機(jī)械性痛覺超敏 (mechanical allodynia) 反應(yīng)是一種常見的慢性疼痛狀態(tài)，即非疼痛機(jī)械刺激在損傷后可引起疼痛反應(yīng)。研究顯示，脊髓背角是外周感覺信號整合的主要部位，也是導(dǎo)致機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)的神經(jīng)環(huán)路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵部位。脊髓背角中傳遞機(jī)械性痛覺超敏信號的興奮性神經(jīng)元主要包括生長抑素陽性神經(jīng)元以及表達(dá)鈣結(jié)合蛋白 (CR)與蛋白激酶Cγ (PKCγ) 的神經(jīng)元。敲除上述興奮性神經(jīng)元可導(dǎo)致炎性損傷與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的靜態(tài)與動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)形成缺陷。PKCγ陽性神經(jīng)元主要分布于脊髓背角II/III層交界，少數(shù)分布于I層和III層，被認(rèn)為是損傷后允許低閾值機(jī)械感受信號傳入的“閘門”。最新研究顯示，分布于脊髓背角II-IV層的膽囊收縮素(CCK)陽性神經(jīng)元也是低閾值機(jī)械感受器，與PKCγ陽性神經(jīng)元高度重合，且在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外，分布于脊髓背角II-IV層的瞬時囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(tVGLUT3) 陽性神經(jīng)元以及分布于II層的CR陽性神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中同樣發(fā)揮重要的作用。本文作者通過藥理學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)方法研究了上述神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中的作用，并探討上述神經(jīng)元的激活是否因損傷性質(zhì)而異。

首先，本文作者對分布于脊髓背角II層的CR陽性神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)合前期研究結(jié)果，CR陽性神經(jīng)元能夠響應(yīng)角叉菜膠炎性痛模型中的低閾值機(jī)械刺激引起c-Fos（一個公認(rèn)的疼痛通路激活標(biāo)志物）顯著上調(diào)，而在坐骨神經(jīng)分支損傷 (SNI) 模型中響應(yīng)較少，作者提出假說：CR陽性神經(jīng)元主要傳遞炎性損傷而非神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏信號。為驗(yàn)證這一假說，作者首先通過脊髓注射腺相關(guān)病毒8 (AAV8) 標(biāo)記CR陽性神經(jīng)元以研究其特異性表征。結(jié)果顯示，脊髓背角II層的CR陽性神經(jīng)元與速激肽1 (Tac1)、速激肽2 (Tac2)、胃泌素相關(guān)肽 (Grp) 陽性神經(jīng)元的共表達(dá)比例分別為52%、21%、11%，而與PKCγ陽性神經(jīng)元無共表達(dá)。電生理實(shí)驗(yàn)表明，CR陽性神經(jīng)元中，91%呈現(xiàn)延遲(Delayed)放電模式，9%呈現(xiàn)強(qiáng)直 (Tonic) 放電模式，且100%接收C纖維傳入信號，80%接收Aδ纖維傳入信號，但不接收Aβ纖維傳入信號。CR陽性神經(jīng)元樹突形態(tài)豐富，包括放射狀、垂直狀以及未知類型，有趣的是，CR陽性神經(jīng)元沿背腹方向明顯拉長呈樹枝狀，提示其突觸連接可能延伸至脊髓背角II層以外。

隨后采用化學(xué)遺傳學(xué)方法，通過脊髓背角注射AAV8將抑制性受體PSAM-GlyR導(dǎo)入CRcre小鼠，給予PSAM-GlyR的配體PSEM89S能夠急性抑制CR神經(jīng)元的活性。為驗(yàn)證CR神經(jīng)元是否為炎性損傷或神經(jīng)損傷誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺超敏所必需，作者建立了多種炎性痛與神經(jīng)痛模型。在角叉菜膠炎性痛模型中，vonFrey縮爪閾值（靜態(tài)疼痛敏化）顯著降低，棉簽擦拭反應(yīng)性（ 動態(tài)疼痛敏化）明顯增加，注射PSEM89S抑制CR神經(jīng)元活性后，vonFrey縮爪閾值顯著上調(diào)，而棉簽擦拭反應(yīng)性無改變。腳掌注射完全弗氏佐劑(CFA)炎性痛模型中，注射PSEM89S能夠完全逆轉(zhuǎn)靜態(tài)與動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏狀態(tài)。而在SNI神經(jīng)損傷模型中，注射PSEM89S對靜態(tài)與動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏狀態(tài)均無影響。Brennan切口術(shù)后炎性痛模型中，注射PSEM89S能夠完全逆轉(zhuǎn)靜態(tài)與動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏狀態(tài)。此外，本文作者還通過皮內(nèi)注射辣椒素（激活TRPV1）或芥子油（激活TRPA1）建立繼發(fā)性機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)模型。令人驚訝的是，注射PSEM89S能夠逆轉(zhuǎn)芥子油而非辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏，因?yàn)槔苯匪啬Ｐ捅徽J(rèn)為是一種神經(jīng)源性炎性痛模型。隨后研究發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射芥子油能夠誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)釋放，而與溶劑組相比，注射辣椒素對炎性介質(zhì)釋放無影響。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CR陽性神經(jīng)元主要傳遞炎性損傷而非神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏信號，且辣椒素誘導(dǎo)的繼發(fā)性機(jī)械痛覺超敏屬于非CR神經(jīng)元依賴型。

接下來，對PKCγ陽性神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中的作用進(jìn)行了探討。本文作者前期研究發(fā)現(xiàn)，PKCγ陽性神經(jīng)元響應(yīng)SNI神經(jīng)損傷模型而非角叉菜膠炎性痛模型誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏，從而促進(jìn)c-Fos表達(dá)，提示PKCγ陽性神經(jīng)元可能傳遞神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏。為了驗(yàn)證這一推論，首先通過在PKCγ起始密碼子插入膜結(jié)合GFP (mGFP) 標(biāo)記PKCγ陽性神經(jīng)元以研究其特異性表征。結(jié)果顯示，PKCγ陽性神經(jīng)元放電模式較CR神經(jīng)元更豐富，包括強(qiáng)直型 (Tonic,35.7%)，相位型 (Phasic, 28.6%)，延遲型 (Delayed,28.6%)和間歇型 (Gap, 7.1%)。此外，PKCγ陽性神經(jīng)元能夠接收Aδ、Aβ與C纖維傳入信號，其中絕大多數(shù)傳入信號來自于Aδ纖維。PKCγ陽性神經(jīng)元形態(tài)主要呈中央和放射狀，少數(shù)呈現(xiàn)垂直狀。

本文作者采用PKCγ KO小鼠或鞘內(nèi)注射PKCγ選擇性抑制劑tat-gV5-3抑制PKCγ的活性，研究了PKCγ在炎性損傷或神經(jīng)損傷誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺超敏中的作用。結(jié)果顯示，PKCγ KO或鞘內(nèi)注射tat-gV5-3對角叉菜膠、CFA炎性痛模型，Brennan切口術(shù)后炎性痛模型，芥子油繼發(fā)性痛覺超敏模型誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)均無影響。然而，PKCγ KO或鞘內(nèi)注射tat-gV5-3均能緩解SNI模型誘導(dǎo)的疼痛超敏反應(yīng)。此外，鞘內(nèi)注射tat-gV5-3還能緩解辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)。提示PKCγ本身是神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)機(jī)械性疼痛異常信號傳遞所必需。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PKCγ神經(jīng)元的作用，本文作者通過脊髓背角注射PSAM-GlyR導(dǎo)入PKCγcreERT2小鼠，給予PSAM-GlyR的配體PSEM89S能夠急性抑制PKCγ神經(jīng)元的活性。結(jié)果顯示，CFA炎性痛模型中，注射PSEM89S對vonFrey縮爪閾值及棉簽擦拭反應(yīng)性均無影響。SNI神經(jīng)損傷模型中，注射PSEM89S后vonFrey縮爪閾值顯著增加，棉簽擦拭反應(yīng)性明顯降低。此外，注射PSEM89S還能部分緩解辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)。上述結(jié)果首次證明除了PKCγ本身，PKCγ陽性神經(jīng)元對傳遞神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏信號同樣具有重要的作用。

接著，研究了脊髓背角深層神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中的作用。CCK神經(jīng)元遍布整個脊髓背角，主要集中在II-IV層。通過脊髓注射AAV8標(biāo)記CCK陽性神經(jīng)元以研究其特異性表征，結(jié)果顯示，標(biāo)記神經(jīng)元主要分布于脊髓背角深層(III-IV層)，且與CR或PKCγ陽性神經(jīng)元均無共表達(dá)，其放電模式包括相位型 (Phasic, 67%) 與強(qiáng)直型 (Tonic,33%)，神經(jīng)元軸突主要向背腹方向延伸。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CCK神經(jīng)元的作用，作者通過脊髓背角注射PSAM-GlyR導(dǎo)入CCKcre小鼠。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，注射PSEM89S能夠顯著緩解炎性痛模型（角叉菜膠與CFA模型）與神經(jīng)病理性疼痛模型（SNI模型）誘導(dǎo)的靜態(tài)及動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)，且可緩解角叉菜膠模型引起的熱痛超敏反應(yīng)，提示位于脊髓背角III-IV層的PKCγ-CCK神經(jīng)元能夠傳遞炎性損傷以及神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏信號。

最后，研究了tVGLUT3神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中的作用及其與CCK神經(jīng)元之間的關(guān)系。前期研究結(jié)果提示，tVGLUT3神經(jīng)元分布于脊髓背角II-IV層，敲除tVGLUT3神經(jīng)元后能夠顯著抑制動態(tài)而非靜態(tài)機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)。通過脊髓注射AAV8標(biāo)記tVGLUT3陽性神經(jīng)元，結(jié)果顯示標(biāo)記神經(jīng)元分布于III-IV層，且與CR或PKCγ陽性神經(jīng)元均無共表達(dá)。作者通過脊髓注射PSAM-GlyR導(dǎo)入tVGLUT3cre小鼠，注射PSEM89S能夠完全逆轉(zhuǎn)角叉菜膠及SNI模型誘導(dǎo)的機(jī)械性動態(tài)疼痛超敏反應(yīng)。為了進(jìn)一步研究tVGLUT3神經(jīng)元與CCK神經(jīng)元之間的關(guān)系，作者通過脊髓注射AAV8將EGFP導(dǎo)入tVGLUT3cre小鼠進(jìn)行標(biāo)記，10～14天后與探針標(biāo)記CCK及Maf, Cpne4, Trh（CCK神經(jīng)元根據(jù)基因表達(dá)可分為三類：Maf+, Cpne4+, Trh+神經(jīng)元）的小鼠進(jìn)行原位雜交，結(jié)果顯示大部分EGFP標(biāo)記的III-IV層tVGLUT3神經(jīng)元與CCK神經(jīng)元共表達(dá)(81%)，且共表達(dá)的CCK神經(jīng)元主要為Maf陽性CCK神經(jīng)元 (81%)，少數(shù)為Cpne4陽性CCK神經(jīng)元，但無Trh陽性CCK神經(jīng)元，提示傳遞神經(jīng)損傷與炎性損傷誘導(dǎo)的動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏信號的CCK神經(jīng)元主要由tVGLUT3神經(jīng)元組成。

綜上所述，雖然炎性損傷與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)相似，但脊髓背角神經(jīng)環(huán)路的激活卻因損傷性質(zhì)而異。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角興奮性神經(jīng)元對機(jī)械性痛覺超敏信號的傳遞至關(guān)重要，其中脊髓背角II層的CR神經(jīng)元主要傳遞由具有顯著炎癥指標(biāo)的炎性損傷引起的機(jī)械性痛覺超敏信號，PKCγ神經(jīng)元傳遞由神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏信號，且PKCγ激酶本身也參與該信號的傳遞，脊髓背角深層的CCK神經(jīng)元在傳遞炎性損傷及神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏信號中發(fā)揮重要作用。研究還證明，位于III-IV層的Maf 陽性CCK神經(jīng)元由tVGLUT3神經(jīng)元組成，主要傳遞動態(tài)機(jī)械性痛覺超敏信號。

本研究證實(shí)了PKCγ神經(jīng)元在神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，該類神經(jīng)元的突起向脊髓背角腹側(cè)方向延伸，提示來自抑制性IIi層神經(jīng)元的感受信號能夠在脊髓背角深層神經(jīng)元整合以傳遞痛覺超敏信號。這一門控機(jī)制是否存在于炎性損傷誘導(dǎo)的痛覺超敏反應(yīng)中還需進(jìn)一步研究。本研究數(shù)據(jù)表明，脊髓背角深層神經(jīng)元對炎性損傷痛覺超敏神經(jīng)環(huán)路至關(guān)重要，這可能并不依賴于垂直細(xì)胞，因?yàn)镃R神經(jīng)元軸突同樣與I層的外周神經(jīng)元連接。根據(jù)損傷性質(zhì)研究機(jī)械性痛覺超敏神經(jīng)環(huán)路是未來的主要研究方向，對理解機(jī)械性痛覺超敏的形成機(jī)制以及尋找有效的治療方法具有重要的意義。