張紅艷， 冉淦僑， 韓姍姍， 殷 紅， 譚建新， 張 強*

（1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安710043；2.陜西省酶工程技術研究中心，陜西 西安710043；3.陜西樂麗鑫生物科技有限公司，陜西 渭南714005）

發(fā)酵作為一種重要的中藥炮制方法，其目的是改變原有藥性，產(chǎn)生新的治療作用。發(fā)酵后的中藥制劑具有去毒存效、增強藥效、提高中藥提取率等作用[1]。中藥的有效成分主要存在于植物細胞中，被細胞壁等組織包裹在細胞內(nèi)部，而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶系可以將植物細胞壁降解，促使有效成分更易釋放，從而起到增加藥效的作用。

傳統(tǒng)發(fā)酵炮制通常是利用環(huán)境中的野生微生物對藥渣或藥液進行自然發(fā)酵，存在條件簡陋、易染雜菌、發(fā)酵質(zhì)量難以保證等缺點[2]。

現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術是利用益生菌和酶特有的生物轉(zhuǎn)化能力，使中草藥的有效成分被充分提取，不僅能減毒增效，還能產(chǎn)生新的易被人體吸收的活性物質(zhì)[3]。

國內(nèi)許多研究者[4-9]對中藥發(fā)酵進行了研究，結(jié)果表明中藥發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、多糖以及總黃酮、總皂苷等都有不同程度的增加。潘楊等[10]研究表明發(fā)酵炮制可使中藥巴豆的毒性降低。蘇建樹等[11]研究發(fā)現(xiàn)川烏、附子經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，烏頭堿、次烏頭堿等毒性物質(zhì)顯著減少。以上大多數(shù)研究都是采用單一菌株進行發(fā)酵或者是固體發(fā)酵，對多菌株多級液體發(fā)酵中藥的研究較少。

中藥方劑JGZF是由藥食同源組分配比煎熬而成。JGZF藥液含有牛膝皂苷、蛻皮甾酮、齊墩果酸及其衍生物、地骨皮甲素、菟絲子糖苷酸、肉桂酸、檸檬酸、壬二酸、棕櫚酸甲酯、杜仲木脂素、L-酪氨酸、精氨酸、金絲桃苷等天然活性成分，同時富含鈣、鐵、鋅、鎂等多種微量元素。作者采用3種方式（直接煎熬、自然發(fā)酵、人工發(fā)酵）對JGZF進行處理，對比不同處理方式下JGZF藥液中微量元素、抗氧化活性、抑菌活性以及其他藥效成分的變化，旨在考察不同的發(fā)酵炮制方法對JGZF方劑的功能活性及有效組分的影響，為今后發(fā)酵炮制技術在JGZF方劑中的工業(yè)化應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 中藥方劑JGZF桂圓、杜仲、蒺藜、山藥、菟絲子、枸杞、當歸、懷牛膝、魚鰾，按一定比例混合粉碎而成，由陜西樂麗鑫生物有限公司提供。

1.1.2 菌種產(chǎn)朊假絲酵母 （Candida utilisCICC31126）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen GIM2.137）、 植 物 乳 桿 菌（Lactobacillus plantarumCICC20265）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseiCGMCC1.574）、 青 春 雙 歧 桿 菌（Bifidobacterium adolensentisCICC6176）：由陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所保藏提供；高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基 （g/L）：麥芽膏粉130，pH 6.4±0.1；強化羧菌培養(yǎng)基（g/L）：蛋白質(zhì)10.0牛肉粉10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，pH 6.8±0.1（25℃）；MRS肉汁培養(yǎng)基（g/L）：蛋白質(zhì)10.0，牛肉粉8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氫二鉀2.0，檸檬酸氫二銨2.0，乙酸鈉5.0，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.04，吐溫80 1.0，pH 5.7±0.2（25℃）。

1.2 實驗設備

RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海秋佐科學儀器有限公司產(chǎn)品；FL-30流水式中藥粉碎機：瑞安市富力中藥機械廠產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 直接熬制取1kg中藥按配方比例混合粉碎后，按質(zhì)量比1∶2加入飲用水浸泡煎熬兩次，濾網(wǎng)粗濾后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60℃）濃縮藥液至1 L，離心 （10 000 r/min，20 min）后滅菌 （121℃，20 min），得到直接熬制的中藥原液。

1.3.2 自然發(fā)酵取1 kg中藥按配方比例混合粉碎后，按質(zhì)量比1∶4加入飲用水浸泡1 h后用食醋調(diào)pH至4.8～5.0，加入復合酶粉（8 g/L），37℃酶解過夜，酶解后的中藥按上述方法煎熬兩次，濾網(wǎng)粗濾后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60℃）濃縮藥液至1 L，離心（10 000 r/min，20 min）后滅菌（121℃，20 min），得到中藥酶解原液。

將酶解后的藥液倒入已滅菌的玻璃發(fā)酵罐中，室溫下自然發(fā)酵5周。定期取樣檢測營養(yǎng)活性成分。

1.3.3 人工發(fā)酵取1 kg中藥按配方比例混合粉碎后，按1.3.2制備中藥酶解原液，按比例將產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、面包酵母（質(zhì)量比為2∶1∶1）接入到上述的酶解中藥原液中，30℃好氧發(fā)酵7 d（有濃郁的酒香味道）。好氧發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵液進行滅菌（121℃，滅菌20 min），再按比例接入植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、青春雙歧桿菌（質(zhì)量比為1∶1∶1），37℃，厭氧（靜置）發(fā)酵7 d。厭氧發(fā)酵結(jié)束后，將中藥發(fā)酵液按之前方法煎熬兩次，兩次煎熬的藥液混合在一起，離心（10 000 r/min，20 min）去除沉淀，上清經(jīng)雙層濾紙過濾后滅菌（121℃，20 min），得到人工發(fā)酵的中藥原液。

1.4 指標檢測

發(fā)酵樣品外包檢測全部冷鏈配送，微量元素檢測由陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所渭南大荔基地完成，抗氧化活性檢測由杭州晶百檢測技術有限公司完成，基于代謝組的中藥有效成分由上海阿趣生物科技有限公司完成。

1.4.1 微量元素檢測微量元素檢測參照《食品中鈣的測定GB5009.92—2016》《食品中鐵的測定GB5009.90—2016》《食品中鎂的測定GB5009.241—2017》《食品中銅的測定GB5009.13—2017》《食品中鋅的測定GB5009.14—2017》等標準。

1.4.2 抗氧化活性成分檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測：參考《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定GB/T5009.171—2003》；清除DPPH自由基能力的測定：參照文獻[12]進行；羥基自由基清除作用的測定：參照文獻[13]進行；總多酚的測定：參考文獻[14]進行；抑菌活性的測定：牛津杯瓊脂擴散法[15]?；诖x組的中藥有效成分分析：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對JGZF中微量元素質(zhì)量濃度的影響

微量元素是中草藥組分的重要組成部分，其不僅可以作為人體必需的營養(yǎng)物加以補充，還可能具有特殊的生物活性[16]。微量元素除了游離移動狀態(tài)存在形式，還有一部分主要存在于植物的細胞壁中。

對直接熬制、自然發(fā)酵以及人工發(fā)酵3種方式得到的JGZF藥液的5種常見微量元素質(zhì)量濃度進行檢測，結(jié)果如圖1所示。JGZF人工發(fā)酵液中微量元素質(zhì)量濃度順序為：鈣（10.23 mg/L）＞鐵（5.74 mg/L）＞鎂（2.73 mg/L）＞鋅（1.91 mg/L）＞銅（0.24 mg/L）。跟直接熬制相比，JGZF經(jīng)發(fā)酵（自然發(fā)酵和人工發(fā)酵）處理后，微量元素（鈣、鐵、鋅、銅）的含量得到了顯著提高。由于兩種發(fā)酵方式在熬制前均有浸泡和酶解的步驟，充分的浸泡以及復合酶對藥材中的纖維素及半纖維素等物質(zhì)的降解，再加上發(fā)酵過程中微生物的快速生長也會促使JGZF溶出更多的微量元素。結(jié)果顯示，人工發(fā)酵與直接熬制相比，鋅元素提高了7.3倍，銅元素提高了6.8倍，鐵元素提高了3.7倍，鈣元素提高了2.2倍。

圖1 不同處理方式對JGZF中微量元素質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effects of different treatments methods on the contents of trace elements in JGZF

2.2 不同處理方式對JGZF體外抗氧化活性的影響

中藥的酚類、黃酮、生物堿、多糖、皂苷等有效成分均具有較好的抗氧化活性，可調(diào)節(jié)和增強機體特異性及非特異性免疫功能，抑制自由基的產(chǎn)生，或直接對抗自由基對細胞及組織的損傷作用[17]。實驗采用紫外-可見分光光度計檢測藥液的過氧化物歧化酶SOD活性、DPPH自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力以及總多酚含量來評價不同處理方式對JGZF體外抗氧化活性的影響。

本實驗條件下，自然發(fā)酵方式的JGZF藥液中生長的微生物經(jīng)鏡檢主要是酵母菌和少許雜菌，而人工發(fā)酵好氧階段接入復合酵母菌，厭氧階段接入復合乳酸菌。酵母菌本身就能代謝出具抗氧化功能的甘露聚糖等物質(zhì)，而且微生物在發(fā)酵代謝過程中分泌的胞外酶可將藥物成分分解轉(zhuǎn)化，會產(chǎn)生種類豐富的初生或次生代謝產(chǎn)物，有些代謝產(chǎn)物本就是很好的活性物質(zhì)[18]。此外，以JGZF中藥液中的一些代謝產(chǎn)物為前體，再經(jīng)過一系列酯化、氧化、葡萄糖基化等多種生物轉(zhuǎn)化途徑后，也會促使生成新的活性成分。由圖2可見，跟直接熬制相比，JGZF經(jīng)自然發(fā)酵和人工發(fā)酵處理后，SOD活性和羥基自由基的清除能力均有提高。此外人工發(fā)酵的另外兩個抗氧化活性指標（DPPH自由基的清除能力和總多酚含量）也有顯著提高，分析原因如下：厭氧階段接入的乳酸菌具有抵抗氧脅迫、調(diào)控信號通路途徑、清除自由基系統(tǒng)、抑制脂質(zhì)過氧化，具有一定的抗氧化能力[19]。人工發(fā)酵接入的菌種更有針對性，采用好氧與厭氧微生物的多級發(fā)酵方式更有利于抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生和富集。

圖2 不同處理方式對JGZF中活性成分的影響Fig.2 Effects of different treatments methods on the active ingredients in JGZF

檢測結(jié)果顯示，JGZF人工發(fā)酵液中的體外抗氧化活性結(jié)果為：SOD活性35.7 U/mL，DPPH自由基的清除能力51.4%，羥基自由基的清除能力117.6%，總多酚質(zhì)量濃度為5.65×103μg/mL。與直接熬制相比，SOD活性提高了1.5倍，DPPH自由基的清除能力提高了2.2倍，羥基自由基的清除能力提高了4.2倍，總多酚含量提高了2.2倍。

2.3 不同發(fā)酵方式對JGZF抑菌活性的影響

食源性疾病對人類健康造成嚴重的危害，有60%以上的食源性疾病為細菌性致病菌污染食物所致[20]。采用牛津杯瓊脂擴散法測算JGZF藥液對4種標準菌株（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、志賀氏菌、沙門氏菌）的抑菌圈直徑，考察3種不同處理方式（直接熬制、自然發(fā)酵、人工發(fā)酵）對JGZF中藥液抑菌活性的影響。

結(jié)果如圖3所示，跟直接熬制相比，自然發(fā)酵JGZF對沙門氏菌和大腸桿菌的抑制效果得到了顯著提高。其中，對沙門氏菌的抑菌效果提高了2.5倍，對大腸桿菌的抑菌效果提高了2.3倍。而對志賀氏菌的抑菌效果幾乎不變，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性略有下降。人工發(fā)酵JGZF和直接熬制相比，沙門氏菌的抑菌效果提高了2.2倍，大腸桿菌的抑菌效果提高了1.9倍，而志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果卻略有降低。

圖3 不同發(fā)酵方式對JGZF抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different treatments methods on antibacterial activity of JGZF

對結(jié)果分析可知，酶降解纖維素、木質(zhì)纖維素和益生菌發(fā)酵可促進藥液釋放更多的抑菌活性成分，而且益生菌自身代謝系統(tǒng)有可能產(chǎn)生了新的抗菌活性物質(zhì)[21]，例如厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸、丁酸等一些有機酸[22]，也可能是能增強藥液抑菌活性的原因之一。此外，發(fā)酵過后部分抑菌活性有所降低的原因推測可能與微生物將一些抑菌活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無活性的物質(zhì)有關。綜上所述，中藥組分和選用的菌種是直接影響中藥發(fā)酵液具體抑菌功能的兩大因素。

2.4 不同處理方式對JGZF主要有效組分的影響

中藥發(fā)酵炮制過程也是中藥化學成分變化及藥效偏轉(zhuǎn)的過程，單一化學成分研究很難反映炮制產(chǎn)品整體質(zhì)量的變化。而對中藥液進行高通量檢測，運用植物代謝組學技術對海量數(shù)據(jù)進行模式識別，可以對炮制品化學物質(zhì)基礎進行全面研究[23]。作者采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對藥液樣品進行數(shù)據(jù)檢測、提取、分類及識別，重在考察不同處理方式對JGZF主要有效組分的影響。

經(jīng)檢測，人工發(fā)酵JGZF中最多的有效成分如圖4所示，依次為：牛膝皂苷＞檸檬酸＞壬二酸＞蛻皮激素＞齊墩果酸＞肉桂酸＞金盞花苷E＞蒺藜皂苷K＞菟絲子糖苷酸A3＞地骨皮甲素＞甜菜堿（三甲基甘氨酸）＞香豆素糖苷＞竹節(jié)參皂苷IVA＞山奈酚3-龍膽雙糖苷＞硼替佐米（二肽）＞棕櫚酸甲酯＞川芎內(nèi)酯＞L-酪氨酸＞肉桂丙烯醛＞菟絲子糖苷酸A2。將上述20種主要的有效成分進行歸類，詳見表1。

圖4 不同處理方式對JGZF主要有效組分的影響Fig.4 Effects of different treatments methods on the main medicinal ingredients of JGZF

表1 人工發(fā)酵JGZF中的主要藥效成分Table 1 Main medicinal ingredients in artificially fermented JGZF

由圖4還可以看出，牛膝皂苷和檸檬酸是JGZF人工發(fā)酵液中含量最高的兩種藥效物質(zhì)，含量對比：人工發(fā)酵＞直接熬制＞自然發(fā)酵，分析原因可能跟酶解過程增加牛膝皂苷的溶出以及人工發(fā)酵接入乳酸菌可促使葡萄糖轉(zhuǎn)化成部分檸檬酸[24]有關。而自然發(fā)酵的微生物生長除了酵母菌還會有其他雜菌，這可能是導致牛膝皂苷前體被降解的原因。同時也能看出蛻皮激素、香豆素糖苷、異麥芽糖、金絲桃苷等在兩種方式發(fā)酵后比直接熬制的含量降低，應該跟兩種發(fā)酵中都存在酵母菌有關，具體機理和轉(zhuǎn)化途徑待進一步研究分析。

人工發(fā)酵前后JGZF藥液中藥效成分的變化結(jié)果如圖5所示。L-苯丙氨酸（人體必需氨基酸）、黃芩素（抗炎）、色胺（血清張力素）、硬脂酸（潤滑液）、Tribestin（睪丸激素）和Prototribestin（睪丸激素）的含量增加了上億倍；Parvispinoside C（蒺藜皂苷）的含量增加了上千倍；雙氯非那胺（青光眼藥）和桃葉珊瑚苷（護肝）的含量增加了數(shù)百倍。同時，人工發(fā)酵處理后某些物質(zhì)的含量也被降低了。比如，五味子苷B（蒺藜皂苷，活血化瘀、通經(jīng)活絡）、去甲基蟛蜞內(nèi)酯（香豆素，抗炎）、7-羥基香豆素（解痙鎮(zhèn)痛）和脫乙酰谷氨酸（抗炎鎮(zhèn)痛）的含量降低了上億倍；槲皮素-3-O-木糖苷（刺激神經(jīng)中樞）、甘油二酯、紫云英（黃芪素，抗炎、抗氧化）、氯法齊明（抗炎藥）、蘆丁、多肽、氨基香豆素（抗菌藥）和松酯醇二葡萄糖苷（杜仲木脂素，鎮(zhèn)痛藥）的含量降低了數(shù)百倍。

圖5 人工發(fā)酵前后JGZF中有效成分的變化Fig.5 Changes of medicinal ingredients in JGZF before and after artificial fermentation

3 結(jié)語

1）跟直接熬制相比，中藥方劑JGZF經(jīng)自然發(fā)酵和人工發(fā)酵處理后，其微量元素鋅、銅、鐵和鈣的含量得到了顯著提高，這是由于自然發(fā)酵和人工發(fā)酵方式中浸泡、酶解步驟以及微生物的快速生長促進了藥液中微量元素的溶出。

2）人工發(fā)酵能顯著提高JGZF的體外抗氧化活性。與直接熬制相比，人工發(fā)酵JGZF藥液中SOD活性提高了1.5倍，DPPH自由基的清除能力提高了2.2倍，羥基自由基的清除能力提高了4.2倍，總多酚含量提高了2.2倍。微生物在發(fā)酵代謝過程中會產(chǎn)生種類豐富的初生或次生代謝活性產(chǎn)物，經(jīng)過一系列酯化、氧化、葡萄糖基化等生物轉(zhuǎn)化途徑后，生成新的活性成分。而且有針對性性的人工接種多級發(fā)酵更有利于抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

3）發(fā)酵后的JGZF中藥液對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌活性更強，但對志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性不變或略有降低。生物酶降解纖維素等、益生菌發(fā)酵均可促使藥液釋放或者產(chǎn)生更多抑菌成分，同時微生物也可能將一些抑菌活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無活性物質(zhì)。

4）基于代謝組學技術的分析，結(jié)果表明JGZF經(jīng)人工發(fā)酵后，人體必需氨基酸L-苯丙氨酸、抗炎物質(zhì)黃芩素等藥效物質(zhì)含量顯著增加；五味子苷B、7-羥基香豆素、農(nóng)藥殘留等含量有顯著降低。中藥發(fā)酵過程會產(chǎn)生或者降解一些藥效物質(zhì)，從而導致藥效含量有不同的變化。有效成分、非有效成分以及其他特殊物質(zhì)與發(fā)酵微生物之間的相互作用機制、生物轉(zhuǎn)化途徑有待更深入的研究。

總體來說，微生物發(fā)酵炮制，尤其是人工定向發(fā)酵可以促進中藥液微量元素的溶出、有利于抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生、增強了藥液對部分致病菌的抑菌活性、提高了部分藥效成分含量并且降低了部分農(nóng)藥殘留，對中藥材的減毒增效具有積極意義。