孫玉榮，胡冬梅，劉 靜，楊文志，王玉玨，江云鵬

（蒙牛乳業(yè)（察北）有限公司 河北省張家口市張北縣察北管理區(qū)，河北張家口 076481）

糠氨酸是牛乳在加熱過(guò)程中，氨基酸、蛋白質(zhì)與乳糖通過(guò)美拉德反應(yīng)生成ε-N-脫氧乳果糖基-L-賴氨酸（ε-N-deoxylactolusy-L-lysine），經(jīng)酸水解轉(zhuǎn)換成更穩(wěn)定的糠氨酸（ε-N-2-furoylmethyl-L-lysine，ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸）[1]。這個(gè)反應(yīng)的大小程度與生乳在滅菌過(guò)程中熱處理的類型與強(qiáng)度有著密切的聯(lián)系，與成品液態(tài)奶品質(zhì)的優(yōu)良息息相關(guān)。

《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》（NY/T 939—2016）中糠氨酸含量的測(cè)定：試樣經(jīng)鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜（HPLC）或超高效液相色譜（UPLC）在紫外（波長(zhǎng)280 nm）檢測(cè)器下進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量[2]。基于水解時(shí)間要求（110±2）℃下加熱水解12～23 h。因耗時(shí)較長(zhǎng)的原因，本文分析研究水解1～13 h的糠氨酸的回收率，并進(jìn)行回收率試驗(yàn)，對(duì)比分析1～13 h的糠氨酸檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

甲醇（CH3OH）：色譜純；濃鹽酸（HCL，密度為1.19 g/mL）；三氟乙酸：色譜純；乙酸銨；糠氨酸（C12H17N2O4?XHCL）；水相濾膜；水相針頭式濾器；1 mL注射器。

1.2 儀器

配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀；（110±2）℃干燥箱；密封耐熱試管：容積為20 mL；電子天平：感量為0.1 mg；凱氏定氮儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 采樣

用于檢測(cè)的巴氏殺菌乳在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中的溫度為2～6 ℃，UHT滅菌乳儲(chǔ)存和運(yùn)輸溫度不高于25 ℃。按《隨機(jī)數(shù)的產(chǎn)生及其在產(chǎn)品質(zhì)量抽樣檢驗(yàn)中的應(yīng)用程序》（GB/T 10111—2008）的規(guī)定取不少于250 mL樣品，樣品在送檢過(guò)程中應(yīng)完好無(wú)損且樣品儲(chǔ)存環(huán)境條件符合要求。

1.3.2 試樣水解液的制備

吸取2.00 mL試樣，置于密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，混勻。密閉試管，置于干燥箱中，在110 ℃下加熱水解1～13 h，加熱約1 h后，輕輕搖動(dòng)試管。在加熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后用濾紙過(guò)濾，濾液供測(cè)定[2]。

1.3.3 試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

移取2.00 mL試樣水解液，按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）的規(guī)定測(cè)定試樣溶液中的蛋白質(zhì)含量[3]。

1.3.4 糠氨酸含量的測(cè)定原理

試樣經(jīng)鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜（HPLC）或超高效液相色譜（UPLC）在紫外（波長(zhǎng)280 nm）檢測(cè)器下進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。

1.3.5 試樣水解液中糠氨酸含量測(cè)定

移取1.00 mL試樣水解液，加入5.00 mL的6 g/L乙酸銨溶液，混勻，過(guò)0.22 μm水相濾膜，濾液供上機(jī)測(cè)定。

1.3.6 HPLC測(cè)定

（1）色譜參考條件。色譜柱：CAPCELL PAK C18TYPE：AQ 250 mm×4.6 mm，5 μm粒徑；柱溫：32 ℃；流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B；洗脫梯度，見(jiàn)表1。

表1 洗脫梯度

（2）糠氨酸含量測(cè)定。利用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液（50∶50）以1 mL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。然后，用初始流動(dòng)相平衡系統(tǒng)直至基線平穩(wěn)?？瞻自噭?0 μL鹽酸溶液（濃度3 mol/L），選擇10 μL待測(cè)溶液對(duì)糠氨酸含量進(jìn)行測(cè)量。

（3）蛋白質(zhì)含量的計(jì)算。

蛋白質(zhì)含量的計(jì)算，如式（1）所示：

其中：X-試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；V1-試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2-試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C-硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；0.014 0-1.0 mL硫酸[（c?H2SO4）=1.000 mol/L]或鹽酸[（cHCl）=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；m-試樣的質(zhì)量，g；V3-吸取消化液的體積，mL；F-氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，各種食品中氮轉(zhuǎn)換系數(shù)；100-換算系數(shù)。

（4）糠氨酸含量的計(jì)算?？钒彼岷恳再|(zhì)量分?jǐn)?shù)F計(jì)，數(shù)值以毫克每百克蛋白質(zhì)（mg/100 g蛋白質(zhì)）表示，糠氨酸含量的計(jì)算如（2）所示：

其中：At-測(cè)試樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Astd-糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Cstd-糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/L；D-測(cè)定時(shí)稀釋倍數(shù)，（D=6）；m-樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中糖氨酸含量F（mg/100 g蛋白質(zhì)）

標(biāo)樣的濃度為2 mg/L，以標(biāo)樣的峰面積為儀器采集數(shù)據(jù)，對(duì)樣品中糖氨酸的含量F進(jìn)行計(jì)算。樣品在乳糖酶作用下，牛乳水解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h，采用HPLC法對(duì)牛乳中糠氨酸含量進(jìn)行測(cè)量。作為MailIard反應(yīng)產(chǎn)生的特定產(chǎn)物，糠氨酸近年來(lái)常常被用于食品受熱程度的判斷與評(píng)估，主要應(yīng)用在谷物、蛋類、肉制品及中藥口服液中。由表2可知，隨著乳糖酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，乳與乳制品中糠氨酸含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)75 ℃、30 min及75 ℃、15 s預(yù)殺菌處理?xiàng)l件下，可以發(fā)現(xiàn)其前者較后者所獲得的糠氨酸含量成倍升高。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》要求，其中的糠氨酸含量＞12 mg/100 g蛋白質(zhì)或UHT乳中糠氨酸含量＞190 mg/100 g 蛋白質(zhì)，表示含有復(fù)原乳。當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到9 h后，乳與乳制品中糠氨酸含量＞190 mg/100 g蛋白質(zhì)，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，糠氨酸含量逐漸降低。乳與乳制品經(jīng)過(guò)75 ℃、15 s熱處理，糠氨酸含量較低，相當(dāng)于有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳。

表2 不同水解時(shí)間下糠氨酸含量比較（mg/100 g蛋白質(zhì)）

2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在已知糠氨酸含量供試驗(yàn)品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)樣品，反復(fù)進(jìn)行5次測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，其回收率均在90%以上。按照公式計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果為：

3 結(jié)論

本文對(duì)《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》分析步驟中的試樣水解液的制備[3-4]，水解時(shí)間在9 h的糠氨酸含量回收率進(jìn)行分析論證得到，樣品的回收率結(jié)果符合回收率要求90%～110%（高效液相色譜法測(cè)定復(fù)原乳中糠氨酸的含量回收率試驗(yàn)）[5]，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.68，符合獨(dú)立測(cè)試結(jié)果＜10%的要求。隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，乳與乳制品中糠氨酸含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，當(dāng)水解時(shí)間為9 h且經(jīng)過(guò)75 ℃、30 min熱處理，糠氨酸含量＞190 mg/100 g蛋白質(zhì)，乳與乳制品相當(dāng)于含有復(fù)原乳的UHT殺菌乳，在75 ℃、15 s條件下，乳與乳制品獲得糠氨酸含量少，僅為含有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》制備試樣水解液，將水解時(shí)間控制為9 h，獲得的糠氨酸含量最高，且具有較高的回收率，標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10，故可應(yīng)用于實(shí)際的檢測(cè)工作中，節(jié)約人工成本、提高工作效率。