任會(huì)紅，張瑜娟，閔衛(wèi)平，

(南昌大學(xué)1.藥學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室；3.免疫與生物治療研究所；4.江西省免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的RNA分子，通過(guò)RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，使靶信使RNA進(jìn)行特異性沉默，從而實(shí)現(xiàn)基因治療的目的[1]。皮膚作為人體的最大器官，是siRNA最易到達(dá)的靶器官，臨床試驗(yàn)報(bào)告以細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 -4[2]和程序性細(xì)胞死亡-1[3]為靶點(diǎn)的siRNA抑制劑可用于皮膚黑色素瘤患者的臨床治療，為皮膚相關(guān)疾病的臨床治療提供了新的研究方向。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery systems，TDDs)是藥物透過(guò)皮膚，經(jīng)毛細(xì)血管吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)，產(chǎn)生局部或全身治療作用，實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療疾病的給藥途徑[4]。經(jīng)皮給藥作為新穎的給藥方式，具有局部靶向性好，患者依從性高，給藥可控可持續(xù)且無(wú)肝臟首關(guān)效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，使得siRNA經(jīng)皮給藥系統(tǒng)成為皮膚疾病治療研究的熱點(diǎn)[5]。然而，由于siRNA具有強(qiáng)親水性和電負(fù)性，易被核酸酶降解及難以突破皮膚角質(zhì)層屏障作用等缺陷，限制了其應(yīng)用。雖然皮內(nèi)注射為siRNA的應(yīng)用提供了有效的給藥途徑，然而由于劇烈的疼痛感、有限的給藥點(diǎn)和給藥次數(shù)，使其應(yīng)用仍受到極大的限制[6]。

近年來(lái)，納米粒(nanoparticles，NPs)由于具有合適的粒徑、良好的生物相容性、可控的藥物釋放性以及較低的細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，成為遞送siRNA經(jīng)皮給藥的有效載體[7]。筆者對(duì)納米載體攜載siRNA在皮膚疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為皮膚疾病治療提供更安全、有效、實(shí)用的給藥手段。

1 siRNA經(jīng)皮給藥的新型納米載體

1.1脂質(zhì)納米粒(lipid nanoparticles，LNPs) LNPs由于其粘附于皮膚上形成單層疏水膜，進(jìn)而引起閉合效應(yīng)，可防止水分流失、角質(zhì)細(xì)胞堆積減少和角質(zhì)細(xì)胞間隙擴(kuò)大，從而促進(jìn)siRNA的吸收和皮膚滲透，現(xiàn)已被廣泛用于基因藥物、抗腫瘤藥物、蛋白質(zhì)和多肽等藥物的經(jīng)皮遞送載體[8]。為增強(qiáng)LNPs攜載 siRNA 的經(jīng)皮遞送，BOAKYE等[9]利用新型吡咯烷脂質(zhì)制備陽(yáng)離子脂質(zhì)納米粒載體，負(fù)載厄洛替尼和白細(xì)胞介素(IL)36α siRNA局部用于C57BL/6小鼠銀屑病樣斑塊的治療，能明顯增加厄洛替尼的皮膚保留率和IL36α siRNA的皮膚滲透率。TRAN等[10]利用新型陽(yáng)離子脂質(zhì)納米粒裝載靶向V600EBRAF和Akt3基因的siRNA，將其局部用于裸鼠黑色素瘤模型中，結(jié)果顯示siRNA可被有效遞送到皮膚病變的黑色素瘤細(xì)胞中，降低V600EBRAF和Akt3基因的表達(dá)，進(jìn)而為靶向抑制早期或侵襲性皮膚黑色素瘤提供了有效途徑。

1.2介孔二氧化硅納米粒(mesoporous silica nano-particles，MSNs) MSNs不僅具有較大的比表面積、較高的孔隙率及可調(diào)的孔徑結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，還可以通過(guò)表面修飾或包覆功能性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，并且其穩(wěn)定的框架結(jié)構(gòu)可以保護(hù)和遞送核酸分子，以達(dá)到基因治療的目的。因此，被認(rèn)為是遞送核酸分子、蛋白質(zhì)、化療藥物的優(yōu)良載體[11]。MORRY等[12]用聚乙烯亞胺和聚乙二醇對(duì)MSNs進(jìn)行表面修飾后，作為靶向熱休克蛋白47(heat shock proteins 47，HSP47) siRNA的遞送載體；其帶正電荷的聚乙烯亞胺中和了siRNA的負(fù)電荷，增強(qiáng)了siRNA的穩(wěn)定性，聚乙二醇層保護(hù)siRNA免被核酸酶降解；體外纖維化模型研究中，MSNs有效地遞送了靶向HSP47的siRNA；通過(guò)小鼠硬皮病模型進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)，顯示給予HSP47 siRNA納米粒治療后能有效地將HSP47在皮膚中的表達(dá)降低到正常水平，進(jìn)而增強(qiáng)皮膚抗纖維化作用。LIN等[13]利用細(xì)胞可裂解的陽(yáng)離子聚合物表面功能化的MSNs作為遞送siRNA的載體，并進(jìn)行了體內(nèi)外評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示功能化的MSNs具有較高的正電荷，對(duì)siRNA具有良好的結(jié)合能力，并增強(qiáng)了siRNA的細(xì)胞攝取率。

1.3聚合物納米粒(polymeric nanoparticles，PNs) PNs可與帶負(fù)電荷的siRNA通過(guò)靜電結(jié)合而自發(fā)形成siRNA-聚合物復(fù)合物，極大降低了siRNA表面的負(fù)電荷，提高了其穩(wěn)定性；同時(shí)聚合物本身對(duì)siRNA的保護(hù)和屏障作用，減少了siRNA的降解和細(xì)胞毒性，因此成為一種被廣泛用于siRNA遞送的新型藥物載體[14-15]。CUN等[16]通過(guò)雙重乳液溶劑蒸發(fā)法制備載有siRNA的乳酸-乙醇酸聚合物納米粒，不僅具有良好生物相容性和可降解性，而且極大增加了siRNA在乳酸-乙醇酸納米粒子中的負(fù)載率和包封率。DESAI等[17]合成了一種具有環(huán)狀吡咯烷頭部基團(tuán)和聚乳酸-乙醇酸陽(yáng)離子兩親性基團(tuán)的新型可生物降解的脂質(zhì)聚合物納米載體(CyLiPn)，攜載腫瘤壞死因子α(TNF-α)siRNA用于治療慢性皮膚炎癥疾??；小鼠體內(nèi)的生物分布研究顯示CyLiPn可有效地將TNF-α siRNA遞送到深層真皮環(huán)境中；由咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病斑塊樣模型治療結(jié)果顯示，攜帶TNF-α siRNA的CyLiPn能夠顯著降低TNF-α、核因子(NF)-κB、IL-17、IL-23和Ki-67基因的表達(dá)。

1.4金納米粒(Au nanoparticles，AuNPs) AuNPs由于具有獨(dú)特的光學(xué)特性、良好的生物惰性、局部表面等離子共振效應(yīng)以及高效的光熱轉(zhuǎn)換能力等特點(diǎn)，已被用于多種藥物及核酸分子的遞送載體[18]。有研究[19]表明將AuNPs良好的等離子體特性與RNAi途徑相結(jié)合，通過(guò)對(duì)AuNPs進(jìn)行功能化修飾后，在近紅外激光照射下，可使siRNA在特定部位通過(guò)熱等離子體機(jī)制以可控方式釋放。由于AuNPs本身具有相對(duì)惰性及近紅外激光在生物組織中具有較大的穿透能力，被認(rèn)為是遞送siRNA的理想載體。ZHANG等[20]開(kāi)發(fā)了一種新型功能化金納米載體FA-AuNRs，用于介導(dǎo)siRNA靶向沉默腫瘤BRAF突變基因，再聯(lián)合光熱效應(yīng)用于治療黑色素瘤；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明， FA-AuNRs對(duì)BRAF siRNA具有較高的裝載率，并且提高其在血清中的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了對(duì)皮膚的滲透性，對(duì)C57BL/6小鼠黑色素瘤樣模型進(jìn)行治療后， 顯著抑制了BRAF基因的表達(dá)和黑色素瘤的生長(zhǎng)。

2 納米載體聯(lián)合其他途徑協(xié)同增強(qiáng)siRNA的經(jīng)皮給藥

2.1聯(lián)合細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs) CPPs具有顯著的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，可有效轉(zhuǎn)運(yùn)如siRNA、核酸和蛋白質(zhì)等多種生物活性分子穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，保證活性分子正常發(fā)揮作用且不產(chǎn)生毒性反應(yīng)[21]。因此，納米載體聯(lián)合CPPs可提高納米載體的細(xì)胞攝取和跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，增強(qiáng)siRNA在經(jīng)皮給藥中的遞送效果。寡聚精氨酸(R8)和反式激活轉(zhuǎn)錄蛋白(transactivative transcription protein，TAT)多肽是一類(lèi)高正電荷的陽(yáng)離子型CPPs，可與負(fù)電荷的siRNA通過(guò)靜電作用相互絡(luò)合。RUAN等[22]開(kāi)發(fā)了一種基于細(xì)胞穿透肽R8納米復(fù)合物的BRAF siRNA給藥系統(tǒng)，用于局部靶向治療黑色素瘤；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，R8/BRAF siRNA納米復(fù)合物能夠顯著增強(qiáng)BRAF siRNA的轉(zhuǎn)染效率，降低BRAF基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。PETRILLI等[23]以細(xì)胞穿透肽TAT功能化的新型液晶納米分散體為載體，負(fù)載TNF-α siRNA局部用于化學(xué)誘導(dǎo)的炎癥動(dòng)物模型中；體內(nèi)外研究表明，經(jīng)TAT修飾后，提高了納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和吸收效率，并且提高了siRNA的皮膚滲透率，顯著抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)。

2.2聯(lián)合離子導(dǎo)入(iontophoresis，IP) FUKUTA等[24]研究表明，親水性大分子(如siRNA和納米顆粒)在弱電流[0.3～0.5 mA·(cm2)-1]下通過(guò)IP經(jīng)皮滲透到皮膚中，在皮膚組織內(nèi)傳遞并隨后發(fā)揮其功能。IP[0.4 mA·(cm2)-1]給藥后，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的IgG抗體在皮膚內(nèi)廣泛可見(jiàn)，并從表皮層延伸至真皮層。在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型大鼠中，抗體也通過(guò)IP傳遞到炎癥的皮膚組織中。LABALA等[25-26]用殼聚糖包裹的AuNPs負(fù)載STAT3 siRNA，在IP作用下，以B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞為模型進(jìn)行體外研究；結(jié)果表明IP增強(qiáng)了負(fù)載siRNA的AuNPs的皮膚滲透性，黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞機(jī)制迅速攝取負(fù)載STAT3 siRNA的AuNPs-CS納米載體，抑制STAT3蛋白的過(guò)度表達(dá)；以黑色素瘤荷瘤小鼠為模型進(jìn)行體內(nèi)研究，使用0.5 mA·(cm2)-1弱電流通過(guò)IP局部給藥后，顯示腫瘤體積百分比和腫瘤質(zhì)量顯著減小，STAT3蛋白表達(dá)顯著降低。

2.3聯(lián)合微針 大量研究證實(shí)，微針介導(dǎo)納米顆粒的經(jīng)皮給藥可顯著增加皮膚對(duì)NPs的通透性。KUMAR等[27]評(píng)估了經(jīng)微針預(yù)處理后，在體內(nèi)外促進(jìn)納米粒皮膚滲透的效果及微生物感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)；研究表明用微針對(duì)小鼠皮膚進(jìn)行預(yù)處理，使粒徑230 nm的固體脂質(zhì)納米粒在其表面與卵清蛋白結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)皮膚滲透并誘導(dǎo)抗卵清蛋白抗體反應(yīng)，且在允許納米顆粒滲透的同時(shí)降低了細(xì)菌和病毒的滲透。WANG等[28]建立了一種包含透明質(zhì)酸基質(zhì)和MSNs包覆的納米粒包埋微針體系，利用MSNs殼加載靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1型受體的siRNA并對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，微針體系被植入皮膚后，溶解并釋放納米粒，通過(guò)皮膚組織擴(kuò)散后，被真皮層的成纖維細(xì)胞吸收內(nèi)化，釋放siRNA抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和膠原的過(guò)度生產(chǎn)，阻止瘢痕異常發(fā)育。

3 納米載體攜載siRNA在皮膚疾病中的應(yīng)用前景

皮膚疾病的種類(lèi)繁多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療效果和預(yù)后均不理想。一些皮膚炎癥如銀屑病或特應(yīng)性皮炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的影響；致死率較高的皮膚癌如黑色素瘤或鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病過(guò)程中，某些特定基因會(huì)高度表達(dá)或發(fā)生基因突變，進(jìn)而引起病癥惡化。而siRNA作為有效的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，在皮膚局部給藥后，可以直接調(diào)節(jié)皮膚中的靶細(xì)胞，發(fā)揮治療作用。因此，siRNA經(jīng)皮給藥為皮膚疾病的臨床研究提供了新的方向。

siRNA經(jīng)皮給藥的有效靶點(diǎn)包括：①BRAF是黑色素瘤中最常見(jiàn)的突變基因，該突變通過(guò)絲裂原激活蛋白激酶途徑激活下游信號(hào)，這為黑色素瘤的治療提供了一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)[29]。②林簡(jiǎn)等[30]研究表明在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞中，siRNA干擾N-myc下游基因的表達(dá)，可以抑制磷酯酰肌醇3激酶/絲氨酸激酶信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌治療提供了新的靶點(diǎn)。③LIO等[31]研究表明抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌異種移植小鼠腫瘤中TGFβR-1的表達(dá)，可降低腫瘤生長(zhǎng)速度，因此TGFβR-1可作為RNAi治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌的有效靶點(diǎn)。

但必須看到，攜載siRNA經(jīng)皮給藥系統(tǒng)用于皮膚疾病治療的研究中尚存在多個(gè)未解決的問(wèn)題：一是需篩選最佳siRNA序列，進(jìn)而保證其在靶向性沉默和疾病治療方面具有最佳效果。二是siRNA經(jīng)皮給藥的納米載體所涉及的長(zhǎng)期安全性和可能產(chǎn)生的皮膚刺激及其他不良反應(yīng)等問(wèn)題，如在siRNA給藥的研究中，大多數(shù)臨床試驗(yàn)是基于脂質(zhì)體納米粒，而其他納米粒載體MSNs、AuNPs或PNs仍存在生物相容性差和不可生物降解等問(wèn)題。三是IP常伴有疼痛感，微針?biāo)鶎?dǎo)致的開(kāi)放性傷口也容易引起皮膚病毒和細(xì)菌感染。所以，未來(lái)研究的重點(diǎn)仍是為不同類(lèi)型的皮膚疾病患者提供有效且安全的siRNA經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，以保證在有效給藥和安全性之間達(dá)到適當(dāng)?shù)钠胶狻?/p>

4 結(jié)束語(yǔ)

RNAi作為一種新的基因敲除機(jī)制，可通過(guò)siRNA對(duì)皮膚疾病的特定靶基因進(jìn)行特異性調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。此機(jī)制不僅具有較高的特異性，而且顯著降低了全身毒副作用，因此具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值和潛力。而TDDS不僅在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示改善了siRNA的生物利用度，而且可提高患者的依從性，為基于siRNA的皮膚疾病治療提供了一種安全的給藥系統(tǒng)。隨著對(duì)siRNA經(jīng)皮給藥納米載體的不斷深入研究，與納米載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)的逐漸完善和成熟，將會(huì)為皮膚疾病的治療提供更安全、更有效、更實(shí)用的載藥手段。