涂彩霞，任丹陽，李云巍，張泉，沈建玲，李振坤, 嚴愛花，宗靜，李發(fā)雙，李惠英

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，云南昆明 650228；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南昆明 650101)

β2腎上腺素能受體(ADRB2)由ADRB2基因編碼，廣泛存在于支氣管上皮細胞中[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，ADRB2基因多態(tài)性會影響基因表達、蛋白質(zhì)功能和對配體的應(yīng)答[1-2]，從而影響以該受體為作用靶點的支氣管擴張劑的藥物療效。有研究表明，攜帶ADRB2A等位基因的哮喘患兒使用長效β2受體激動劑(LABA)后，使哮喘惡化風(fēng)險增加[3-4]；也有文獻報道，ADRB2AA基因型哮喘患兒使用長效β2受體激動劑治療效果不佳[5-6]。近年來，抗膽堿能藥物在兒童哮喘中的相關(guān)研究及專家共識在不斷更新[7-11]，但主要集中于它的臨床療效及與β2受體激動劑療效比較等方面，而從藥物基因組學(xué)角度探討抗膽堿能藥物在哮喘患兒中的療效影響的報道卻十分罕見。Park H W等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在成人哮喘患者中ADRB2AA基因型者對抗膽堿能藥物應(yīng)答較好。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)2例ADRB2AA基因型難治性哮喘患兒停用β2受體激動劑、給予噻托溴銨后，哮喘得到明顯控制[13]，對該現(xiàn)象進一步探索，發(fā)現(xiàn)給予吸入性糖皮質(zhì)激素(ICS)與LABA規(guī)律治療時未能控制的難治性哮喘患兒，用藥方案調(diào)整為ICS聯(lián)合吸入性抗膽堿能藥物后，ADRB2AA型患兒哮喘顯著改善[14]。因此，為進一步驗證ADRB2AA基因型對抗膽堿能藥物的應(yīng)答情況，本研究旨在比較首次診斷為哮喘且ADRB2基因型為AA型的患兒對抗膽堿能藥物和LABA的應(yīng)答是否有差異，以期為兒童哮喘的個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年6月昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診收治的首次診斷為哮喘的237例患兒為觀察對象，均同意進行抗哮喘應(yīng)答基因檢測，包括ADRB2(rs1042713)基因型檢測。根據(jù)納入標準，共有80例患兒符合ADRB2(rs1042713) AA基因型。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 哮喘患兒納入標準和排除標準

納入標準：(1)有典型的哮喘癥狀：如反復(fù)喘息、咳嗽、氣促、胸悶等；(2)同時至少具備以下1項：①證實存在可逆性氣流受限；②支氣管激發(fā)試驗陽性；③最大呼氣峰流量(PEF)日間變異率≥13%；(3)常規(guī)胸片檢查無異常；(4)患兒或家長簽署知情同意書；(5)ADRB2(rs1042713, Arg16Gly，46G>A)檢測結(jié)果為AA型；(6)首次診斷哮喘；(7)年齡4～17歲。

排除標準：(1)未按要求按時隨訪；(2)肺功能檢測缺失；(3)哮喘合并肺部感染或肺炎。

1.3 分組與治療

80例ADRB2AA型哮喘患兒，隨機分為試驗組、對照組。試驗組給予ICS [布地奈德吸入粉霧劑(芬蘭Orion Corporation Orion Pharma，Espoo Plant 公司，規(guī)格：200 μg×200吸)，6 歲及以上兒童，每次1～2 吸，每日 1～2 次；或丙酸氟替卡松吸入氣霧劑(西班牙 Glaxo Wellcome S.A.公司，規(guī)格：125 μg×60撳)，每次1～2吸，每日1～2次]聯(lián)合抗膽堿能藥物[吸入用異丙托溴銨氣霧劑(Inhaled ipratropium bromide，ⅡB，德國 Boehringer Ingelheim公司，規(guī)格：20 μg×200撳)，每日 1～2撳，每日3～4 次]。治療8周。

對照組給予ICS與LABA復(fù)合制劑[布地奈德福莫特羅粉吸入劑(瑞士AstraZenecaAB公司，規(guī)格：布地奈德80 μg∶富馬酸福莫特羅4.5 μg)，每次1～2吸，每日2次，或沙美特羅替卡松粉吸入劑(法國Glaxo Wellcome Production公司，規(guī)格：沙美特羅50 μg∶丙酸氟替卡松100 μg)，4歲及以上兒童，每次1～2吸，每日2次]。治療8周。

1.4 評價指標

1.4.1 兒童哮喘控制測試(C-ACT)評分 對納入研究的患兒在治療前及用藥后 8 周進行 C-ACT 問卷評分[15]。C-ACT 是通過回答問題方式進行打分，包括 7 個問題，由患兒獨立完成第1～4題，每個問題評分標準分為0、1、2、3分4個等級；患兒家屬完成后第5～7題，每個問題分為0、1、2、3、4、5分6個等級。哮喘控制情況分級：≤19分未控制、20～22分部分控制、23～27分控制。

1.4.2 肺功能指標 對納入研究的患兒在治療前及治療后8周進行肺功能指標檢查，包括第一秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC、最大呼氣流量(PEF)、最大呼氣中段流量(MMEF)。

1.4.3 藥物應(yīng)答 ΔFEV1≥12%認為對藥物有應(yīng)答，ΔFEV1=[(用藥后FEV1-用藥前FEV1)/用藥前FEV1]×100%[6]。

1.5 ADRB2(rs1042713)基因分型

用熒光染色原位雜交技術(shù)檢測ADRB2(rs1042713)基因型。采集患兒靜脈血于乙二胺四乙酸抗凝管中。取1×NH4Cl(北京華夏時代)1 000 μL，加入血液樣本200 μL，混勻、靜置、離心，保留沉淀，加入核酸純化試劑(北京華夏時代)，混勻、靜置，加到ADRB2(rs1042713)測序反應(yīng)通用試劑(北京華夏時代)中，上機檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件。對本研究篩選時的樣本檢測結(jié)果進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，P>0.05時，符合該遺傳平衡；采用成組t檢驗對兩組各指標進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用χ2檢驗對兩組藥物應(yīng)答情況進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗

共237例哮喘患兒進行ADRB2(rs1042713)基因型檢測， GG 39例、GA 117例、AA 81例，基因型實際頻數(shù)與Hardy-Weinberg的理論頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.09，P>0.05)，見表1。

表1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.2 治療前兩組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、C-ACT評分、肺功能指標比較

符合納入標準的80例ADRB2(rs1042713)基因型為AA型患兒中，3例未按要求隨訪，因此只有77例患兒(試驗組39例，對照組38例)納入統(tǒng)計。兩組患兒各指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 ADRB2(rs1042713)AA型哮喘患兒入組時一般情況比較

2.3 治療后兩組C-ACT評分、肺功能指標比較

治療8周后，試驗組C-ACT評分、FEV1、FVC、PEF、MMEF水平改善較大，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。提示在ADRB2(rs1042713)AA基因型患兒中，試驗組哮喘控制情況優(yōu)于對照組。

表3 ADRB2(rs1042713)AA型哮喘患兒治療后兩組BMI、C-ACT評分、肺功能指標比較

2.4 試驗組與對照組藥物應(yīng)答情況比較

對兩組藥物應(yīng)答情況進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，試驗組39例哮喘患兒中18例ΔFEV1≥12%，提示有應(yīng)答，對照組38例哮喘患兒中7例ΔFEV1≥12%，提示有應(yīng)答。χ2檢驗結(jié)果顯示試驗組的藥物應(yīng)答率是對照組的3.80倍(OR=3.80，95% CI：1.35，10.68，P<0.05)。

3 討論

哮喘是兒童常見疾病之一[16]。在臨床實踐中，盡管使用ICS+LABA規(guī)范治療仍有10%～20%患兒哮喘控制不佳[17-18]，對于該類患兒可考慮停用LABA，使用替代療法更有益于病情控制[18-19]。但如何識別患兒是否需進行替代治療，應(yīng)選擇何種藥物替代已然成為重點和難點。由于70%的藥物治療應(yīng)答差異是由基因多態(tài)性引起的[17]，因此，從基因多態(tài)性角度研究機體是否對藥物應(yīng)答存在差異是十分必要的。ADRB2(rs1042713)基因多態(tài)性與哮喘發(fā)生風(fēng)險、嚴重程度等相關(guān)性已被大量報道[6，20-23]，與藥物療效相關(guān)性研究較少[5-6，12]，而與抗膽堿能藥物應(yīng)答相關(guān)的研究僅有2篇[12，14]。由于均為G蛋白耦聯(lián)受體的腎上腺素能受體和膽堿能受體作用機制相似，二者互相影響，因此，ADRB2功能改變會影響如膽堿能受體等調(diào)節(jié)氣道收縮的受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及功能[12]。

本研究中39例GG型，117例GA型，81例AA型，基因頻率依次為16.46%、49.37%、34.18%，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(P>0.05)，即所選取樣本具有代表性。C-ACT評分是哮喘治療效果判斷的依據(jù)之一[15]。肺功能測定是哮喘確診和評估病情嚴重程度和控制水平的依據(jù)之一[24]。有研究表明，在AA基因型哮喘患兒中，孟魯司特鈉聯(lián)合吸入性氟替卡松治療組肺功能改善情況較沙美特羅聯(lián)合吸入性氟替卡松治療組大，哮喘控制更佳[5]。本研究結(jié)果與Lipworth B J等[5]研究一致：治療前試驗組與對照組在性別、年齡、BMI、C-ACT評分、肺功能等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但治療后C-ACT、FEV1、FVC、PEF、MMEF均改善較明顯(P<0.05)，提示試驗組較對照組治療效果更佳。此外，有文獻報道可經(jīng)檢測ADRB2基因型來預(yù)測抗膽堿能藥物的應(yīng)答情況[12]，該研究中AA基因型患者的藥物應(yīng)答率為61.9%，而GA和GG基因型的藥物應(yīng)答率只有25.4%。同樣，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)AA型難治性哮喘患兒對抗膽堿能藥物應(yīng)答率為65.7%，GA型僅為34.3%[14]。本研究結(jié)果也表明，試驗組39例AA基因型哮喘患兒中18例有應(yīng)答，對照組38例哮喘患兒中7例有應(yīng)答，試驗組藥物應(yīng)答率是對照組的3.8倍，提示AA 基因型患兒對抗膽堿能藥物應(yīng)答較好。

綜上所述，本研究結(jié)果與Lipworth B J等[5]和Park H W等[12]研究一致，即ADRB2(rs1042713)基因多態(tài)性與藥物治療應(yīng)答有相關(guān)性，且AA基因型對抗膽堿能藥物應(yīng)答較長效β2受體激動劑好。提示在患兒用藥前進行該基因檢測，可作為藥物選擇的參考指標，為抗膽堿能藥物在兒童哮喘的個體化治療、哮喘患兒的哮喘控制及生活質(zhì)量改善等方面提供依據(jù)。