李坤全，王春雷

（聊城市檢驗(yàn)檢測中心，山東聊城 252000）

罌粟殼系成熟罌粟去掉果實(shí)之后干燥的果殼，其含有嗎啡（Morphine）、可待因（Codeine）、那可?。∟oscapine）、罌粟堿（Papaverine）和蒂巴因（Thebaine）等生物堿[1]，這些成分有斂肺止咳、鎮(zhèn)靜止痛、止瀉等功效[2]，但也有一定的成癮性，一些不良商家正是看到了這一點(diǎn)，才鋌而走險(xiǎn)，將罌粟殼加入火鍋底料、烹調(diào)香料、羊肉湯、麻辣燙、醬鹵肉和飲料等食品中，以此來吸引“回頭客”。如果長期食用這些食品會(huì)使人出現(xiàn)虛汗、乏力、面黃肌瘦、精神萎靡等[3]。2009年監(jiān)管部門規(guī)定罌粟殼禁止添加于火鍋食品中，2011年又將禁用的產(chǎn)品類別范圍擴(kuò)大為“火鍋底料及小吃類食品”，并列出主要成分為“罌粟堿、那可汀、可待因、嗎啡”，從而有效保證人們飲食安全。

目前罌粟殼生物堿的主要檢測方法有光譜法（如分光光度法）、色譜法（如薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法）、電泳法、免疫分析法、質(zhì)譜法（如氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜質(zhì)譜法）等方法。這其中分光光度法只能對(duì)嗎啡定性和半定量測定；薄層色譜法易受干擾；電泳法重現(xiàn)性差，多作為輔助檢測方法；免疫分析法抗體保存時(shí)間有限，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜法不適于難揮發(fā)、強(qiáng)極性和易熱解化合物的檢測，而液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度、準(zhǔn)確度高，精密度好，可進(jìn)行痕量分析，各組分無需基線分離。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中研究者已經(jīng)對(duì)醬鹵肉[4]、火鍋底料[5]、羊肉湯及湯料[6]、烹調(diào)香料[7]、藥酒[8]和植物油[9]中5種罌粟殼生物堿成分進(jìn)行了檢測，但是還有一種備受消費(fèi)者喜愛且容易越吃越上癮的食品——方便面至今沒有檢測報(bào)道，故本研究從方便面切入，以固相萃取為凈化手段，結(jié)合UPLC-MS/MS建立了方便面及其料包中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因5種生物堿的檢測方法，準(zhǔn)確度高、檢出限低，二級(jí)質(zhì)譜可有效避免假陽性的出現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

方便面：均來自于政府組織的農(nóng)村地區(qū)流通環(huán)節(jié)食品安全專項(xiàng)抽檢中的方便面樣品，其中B品牌、J品牌和K品牌各抽出10個(gè)，共計(jì)30個(gè)待測樣品，并按照GB/T 5009.1—2003的要求制備樣品。

1.2 試劑

甲醇（CH3OH，HPLC級(jí)）和乙腈（ACN，HPLC級(jí)）均購買于OCEANPAK公司；鹽酸（分析純，AR）和氨水（AR）均購買于煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；正己烷（農(nóng)殘級(jí)）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲酸（HPLC級(jí)）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸（HPLC級(jí)）：西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸罌粟堿（1 μg/mL）、鹽酸那可?。? μg/mL）、蒂巴因（1 μg/mL）、嗎啡（50 μg/mL）、 可 待 因（50 μg/mL）、 嗎 啡 -D3（100 μg/mL）和可待因-D3均購買于MEDJEN LLC公司；MCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別精密移取1 μg/mL罌粟堿、那可丁和蒂巴因溶液和50 μg/mL嗎啡和可待因溶液各1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為100 μg/L和嗎啡、可待因濃度為5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

混合內(nèi)標(biāo)工作液：分別精密移取嗎啡-D3和可待因-D3內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（100 μg/mL）各1.00 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到嗎啡-D3、可待因-D3的濃度均為1.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），正離子電噴霧離子化（ESI+），離子化電壓為5 500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣壓力為35 psi，霧化氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為50 psi，各化合物的檢測離子對(duì)、碰撞能量（Collision Energy，CE）、去簇電壓（Declustering Potential，DP）、射入電壓（Entrance Potential，EP）和碰撞室射出電壓（Collision Cell Exit Potential，CXP）等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種罌粟殼生物堿的化學(xué)信息、保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Luna? Omega C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相；含0.1%甲酸水溶液為A相，甲醇為B相；梯度洗脫程序：0～1.00 min，70%A；1.00～3 min，70%A→10%A；3～5 min，10%A；5～ 5.1 min，100%A → 70%A；5.1～ 6.5 min，70%A；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，依次加入40 μl內(nèi)標(biāo)工作液和20 mL ACN-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液，渦旋混勻5 min，超聲 10 min，低溫（4 ℃）8 000 r/min離心 5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入20 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋振蕩2 min，低溫10 000 r/min離心3 min，下層液體待凈化。取MCX固相萃取柱，使用前一次用6 mL水、6 mL ACN活化，準(zhǔn)確移取5 mL下清液上柱，保持流速每滴1～2 s，然后依次用6 mL水、6 mL ACN淋洗去除雜質(zhì)，用6 mL 5%（V/V）氨水乙腈洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，40 ℃氮吹至干，加入1.00 mL CH3OH-0.1%甲酸水（3∶7，V/V）定容，過0.22 μm濾膜后上機(jī)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

5種生物堿均為堿性化合物，酸性環(huán)境中易溶于水，因此可用酸性溶液進(jìn)行提取，提取液用有機(jī)溶劑萃取去除脂溶性雜質(zhì)，再用固相萃取柱進(jìn)行深度凈化，最后洗脫液旋干復(fù)溶過膜上機(jī)測定。本實(shí)驗(yàn)分別用0.1 mol/L HCl溶液、1%醋酸溶液、ACN-0.1 mol/L HC（l1∶1，V/V）溶 液、ACN-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液、CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶1，V/V）溶液和CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液進(jìn)行加標(biāo)回收，結(jié)果表明（圖1），使用0.1mol/L HCl溶液和1%醋酸溶液進(jìn)行提取時(shí)5種化合物的回收率基本上低于50%，回收效果較差，當(dāng)使用ACN-0.1mol/L HC（l1∶1，V/V）溶 液、CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶1，V/V）溶液和CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液提取時(shí)嗎啡的回收效果較差，回收率小于50%，這可能是由于在前處理過程中出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，當(dāng)使用ACN-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液進(jìn)行提取時(shí)回收率均大于80%，雖有乳化現(xiàn)象的發(fā)生，但可以通過低溫高速離心盡量降低損失，故本實(shí)驗(yàn)最終將ACN-0.1mol/L HC（l1∶4，V/V）作為提取液。

圖1 不同提取溶液下5種生物堿的回收率

前處理過程中還有一項(xiàng)任務(wù)就是盡可能地去除溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)，食品樣品種類多，基質(zhì)復(fù)雜，要建立一個(gè)適合所有樣品的高效統(tǒng)一的凈化方法實(shí)屬不易，因此實(shí)驗(yàn)過程中提取液凈化后氮吹去除乙腈，然后再用初始流動(dòng)相復(fù)溶，以此來減小溶劑效應(yīng)；同時(shí)為更好地降低基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程中不同品牌的方便面使用不同的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外對(duì)于凈化方式而言，DB 31/2010—2012[10]和 BJS 201802[11]中加無水醋酸鈉、無水硫酸鎂的主要作用是除水和促進(jìn)生物堿從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相，提取凈化效率有待研究[12-13]；還有學(xué)者[14]采用QuEChERS法凈化，此法的確簡便快捷，但是PSA能強(qiáng)力吸附嗎啡，C18可吸附罌粟堿、蒂巴因、嗎啡、可待因?qū)е禄厥章瘦^低，提取后直接進(jìn)樣會(huì)使基質(zhì)干擾物增多；固相萃取是較為常見的凈化手段，文獻(xiàn)報(bào)道[15]使用C18柱嗎啡無保留，HLB柱嗎啡和那可丁無保留，由于5種生物堿極性較大，故可使用MCX和PCX來凈化，實(shí)驗(yàn)中對(duì)比二者的凈化效果，MCX略優(yōu)于PCX，故最終采用MCX來凈化。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

實(shí)驗(yàn)中以基質(zhì)匹配的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將空白樣品提取液作為稀釋液，精確配制0.01～10.0 μg/L的罌粟堿、那可丁和蒂巴因的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，0.1～100.0 μg/L的嗎啡和可待因的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（其中含嗎啡-D3和可待因-D3均為10.0 μg/L），各取5 μL上機(jī)測試，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，罌粟堿、那可丁和蒂巴因以峰面積為縱坐標(biāo)，嗎啡和可待因以峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程、線性系數(shù)和線性范圍見表2，結(jié)果表明罌粟堿、那可丁和蒂巴因在0.01～10.00 μg/L范圍內(nèi)，嗎啡和可待因在0.1～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)（r2）＞0.999 8，這表明該法適用于方便面中5種罌粟殼類生物堿的檢測。一般以信噪比（S/N）為3的含量定為方法的檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10的含量定為方法的定量限（LOQ），5種生物堿的檢出限和定量限見表2，檢出限介于0.21～1.24 μg/kg，定量限介于0.66～4.65 μg/kg。

表2 5種生物堿的線性方程、線性系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.3 回收率和精密度

取空白樣品（檢測結(jié)果為陰性的樣品），每份稱取2.0 g樣品，分別加入低、中、高3個(gè)水平（其中罌粟堿、那可丁和蒂巴因的添加濃度為0.10 μg/kg、0.20 μg/kg和 0.40 μg/kg，嗎啡和可待因的添加濃度為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，每個(gè)濃度平行6份，按照1.3.4的方法進(jìn)行前處理制得待測溶液，上機(jī)檢測含量，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示（表3），在3種不同品牌的方便面中5種生物堿的回收率為72.02%～110.09%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為（RSD）為1.05%～4.25%，說明該方法能夠滿足不同方便面樣品的分析要求。具體來看嗎啡和可待因的回收率（85.19%～110.09%）要明顯優(yōu)于罌粟堿、那可丁和蒂巴因的回收率（72.02%～107.21%），這可能是因?yàn)閱岱群涂纱虿捎脙?nèi)標(biāo)法定量，能夠很好地減小基質(zhì)效應(yīng)，而其余罌粟堿、那可丁和蒂巴因雖然采用基質(zhì)匹配標(biāo)曲外標(biāo)法定量，但還會(huì)或多或少的受到基質(zhì)干擾，而這一點(diǎn)在3種化合物0.10 μg/kg下的加標(biāo)回收時(shí)尤為明顯，因此以后的實(shí)驗(yàn)中可以采取其他方式（如在線稀釋、開發(fā)內(nèi)標(biāo)定量法等）近一步降低基質(zhì)效應(yīng)。

表3 5種生物堿在不同品牌方便面及不同加標(biāo)濃度下的回收率和精密度（n=6）

2.4 二級(jí)質(zhì)譜及其譜庫建立

在實(shí)際工作中，由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，傳統(tǒng)質(zhì)譜分析的MRM工作模式很容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致保留時(shí)間和離子比率有偏差，或出現(xiàn)“假峰”，產(chǎn)生假陽性，干擾判斷。為克服此弊端，實(shí)驗(yàn)利用SCIEX復(fù)合質(zhì)譜QTRAP系統(tǒng)獨(dú)有的復(fù)合掃描模式MRM-IDA-EPI，即三重四極桿和線性離子阱的預(yù)掃描方式（Survey Scan）相結(jié)合觸發(fā)增強(qiáng)離子掃描（EPI），可以在一針進(jìn)樣的同時(shí)獲得MRM色譜峰和增強(qiáng)型二級(jí)碎片，其中MRM色譜峰用來定量，EPI不同能量符合二級(jí)譜圖形成“指紋”圖譜，實(shí)現(xiàn)搜庫和確證，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)過程中取5種生物堿和兩種內(nèi)標(biāo)物溶液單標(biāo)（濃度為5 μg/L）依次進(jìn)樣，MRM-IDA-EPI采集模式，將得到的標(biāo)準(zhǔn)譜圖和化合物信息加入數(shù)據(jù)庫中，建立譜庫并逐一對(duì)假陽性樣品進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本研究構(gòu)建方法對(duì)政府抽檢的3個(gè)品牌的方便面30個(gè)樣品進(jìn)行5種罌粟殼生物堿的定性篩查和定量分析，結(jié)果顯示有3個(gè)樣品（K品牌2個(gè)、B品牌1個(gè)）在保留時(shí)間1.15 min時(shí)嗎啡兩離子對(duì)出峰，4個(gè)樣品（K品牌2個(gè)、J品牌2個(gè)）那可丁有一個(gè)離子對(duì)（414.2/220.2）出峰，4個(gè)樣品（J品牌3個(gè)、K品牌2個(gè)）可待因有一個(gè)離子對(duì)（300.2/165.2）出峰，考慮到保留時(shí)間和離子比率等因素，采集這11個(gè)樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示11個(gè)樣品3種成分的匹配度（Purity）均小于50%，為陰性樣品。

3 結(jié)論

本研究通過使用MCX柱對(duì)方便面樣品進(jìn)行提純凈化，并結(jié)合UPLC-MS/MS的MRM和MRMIDA-EPI采集模式建立了方便面中5種罌粟殼生物堿的分析方法，方法檢出限低，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，精密度好。采用超高效液相色譜，可在6.5 min內(nèi)完成一個(gè)樣品的分析，大大提高了分析效率，同時(shí)建立了5種生物堿的二級(jí)質(zhì)譜圖庫，能有效快速地對(duì)陽性樣品進(jìn)行篩查，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究不但為罌粟殼生物堿檢測方法國標(biāo)的制定提供了參考，而且為依法打擊食品中非法添加罌粟殼行為提供有利依據(jù)，保障消費(fèi)者的合法利益。