(yīng)，但供體來源有限。而異體肌腱移植與組織或器官移植類似，受體會產(chǎn)生排斥反應(yīng)。張紅星等[41]采用玻璃化保存法凍存同種異體肌腱，并與空白對照組(未經(jīng)處理的同種異體肌腱)進行比較發(fā)現(xiàn)，玻璃化凍存同種異體肌腱移植后CD4、CD8、CD4/CD8均顯著減少，在一定程度上減弱了同種異體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，進一步提高了移植成功率。Chen等[42]證明，肌腱的化學(xué)萃取可以消除免疫原性，而且每次處理均可進一步降低免疫原性。宮妍婕等[43]使用液氮凍存心臟瓣膜發(fā)現(xiàn)，保護液對心肌組織結(jié)構(gòu)及其蛋白成分均具有更好的保護作用，且反映移植后排斥反應(yīng)程度的人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體分子的表達水平最低，表明深低溫保存、化學(xué)處理、添加保護劑等均在降低同種異體肌腱免疫原性中起到不同程度的協(xié)同作用，繼而使同種異體肌腱免疫原性顯著降低，但各種方法聯(lián)合處理時存在多種變量，為進一步研究帶來挑戰(zhàn)。

5.3移植與隨訪 同種異體肌腱體外保存的目的是為臨床移植提供良好的受體，改善肌腱功能，提高患者生活質(zhì)量。體內(nèi)移植與隨訪的結(jié)果可更加直觀地判斷療效和預(yù)后。涂澤松等[44]的試驗顯示，與自體肌腱重建前交叉韌帶相比，同種異體肌腱移植的臨床效果相似，但免疫排斥反應(yīng)率低且安全，臨床可根據(jù)病情及患者意愿靈活選擇。另有研究指出，自體肌腱移植效果優(yōu)于深低溫保存的同種異體肌腱移植，如Fawzi-Grancher等[45]研究表明，與新鮮肌腱相比，凍干處理的骨骼和肌腱未見顯著的細(xì)胞毒性；與植入后2周的新鮮冷凍肌腱相比，凍干處理的輻照肌腱的CD3、CD68浸潤顯著減少；且在新鮮冷凍/凍干輻照處理兩個肌腱組織中均未觀察到巨噬細(xì)胞浸潤的顯著差異。由此認(rèn)為，冷凍干燥聯(lián)合輻照等其他物理化學(xué)方法可能對降低免疫原性起到疊加作用。鄧亞開等[46]對自體-異體混編肌腱與深低溫保存同種異體肌腱重建兔前交叉韌帶進行比較發(fā)現(xiàn)，自體-異體混編肌腱組CD31免疫組織化學(xué)染色血管計數(shù)及蘇木精-伊紅染色細(xì)胞計數(shù)在術(shù)后3、8、12周均高于深低溫保存同種異體肌腱組，達到一定峰值后，自體-異體混編肌腱組與深低溫保存同種異體肌腱組的差異逐漸減小。深低溫保存同種異體肌腱免疫排斥反應(yīng)雖較自體肌腱多見，但在較長時間的術(shù)后隨訪中趨于穩(wěn)定并愈合良好。

6 小 結(jié)

深低溫保存同種異體肌腱能夠維持細(xì)胞和組織活性以及良好的生物力學(xué)性能，且可有效去除免疫原性，減少排斥反應(yīng)的發(fā)生，是目前臨床和科研工作中最常用的保存方法。但深低溫保存同種異體肌腱還應(yīng)考慮成本、時間、機械強度變化以及疾病傳播的風(fēng)險，可根據(jù)患者的年齡、活動水平、活動類型、并發(fā)癥以及患者的需求等多種因素制訂不同的保存方案[47]。深低溫保存過程中相關(guān)的因素眾多，與降溫速度、冷凍保護劑的配比及濃度等均有較大關(guān)系。同時，冷凍保護劑存在細(xì)胞毒性，如何控制其毒性達到最佳保護效果，臨床需進一步研究探索。未來仍應(yīng)支持深低溫保存在同種異體肌腱移植中的應(yīng)用，以提高成功率。