胡心瑤，朱華，徐細明

(武漢大學人民醫(yī)院a.腫瘤科，b.神經外科，武漢 430060)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的主要表現(xiàn)形式，占肝癌患者總數的75%～85%[1]，也是全球惡性腫瘤相關死亡的第二大原因[2]。HCC目前常用篩查手段為影像學檢查和血清甲胎蛋白檢測[3]，但其敏感性仍不足。在一項針對HCC患病率為5%的人群研究中，甲胎蛋白對HCC的陽性診斷率僅為25%[4]。HCC起病隱匿，易發(fā)生早期轉移，多數患者臨床診斷時已為晚期[5]。盡管手術切除、肝移植、射頻消融等治療技術不斷進步，但HCC晚期患者的5年生存率仍低于20%[6]，因此迫切需要探尋新的早期診斷手段和有效治療方法。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類單鏈閉環(huán)結構的非編碼RNA[7]，曾被認為是RNA剪接過程中的中間產物或錯誤的副產品而被忽視[8]。近年研究證實，circRNA是廣泛存在、表達豐富、穩(wěn)定、保守的非隨機產物[9]，circRNA成為近年的研究熱點。除上述特點外，circRNA還在各種體液中表達，并在腫瘤中特異性表達，發(fā)揮促進或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，提示circRNA在腫瘤診斷、治療和預后等方面有重要意義，有望成為HCC新的診斷標志物和治療靶點。現(xiàn)對circRNA的特點、功能及其在HCC診治過程中的作用予以綜述，旨在為HCC的診斷和治療提供新思路。

1 circRNA的生成和主要特點

RNA的選擇性剪接是真核細胞的基本基因表達方式。信使RNA(messenger RNA，mRNA)前體在剪接體的催化作用下除去內含子，剩下的具有蛋白質編碼信息的外顯子順次連接組成成熟的mRNA[10]。與mRNA的典型剪接不同，circRNA通過反向剪接產生，將下游的5′剪接供體與上游的3′剪接受體連接形成單鏈共價閉環(huán)[11]，隨后剪接體去除全部或部分內含子產生3種circRNA，包括僅包含外顯子序列的外顯子circRNA、僅包含內含子序列的內含子circRNA以及同時包含外顯子和內含子序列的外顯子-內含子circRNA[12]。

目前被廣泛認可的circRNA生物發(fā)生的驅動機制包括套索驅動的環(huán)化模式以及內含子配對驅動的環(huán)化模式[13]。在套索驅動的環(huán)化模式中，mRNA前體中的遠端外顯子彼此靠近，隨后上游外顯子3′端的剪接供體與下游外顯子5′端的剪接受體共價結合后再切除內含子而構成外顯子circRNA。當位于套索中的內含子沒有被完全剪接移除時，它們就留在環(huán)繞的外顯子中，形成外顯子-內含子circRNA。內含子配對驅動的環(huán)化模式主要由兩個內含子通過Alu重復序列堿基互補配對后自身環(huán)化，繼而切去內含子，構成circRNA。

circRNA的封閉環(huán)形結構特點使其具有獨特的生物特性：①穩(wěn)定性，circRNA為單鏈共價環(huán)狀結構，不包含5′端帽子和3′端尾巴，不能被外顯子酶降解；②進化保守性，人類與小鼠的circRNA同源性達20%以上[14]，并與果蠅有同源性；③多樣性，circRNA可以在大多數生物體中檢測到，且同一基因可以產生不同的circRNA，進一步增加了circRNA的豐度；④特異性，在不同組織、生長階段、病理過程中，circRNA的表達水平均不同。上述特性是HCC成為靈敏、準確的生物學標志物以及有效治療靶標的基礎[15]。

2 circRNA的生物學功能

circRNA中，以外顯子circRNA最常見，其主要存在于細胞質，而內含子circRNA和外顯子-內含子circRNA在細胞核中含量較豐富[16]。circRNA通過多種作用途徑在多種疾病，尤其是惡性腫瘤的形成、發(fā)展中起重要作用，參與腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲及凋亡。

2.1作為微RNA(microRNA，miRNA/miR)海綿 circRNA作為一種競爭性內源RNA，可攜帶多個miRNA反應元件，作為海綿吸附miRNA，降低其表達，通過影響miRNA下游通路發(fā)揮多種生物學作用，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]，這是circRNA最核心的作用。小腦變性相關蛋白1反義轉錄物是首個被證實作為miRNA海綿發(fā)揮作用的circRNA，它具有70個以上的miR-7結合位點，可以大幅度降低miR-7的表達[18]。但近年研究發(fā)現(xiàn)，仍有許多circRNA幾乎沒有與miRNA的結合位點，且高通量測序分析顯示，miRNA海綿效應機制不能應用于所有circRNA[19]。

2.2與RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)相互作用 circRNA與RBP之間存在動態(tài)、多樣的相互作用。circRNA可以在RBP的輔助下間接調節(jié)基因轉錄。例如，argonaute是一類沉默miRNA的RBP，circRNA可以協(xié)助argonaute蛋白與miRNA相互作用，從而降低miRNA與相應mRNA結合的能力。circRNA還可與mRNA競爭結合RBP，影響mRNA翻譯。此外，circRNA還可作為RBP的超級海綿，影響RBP的表達，同時調節(jié)靶基因的翻譯[20]。

2.3選擇性剪接和親本基因轉錄的調控 circRNA的反向剪切可以與mRNA前體競爭剪切位點，抑制mRNA的表達。此外，在反向剪切的過程中，circRNA可能封閉翻譯起始位點，阻止mRNA轉錄，從而降低某些蛋白質的表達[21]。調節(jié)親本基因轉錄的circRNA大多存在于細胞核，主要是內含子circRNA和外顯子-內含子circRNA[18]。它們與U1小核糖核蛋白形成復合物，進一步與親本基因啟動子相互作用，增強基因的轉錄和表達[21]。

2.4翻譯蛋白并作為蛋白質支架 少數circRNA還可以編碼蛋白質。circRNA SHPRH(SNF2 histone linker PHD RING helicase)可通過編碼分子量為17 000的SHPRH-146aa來保護與其相關的全長SHPRH蛋白，從而發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[22]。circRNA還可以作為支架促進兩個或更多蛋白質之間的接觸和作用。circRNA FoxO3具有鼠雙微粒體-2基因和p53的結合位點。這些結合位點的突變或circRNA的敲低均會導致鼠雙微粒體-2基因抗體對p53的抑制減少[23]。

3 circRNA在HCC發(fā)展中的作用

有研究在HCC組織和相應正常肝組織中的分析報告中發(fā)現(xiàn)了1 245個差異表達的circRNA，其中756個表達上調，489個表達下調[24]，提示circRNA在HCC發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用，尋找起關鍵調控作用的circRNA并加以干預可能為HCC的診斷和治療提供新思路。

3.1circRNA抑制HCC增殖和轉移 circRNA MTO1(hsa_circ_0007874/hsa_circ_104135)在HCC組織中表達顯著下調，且低表達circRNA MTO1患者的生存期明顯縮短；進一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA MTOR作為miR-9的海綿下調miR-9，進而促進miR-9的靶標p21的表達[25]。p21是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，起抑制細胞周期、抗增殖的作用，其高表達阻礙了HCC的進展[26]。此外，在HCC中下調的還有hsa_circ_0001649[27]，它作為miR-127-5p、miR-612和miR-4688的海綿，通過激活下游SHPRH的表達抑制HCC的進展[28]。敲除hsa_circ_0001649可大大增加與HCC侵襲和遷移高度相關的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達，如MMP-9、MMP-10和MMP-13。生物信息學分析表明，hsa_circ_0001649還具有多種RBP的潛在結合位點，包括U2AF65、EIF4A3和UPF1[29]，表明其可能作為蛋白質海綿或轉錄調節(jié)因子來調控HCC的進展。

hsa_circ_0005986在HCC組織和細胞中表達下調，它作為miR-129-5p的海綿減少其表達，進而導致其靶基因Notch1過表達來抑制HCC的進展和轉移[30]。此外，敲除HCC細胞中hsa_circ_0005986會加速細胞從G0/G1期到S期的轉變，導致癌細胞增殖。而過表達hsa_circ_0005986則抑制HCC的增殖和遷移能力。circRNA SMAD2在HCC組織中的水平也顯著低于鄰近非腫瘤組織，影響了HCC組織的分化程度。上調circRNA SMAD2可阻礙HCC細胞的遷移、侵襲和上皮-間充質轉化，而miR-629是circRNA SMAD2的靶點[31]。circRNA C3P1是另一個在HCC中表達下調的基因，其表達水平與HCC的TNM分期、腫瘤大小、血管侵襲程度呈負相關[32]。circRNA C3P1通過對miR-4641的海綿效應增強PCK1的表達，而PCK1是糖異生的關鍵調控點，最終發(fā)揮抑制腫瘤的作用。因此，外源性增強關鍵抑癌circRNA的表達有望為HCC的治療提供新思路。

3.2circRNA促進HCC增殖和轉移 促進HCC發(fā)展的基因往往在肝癌組織中高表達，且其高表達往往提示HCC分期高、患者預后差、治療難度大等。小腦變性相關蛋白1反義轉錄物是研究較廣泛的circRNA，通常發(fā)揮促癌作用，其經典作用機制是作為腫瘤抑制因子miR-7的海綿，抑制miR-7下游的多種抗腫瘤蛋白，包括磷酸肌醇-3-激酶催化的delta多肽、核糖體S6蛋白激酶、S6激酶1、細胞周期蛋白E、表皮生長因子受體等，從而促進HCC細胞的增殖和侵襲。Twist是一種關鍵的上皮-間充質轉化誘導轉錄因子，它通過上調circRNA-10720隔離一系列直接靶向波形蛋白的miRNA，進而增加上皮-間充質轉化中波形蛋白的表達，誘使HCC細胞發(fā)生上皮-間充質轉化，使其獲得侵襲性并向遠處轉移；沉默的circRNA-10720在體內和體外都抑制了Twist1的促瘤效果，這為HCC提供了潛在的治療靶標[33]。hsa_circ_0039053也是一個表達上調的致癌基因，它通過與miR-637相互作用正向調控USP21的表達，USP21通過去泛素化穩(wěn)定促分裂原活化的蛋白激酶激酶2，促進腫瘤生長[34]。

近年來，越來越多的致癌circRNA被發(fā)現(xiàn)，如has_circ_001306通過miR-584-5p/周期蛋白依賴激酶16軸促進HCC的進展[35]，hsa_circ_102559作為miR-130a-5p的海綿增加其靶基因膜聯(lián)蛋白A2的表達，從而促進HCC的進展[36]。circRNA HIPK3可作為多種miRNA(如miR-124、miR-558、miR-193a和miR-379)的海綿發(fā)揮作用，可通過降低miR-124的表達上調水通道蛋白3，從而促進HCC細胞的增殖和遷移[37-38]。沉默circRNA HIPK3可能是一個新的治療手段。此外，下調circ_0067934表達可顯著阻礙HCC細胞的增殖、轉移和侵襲，并誘導其凋亡[39]。circ_0067934可以激活卷曲類受體5/Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路促進HCC進展[40]，表明circ_0067934/miR-1324/卷曲類受體5/β聯(lián)蛋白信號軸可能是具有研究潛力的信號通路。此外，在HCC組織中circRNA RBM23高表達可增加HCC細胞的活力，并促進其遷移，而沉默circRNA RBM23可促進miR-138轉錄，下調靶基因細胞分裂素D3和波形蛋白的表達，進而阻礙HCC細胞的增殖和遷移[41]。通過關鍵致癌circRNA的小干擾RNA或短發(fā)夾RNA來敲除或下調相應circRNA的表達是HCC治療的新方向。

3.3circRNA調控肝炎病毒感染引起的HCC 在HCC高發(fā)地區(qū)，慢性乙型肝炎病毒感染導致的HCC占全球原發(fā)性肝腫瘤的50%以上[40]。已有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA/miRNA調控軸可能參與乙型肝炎病毒感染的有關途徑[42]。此外，miR-122同時起HCC抑制劑和丙型肝炎病毒復制增強劑的作用[16]，可通過設計circRNA海綿吸收miR-122[41]，從而阻礙丙型肝炎病毒的復制。但這種海綿效應會同時誘導肝癌發(fā)展，因此亟需進一步尋找精準針對肝炎病毒復制的miRNA，以設計出無不良反應的circRNA海綿用于臨床治療。還有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-100338的升高通過circRNA-100338/miR-141-3p/在大腦中富集的Ras同源物軸激活HCC的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，從而影響肝炎相關HCC的預后[43]。另有報道，circRNA還可參與調節(jié)抗病毒免疫應答，circRNA對宿主免疫系統(tǒng)的影響可能是其調節(jié)肝炎病毒感染引起HCC的另一種機制[44]。然而，目前的研究尚未充分了解乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒感染與circRNA的關系，需要更多的研究模型來探索circRNA在肝炎病毒相關性HCC發(fā)病機制中的作用，從而加以干擾和治療。

3.4circRNA影響HCC微環(huán)境巨噬細胞浸潤 有研究從TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫中HCC患者的癌和癌旁組織中篩選出837個(上升566個，下降271個)與巨噬細胞相關的差異表達mRNA，在GSE14520的214例HCC患者的癌及鄰近非癌組織中發(fā)現(xiàn)了705個(上升275個，下降430個)與巨噬細胞相關的mRNA[1]。疊加分析得到274個(116個上升，158個下降)巨噬細胞相關的差異表達mRNA，這些基因可能在免疫相關過程中(如急性炎癥反應、補體的初始觸發(fā)、對腫瘤壞死因子的反應、正向趨化、適應性免疫反應的正向調節(jié)和防御反應的負向調節(jié))被富集。已經明確了6個差異表達的mRNA(Zeste同源增強子2、依賴于細胞周期調控因子10抗體的轉錄物2、多聚酶抑制復合物1、驅動蛋白超家族蛋白4A、整合素α6和層粘連蛋白C1)用于構建circRNA調控網絡，包括9個circRNA-miRNA-mRNA軸，表明circRNA可能通過circRNA-miRNA-mRNA軸影響mRNA的表達，最終影響HCC微環(huán)境中巨噬細胞浸潤，參與HCC的發(fā)生發(fā)展[1]。未來仍需要更多研究來發(fā)掘circRNA完善HCC微環(huán)境巨噬細胞浸潤相關的circRNA調控網絡，通過增加或抑制關鍵circRNA的表達促進機體對腫瘤細胞的免疫清除。

4 circRNA在HCC診斷和預后中的應用

4.1circRNA與HCC的診斷 circRNA診斷HCC的靈敏度為0.75(95%CI0.73～0.78)，特異度為0.78(95%CI0.75～0.81)，曲線下面積為0.86[45]，提示circRNA是HCC的潛在生物診斷標志物[46]。小腦變性相關蛋白1反義轉錄物主要存在于細胞質，通常隨疾病的發(fā)生釋放入血，有望成為HCC診斷的早期生物標志物[47]。存在于HCC患者外周血單核細胞內的circ_0000798以及has_circ_0078602均已被證實有作為HCC患者無創(chuàng)診斷標志物的潛能[48]。HCC中has_circ_0003998存在差異表達，且HCC、乙型肝炎病毒感染患者與健康對照者的血漿has_circ_0003998水平比較差異有統(tǒng)計學意義[46]。has_circ_00156、has_circ_000224和has_circ_000520是新發(fā)現(xiàn)的高靈敏度、高特異度的生物標志物，可協(xié)助HCC的診斷[49]。

此外，circRNA有望作為HCC篩查和預后的生物標志物，部分circRNA同時具備海綿作用和診斷能力，如has_circ_u100338、circRNA FBLIM1在HCC細胞中不僅作為miRNA海綿促進肝癌細胞遷移[24,50]，還可作為HCC的診斷性生物標志物和治療靶點。circ_104075在HCC組織、細胞系和血清中高表達，吸收miR-582-3p上調YAP促進HCC的發(fā)展。同時，circ_104075作為HCC診斷標志物的受試者工作特征曲線下面積為0.973，靈敏度為96.0%，特異度為98.3%，表明circ_104075具有診斷HCC的潛力[51]。circRNA-100338可以通過circRNA-100338/miR-141-3p/在大腦中富集的Ras同源物軸調控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，且circRNA-100338、在大腦中富集的Ras同源物、翻譯啟動因子5是乙型肝炎相關HCC預后不良的指標[43]。此外，circRNA ITCH過吸收miR-7、miR-17和miR-214，增加ITCH的表達，阻礙Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路，抑制癌細胞增殖[52]。Hsa_circ_0005075的表達與HCC腫瘤大小相關，并且具有區(qū)分鄰近非腫瘤組織與HCC組織的良好潛力[29]。Hsa_circ_0005075還與細胞黏附密切相關，其曲線下面積為0.94，靈敏度和特異度分別為0.833 和0.900[53]，證明可通過Hsa_circ_0005075預測HCC的轉移。未來還需要進一步的基礎研究和臨床試驗，發(fā)掘更敏感、更準確的HCC診斷標志物，并與傳統(tǒng)標志物結合，以提高HCC早期檢出率，改善患者生命質量。

4.2circRNA與HCC的預后 對HCC患者預后的準確判斷有助于指導治療方式的選擇，從而延長HCC患者的總生存期和無復發(fā)生存期，但目前尚無經臨床應用驗證的HCC預后標志物?；赾ircRNA的高穩(wěn)定性和高豐度，其具有成為HCC預后標志物的巨大潛力。

Kaplan-Meier生存分析顯示，在14個預示HCC不良預后的高表達circRNA中，circ_0000267、circ_001569、circ_0008450、circ_101368、circ_0128298、circ_0000517、circRNA BIRC6、circRNA MAT2B是HCC患者預后的獨立指標[54]。circ_0000267、circ_001569和circ_0008450的表達與患者腫瘤大小和TNM分期相關；circ_101368的表達影響腫瘤大小、TNM分期和遠處轉移；circ_0128298高表達預示著血管癌栓生成以及腫瘤的淋巴、器官轉移；circRNA BIRC6的表達與TNM分期和血管侵襲相關；而circRNA MAT2B的表達主要影響腫瘤大小、血管侵襲性、腫瘤包裹性、TNM分期和Edmonson分期[24]。此外，在HCC中高表達的circ_0000517可以調節(jié)促分裂原活化的蛋白激酶和Ras通路以及腫瘤抑制因子p53、MYC基因和蛋白激酶B1的表達，從而影響HCC患者的預后和分期[55]。

一些circRNA的低表達也預示著HCC的預后不良，如circ_0001649、circRNA ZKSCAN1、circRNA LARP4。circ_0001649的低表達預示著肝癌腫瘤體積更大以及腫瘤栓塞的發(fā)生[54]；circRNA ZKSCAN1的低表達與腫瘤數量、肝硬化程度、血管侵犯以及腫瘤分級等密切相關，且其表達水平與上皮細胞黏附分子水平在臨床HCC樣本中呈負相關，提示它可以預測HCC患者惡性腫瘤轉移和預后的情況[56]；而circRNA LARP4表達降低與腫瘤的體積增大、Edmondson分期和TNM分期有關[57]。除HCC組織外，血清、外泌體、血漿或外周血單核細胞中的一些circRNA也已被確定為潛在的非侵入性預后生物標志物。HCC組織及血清中circRNA ZEB1.33的高表達與肝癌患者TNM分期及較低的總生存率相關[24]。

5 小 結

circRNA是近年的研究熱點，其更高的穩(wěn)定性和豐度成為HCC具有前景的診斷、預后標志物。目前關于HCC發(fā)展、診治過程中circRNA作用的研究尚處于初步階段，仍存在許多問題。首先，大多數circRNA的基因組研究使用微陣列分析方法，缺乏足夠的樣本量；其次，如何從大量的候選circRNA中挑選發(fā)揮關鍵作用且具有臨床價值的circRNA是一個巨大的工程。circRNA通過多種途徑(如與miRNA或蛋白相互作用、被翻譯成功能蛋白、調控RNA前體或親本基因轉錄等方式)調控HCC的發(fā)生發(fā)展，篩選出發(fā)揮關鍵調控功能的circRNA，闡明其靶向分子和信號通路，將有助于發(fā)掘circRNA作為HCC治療靶點的巨大臨床價值。