彭 立

（宜春市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，江西宜春 336000）

黃曲霉與寄生曲霉等菌株在特定溫濕度條件下會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素，屬于一類二級(jí)代謝產(chǎn)物，此類毒素對(duì)人體有強(qiáng)烈致癌危害。黃曲霉毒素包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中毒性最強(qiáng)的為黃曲霉毒素B1。由于自然環(huán)境中存在的黃曲霉毒素相對(duì)較多，且對(duì)人類的危害性極高，因此有必要做好相關(guān)的控制工作。目前，在檢測(cè)黃曲霉毒素時(shí)多選擇液相色譜法、金標(biāo)試紙法、酶聯(lián)免疫法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法具備極高的靈敏度和可觀的準(zhǔn)確性，能夠精確定量黃曲霉毒素，因此被廣泛應(yīng)用于食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)。本文選擇免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)測(cè)定糧油食品中黃曲霉毒素B1。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜級(jí)）；乙酸銨（分析純）；0.22 μm微孔有機(jī)濾膜；黃曲霉毒素免疫親和柱；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 μg/mL）。實(shí)驗(yàn)用糧油樣品獲取自近期本地市場(chǎng)抽樣。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Agilent 1260）；電子天平（梅特勒ME204E型）；渦旋混合器（vortex genie2）；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

精準(zhǔn)量取黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入適量甲醇稀釋為100 ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別量取 0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于樣品瓶?jī)?nèi)，加入初始比例流動(dòng)相定容，完成濃度分別為0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。

1.3.3 樣品提取

精準(zhǔn)稱取5.00 g糧油樣品置于離心管（50 mL），加入甲醇-水溶液（70∶30）25.0 mL，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至超聲波儀內(nèi)持續(xù)20 min提取后，再持續(xù)10 min離心（6 000 r/min），收集上清液，待凈化。

1.3.4 樣品凈化

精準(zhǔn)量取上清液5.0 mL，加入含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液20 mL并混勻，待免疫親和柱原有液體恢復(fù)至室溫并流進(jìn)后，用注射器裝載上述樣液，控制下滴流速為1.0 mL/min，全部下滴后用水淋洗免疫親和柱（分2次，共計(jì)耗水20 mL）[1-2]。待滴完水后抽干免疫親和柱，用甲醇洗脫免疫親和柱（分2次，共計(jì)使用甲醇2 mL），控制下滴流速為1.0 mL/min，用氮吹管裝載收集的洗脫液，50 ℃下氮?dú)獯蹈珊?，殘?jiān)贸跏急壤鲃?dòng)相（1 mL）溶解后，過(guò)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，待測(cè)。

1.3.5 色譜條件

選 擇 Shim-pack GIST C18色 譜 柱，100 mm×2.1 mm，2 μm；40 ℃柱溫，0.3 mL/min柱流量，10 μL進(jìn)樣體積[3]。流動(dòng)相A、B分別為乙酸銨溶液（5 mmol/L）、乙腈-甲醇溶液（50∶50）.表1為梯度洗脫程序。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程及相關(guān)性

根據(jù)1.3.1和1.3.2的步驟完成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，檢測(cè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照對(duì)應(yīng)化合物濃度（X）和目標(biāo)化合物響應(yīng)峰面積（Y）獲取黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，線性范圍為0.2～20 ng/mL，R＞0.998。

2.2 方法檢出限

精準(zhǔn)量取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，移至空白樣品溶液內(nèi)，加入初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，以檢出限為信噪比S/N=3為根據(jù)，通過(guò)計(jì)算獲取0.07 μg/kg的黃曲霉毒素B1檢出限，以定量限為信噪比S/N=10為根據(jù)，通過(guò)計(jì)算獲取0.2 μg/kg的黃曲霉毒素B1定量限。

2.3 加標(biāo)回收率及重現(xiàn)性

分別精準(zhǔn)稱取空白糧油樣品5.00 g，共計(jì)18份，圍繞1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備分別進(jìn)行6次加標(biāo)，通過(guò)處理檢測(cè)后得到黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。加標(biāo)回收率超過(guò)85.0%，RSD處于2.8%～5.5%，見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（n=6）

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

為對(duì)該方法實(shí)用性與可靠性展開(kāi)驗(yàn)證，參照上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)2種能力驗(yàn)證樣品及3種市場(chǎng)糧油制品進(jìn)行前處理后，獲取黃曲霉毒素B1含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表3。根據(jù)兩種能力驗(yàn)證樣品中測(cè)定的黃曲霉毒素B1含量結(jié)果得知，Z比分?jǐn)?shù)為-0.83，|Z|≤2，結(jié)果滿意，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性。以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中有關(guān)谷物及其制品、油脂及其制品中規(guī)定的黃曲霉毒素 B1為 5.0～ 20 μg/kg、10～ 20 μg/kg的安全限量為根據(jù)，市場(chǎng)糧油制品測(cè)定結(jié)果中的黃曲霉毒素B1含量與國(guó)家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合。

表3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

經(jīng)提取、凈化后的糧油制品，結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素B1，獲取的結(jié)果與國(guó)家安全限量標(biāo)準(zhǔn)相符合，加標(biāo)回收率超過(guò)85.0%，RSD處于2.8%～5.5%。實(shí)際樣品檢測(cè)中，結(jié)果滿意，證實(shí)了方法準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于快速檢測(cè)糧油制品中黃曲霉毒素B1。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法選擇

目前，可用于檢測(cè)黃曲霉毒素的方法有很多，如膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、薄層色譜法及免疫親和柱-溴化熒光分光光度法等。其中，由于薄層色譜法會(huì)消耗大量溶劑，且重現(xiàn)性不太可觀，因此在檢測(cè)黃曲霉毒素中并不太適用[4]。膠體金試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法一般在快速篩查黃曲霉毒素中應(yīng)用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法能夠同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素，然而因本身需要使用過(guò)于昂貴的儀器，會(huì)產(chǎn)生較高的使用成本，故而也不太適用。免疫親和柱無(wú)需消耗太多有機(jī)溶劑，且特異性強(qiáng)、機(jī)制干擾少、靈敏度高，在多種復(fù)雜基質(zhì)樣品中適用，在精確定量及確認(rèn)黃曲霉毒素中十分適用[5]。因此，本試驗(yàn)在綜合對(duì)比多種方法的優(yōu)劣后，最終選擇了免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)對(duì)糧油食品中的黃曲霉毒素B1展開(kāi)測(cè)定。

3.2 樣品前處理優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素時(shí)，在樣品前處理方面多以手動(dòng)凈化的方式為主[6]。但是該凈化方式涉及了過(guò)于煩瑣的過(guò)程，且會(huì)消耗大量時(shí)間，每天能夠完成的樣本處理量較少，面對(duì)較大樣品量時(shí)會(huì)暴露出人為因素影響大、時(shí)效性低等不足。而通過(guò)免疫親和柱在線凈化高效液相色譜法的應(yīng)用，能將上述不足有效彌補(bǔ)，大幅提升檢測(cè)時(shí)效性，且能為檢測(cè)結(jié)果提供準(zhǔn)確性保障。

3.3 流動(dòng)相選擇

以標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016中洗脫程序?yàn)楦鶕?jù)，以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸銨溶液為對(duì)象，對(duì)比流動(dòng)相組合洗脫效果[7]。其中，甲醇-乙腈洗脫效率更顯著，洗脫時(shí)間更短。通過(guò)乙酸銨溶液的添加，能獲取對(duì)稱性良好的峰型，出峰時(shí)間更穩(wěn)定，單個(gè)樣品測(cè)試時(shí)間更短。因此，在綜合對(duì)比多種流動(dòng)相的優(yōu)劣后，本實(shí)驗(yàn)中確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈（50∶50）溶液和乙酸銨溶液（0.5 mmol/L）。

3.4 提取劑選擇

本次實(shí)驗(yàn)前對(duì)提取劑選擇甲醇-水溶液和乙腈-水溶液時(shí)的提取效果展開(kāi)對(duì)比分析，分析得到兩者之間不存在明顯差異，確定提取劑為成本相對(duì)更低的甲醇-水[8]。