田慶鑫 張明曉 劉建龍

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重致殘和導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。腦血流量下降會(huì)導(dǎo)致腦缺氧和葡萄糖供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致腦缺血。血液供應(yīng)恢復(fù)會(huì)產(chǎn)生過多的活性氧和炎癥反應(yīng)，可能會(huì)誘發(fā)腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI），加重腦損傷[2-3]。CIRI包含興奮毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡等病理過程[4]。有效的抗炎和抗凋亡藥物，可以抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，改善CIRI[5]。大黃酸是一種天然的蒽醌化合物，其從大黃中分離，參與許多生物學(xué)活動(dòng)，包括抑制活性氧、下調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、促進(jìn)微循環(huán)功能、抑制中性粒細(xì)胞遷移和抗炎作用[6-7]。CIRI期間血腦屏障被破壞，既往研究表明大黃酸能夠穿過被破壞的血腦屏障，抑制腦梗死并改善神經(jīng)功能評(píng)分[8]。大黃酸可能在抗CIRI中發(fā)揮有益作用。然而，大黃酸對(duì)CIRI保護(hù)作用的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚未明確。本研究通過大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）及體外細(xì)胞氧-葡萄糖剝奪與恢復(fù)（oxygen-glucose deprivation and recovery,OGD/R）模型探討大黃酸對(duì)CIRI的影響及潛在機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng) 選擇SPF雄性SD大鼠60只，8～10周齡，250～280 g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]。大鼠飼養(yǎng)于22～24℃恒溫，12 h光照/12 h暗循環(huán)環(huán)境，自由獲取標(biāo)準(zhǔn)水和飼料。本研究方案經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。將SH-SY5Y細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100 IU/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素的 DMEM/F12）中，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 大黃酸（純度≥96%）、氯吡格雷、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose,CMCNa）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA檢測(cè)試驗(yàn)盒購自南京凱基生物技術(shù)公司。磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phospho-phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,p-PI3K）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B or phospho-AKT kinase,p-AKT）、蛋白激酶B（protein kinase B or AKT kinase,AKT）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phospho-mammalian target of rapamycin,p-mTOR）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體購自細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）和四甲基偶氮唑藍(lán)（methlthiazoletrazolium,MTT）購自美國Sigma公司。放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CIRI模型構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為CIRI組、CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組、假手術(shù)組（Sham組）5組，每組12只。其中CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組分別給予氯吡格雷7.5 mg·kg-1·d-1、大黃酸 10 mg·kg-1·d-1或 20 mg·kg-1·d-1灌胃，兩種藥物均溶于0.5%CMC-Na溶液。Sham組和CIRI組給予0.5%CMC-Na溶液灌胃給藥。給藥頻率均為1次/d，連續(xù)7 d。除Sham組外，其他組大鼠采用線栓法通過MCAO構(gòu)建大鼠CIRI模型：麻醉大鼠并手術(shù)暴露頸內(nèi)動(dòng)脈、右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近分叉處剪口將尼龍線栓插入，直至遇到輕微阻力停止插線，線栓插入深度為18 mm，閉塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈腔內(nèi)致局灶性腦缺血2 h后，緩慢拔除尼龍線栓，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈血供，使血流再灌注24 h。Sham組大鼠采用相同的手術(shù)步驟，但不閉塞大腦中動(dòng)脈。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較 缺血再灌注24 h后，采用盲法五分制評(píng)分法檢測(cè)5組大鼠神經(jīng)功能缺損情況，系統(tǒng)評(píng)分如下：無缺損為0分；未能充分伸展手術(shù)對(duì)側(cè)（左側(cè)）軀干和前肢為1分；被提起尾巴時(shí)軀干轉(zhuǎn)向左側(cè)為2分；行走困難，向左側(cè)癱倒為3分；意識(shí)不清，不能自發(fā)行走為4分。

1.3.3 大鼠的血清和腦組織中促炎性細(xì)胞因子水平測(cè)定 所有大鼠采用異氟烷麻醉后摘除一側(cè)眼球取血，血液離心15 min，獲得上清液；大鼠腦組織制成10%的勻漿，離心后取上清液待測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)大鼠的血清和腦組織中促炎性細(xì)胞因子的水平，包括IL-6、IL-1β和TNF-α。操作按ELISA試劑盒說明，在450 nm處測(cè)定各反應(yīng)孔樣品的吸光度（optical density，OD）值，IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平與 OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中各促炎性細(xì)胞因子水平。

1.3.4 大鼠腦梗死區(qū)和腦水腫比例的測(cè)定 取血后立即采用隨機(jī)數(shù)字表法從5組大鼠中各抽取5只，采用頸椎脫臼法處死，剝離大鼠大腦顱骨，分離出腦組織，放在腦切片模具上，將大鼠大腦冠狀面切成2 mm厚切片（除去前端嗅球和后端小腦，每只大鼠大腦缺血再灌注部分可切為5片），以2%TTC在37℃條件下孵育30 min。正常的腦組織被染成紅色，而梗死區(qū)域的腦組織未被染色，觀察染色的腦切片。采用圖像處理軟件image-pro Plus 6.0標(biāo)定和計(jì)算梗死面積比例，腦梗死面積比例=[左側(cè)大腦半球面積-（右側(cè)大腦半球面積 -梗死灶面積）]/左側(cè)大腦半球面積×100%。采用相同方法從5組大鼠中各再抽取5只并處死，迅速切除大腦并置于冰上，立即稱取腦組織濕重（ww），60℃干燥48 h得到干重（dw）。計(jì)算腦水腫比例，腦水腫比例（%）=[（ww-dw）/（ww）]×100%。

1.3.5 體外OGD/R模型的建立 將SH-SY5Y細(xì)胞分為8組，分別為：OGD/R組、大黃酸給藥組（10、20、40、80、160、320 μM 大黃酸組）、對(duì)照組（Con組）。將細(xì)胞以5×103/孔的密度接種到96孔板中24 h，然后將OGD/R組、大黃酸給藥組生長(zhǎng)良好的SH-SY5Y細(xì)胞置于無血清和無葡萄糖培養(yǎng)基，于37℃、94%N2、5%CO2和1%O2厭氧室中培養(yǎng)6 h。氧糖剝奪處理后，更換完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2中氧糖恢復(fù)培養(yǎng)6 h，其中大黃酸給藥組分別加入上述不同濃度的大黃酸溶液孵育。結(jié)合文獻(xiàn)，造模后細(xì)胞存活率在30%～60%，即造模成功[9]。同時(shí)，Con組細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中，于含有37℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6 SH-SY5Y細(xì)胞活力測(cè)定 使用MTT試驗(yàn)測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞活力。體外OGD/R模型的建立后，96孔板中每孔細(xì)胞添加20 μl MTT（5 mg/ml）工作溶液，然后在37℃下再孵育4 h。除去介質(zhì)，并將染料晶體溶于150 μl DMSO中。用微孔板分光光度計(jì)在490 nm處檢測(cè)每孔細(xì)胞的吸光度值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=A/A0×100%（A為實(shí)驗(yàn)組吸光度值、A0為Con組吸光度值）。

1.3.7 SH-SY5Y細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子水平測(cè)定 收集SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明，采用與上述大鼠的血清和腦組織中促炎性細(xì)胞因子水平測(cè)定相同步驟，使用ELISA試劑盒檢測(cè)SHSY5Y細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子（包括IL-6、IL-1β和TNF-α）的水平。

1.3.8 大鼠腦組織中和SH-SY5Y細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白水平檢測(cè) 采用Western blot方法，將大鼠腦組織和SH-SY5Y細(xì)胞置于含0.1%苯基甲基磺酰氟的冰冷RIPA裂解液中勻漿提取總蛋白，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用10%含十二烷基硫酸鈉的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜，室溫下在5%脫脂牛奶中封閉2 h。然后將PVDF膜與一抗 p-PI3K（1∶500稀釋）、PI3K（1∶500稀釋）、p-AKT（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶1 000 稀釋）、p-mTOR（1∶5 000 稀釋）、mTOR（1∶5 000 稀釋）和 GAPDH（1∶2 000稀釋）在4℃下孵育過夜。用含有 0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液 [Tris-buffered saline（TBS）containing 0.1%Tween-20，TBST]洗滌 3次后，將 PVDF膜與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（1∶1 000稀釋）在室溫下孵育1 h。免疫反應(yīng)條帶與增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒相互作用，并在凝膠成像系統(tǒng)上可視化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey事后檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 CIRI組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為（3.42±0.51）分，高于Sham組（0.00分），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組和CIRI+20 mg/kg大黃酸組神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為 （1.50±0.52）、（1.92±0.67）、（1.58±0.51）分，均低于 CIRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）。

2.2 5組大鼠血清和腦組織中的促炎性細(xì)胞因子水平比較 見表1。

由表 1可見，CIRI組血清和大腦中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組血清和大腦中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均低于CIRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。

表1 5組大鼠血清和腦組織中的促炎性細(xì)胞因子水平比較

2.3 5組大鼠腦梗死區(qū)面積和腦水腫比例比較 見表2。

由表2可見，CIRI組大鼠的腦梗死區(qū)面積百分比和腦水腫比例均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組腦梗死面積和腦水腫比例低于CIRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。5組大鼠腦梗死切片比較見圖1。

圖1 5組大鼠腦梗死切片比較（CIRI為腦缺血再灌注損傷；Sham為假手術(shù)）

表2 5組大鼠腦梗死區(qū)面積和腦水腫比例比較（%）

由圖1可見，Sham組大鼠腦組織被染為均勻紅色，未見明顯梗死區(qū)域；其他各組均出現(xiàn)不同程度的梗死區(qū)域，其中CIRI組大鼠的腦組織梗死區(qū)域最大。CIRI+氯吡格雷組、CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組腦梗死區(qū)域均小于CIRI組。

2.4 SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力比較 OGD/R組SHSY5Y細(xì)胞活力為（49.50±7.67）%，低于 Con組（102.90±4.59）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。10、20 和 40 μM大黃酸組SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為（71.53±4.99）% 、（83.93±3.12）%、（83.80±5.47）%，均高于OGD/R 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）。80、160和320 μM大黃酸組SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為（64.13±3.29）%、（63.43±3.55）%及（61.74±3.61）%，與OGD/R組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。故選擇濃度為10、20、40 μM的樣品進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.5 5組SH-SY5Y細(xì)胞上清液中促炎性細(xì)胞因子水平比較 見表3。

表3 5組SH-SY5Y細(xì)胞上清液中促炎性細(xì)胞因子水平比較（pg/ml）

由表3可見，OGD/R組 IL-6、TNF-α和 IL-1β水平均高于Con組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；10、20、40 μM 大黃酸組 IL-6、TNF-α 水平均低于OGD/R 組，20、40 μM 大黃酸組 IL-1β 水平均低于OGD/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.6 5組大鼠腦組織和SH-SY5Y細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見圖2。

由圖2可見，CIRI組大鼠p-PI3K、p-AKT和 pmTOR蛋白表達(dá)水平均較Sham組下調(diào)，CIRI+10 mg/kg大黃酸組、CIRI+20 mg/kg大黃酸組p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平較CIRI組上調(diào)。OGD/R組的SH-SY5Y細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平均較Con組下調(diào)。10、20、40 μM大黃酸組SHSY5Y細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平較OGD/R組上調(diào)。

圖2 5組大鼠和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞中磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較[a：5組腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠腦組織中PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖；b：5組SH-SY5Y細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖；Sham為假手術(shù)；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶；p-AKT為磷酸化蛋白激酶B；p-mTOR為磷酸化哺乳動(dòng)物雷中的霉素靶蛋白；GAPDH為內(nèi)參；OGD/R為氧-葡萄糖剝奪與恢復(fù)；Con為對(duì)照]

3 討論

近年來，越來越多證據(jù)表明，腦缺血會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)[10]。腦缺血后，缺血損傷區(qū)存在多種細(xì)胞因子表達(dá)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氧自由基反應(yīng)，可加速缺血后細(xì)胞損傷[7，10]。灌注不足和局部缺血后腦循環(huán)的恢復(fù)可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和神經(jīng)功能受損，本研究選擇MCAO模型模擬大鼠CIRI，先前研究顯示MCAO模型中神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分和腦梗死體積增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸可減輕缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死面積和腦水腫比例，提示大黃酸可能可以減輕CIRI，這與先前的研究一致[12]。

大黃酸作為大黃的一種生物活性化合物，已用于治療腦損傷，但其藥理機(jī)制仍不清楚[12-13]。近期研究提示大黃酸在神經(jīng)炎癥體外模型中顯著降低了炎癥因子的表達(dá)，包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 和誘生型一氧化氮合酶[13]。有研究表明，促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6可能刺激許多下游的氧自由基、細(xì)胞因子、溶酶體酶和其他炎癥介質(zhì)，并導(dǎo)致CIRI[11]。越來越多證據(jù)表明，促炎性細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的含量在缺血再灌注后升高，表明炎癥在缺血再灌注損傷中起著至關(guān)重要的作用[14]。本研究證明了大黃酸可以抑制MCAO誘導(dǎo)的大鼠或OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中大量產(chǎn)生的IL-6、IL-1β 和 TNF-α。

本研究評(píng)估了關(guān)鍵的神經(jīng)炎癥相關(guān)信號(hào)通路來探討大黃酸潛在的抗神經(jīng)炎癥機(jī)制。已有研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑是關(guān)鍵的神經(jīng)保護(hù)信號(hào)通路之一，PI3K/AKT信號(hào)通路在炎癥和氧化應(yīng)激等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。同時(shí)，先前已有研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路的激活對(duì)炎癥起關(guān)鍵作用[16]。PI3K/AKT可抑制NF-κB的活化，從而最終防止炎癥的發(fā)生，因?yàn)榇傺仔约?xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的合成是由NF-κB介導(dǎo)的[17]。PI3K/AKT通路的激活已被證實(shí)可減少炎癥基因，進(jìn)而保護(hù)血管功能，其在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用已被廣泛研究[18]?；罨腁KT可快速激活mTOR等多種分子功能，mTOR是一個(gè)多功能的收集點(diǎn)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞營養(yǎng)、能量供應(yīng)并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。考慮到PI3K/AKT通路的神經(jīng)保護(hù)作用，推測(cè)腦缺血后PI3K/AKT/mTOR通路可能失活。在本文中，大黃酸可激活MCAO大鼠或OGD/R誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞中的 p-PI3K、p-AKT和 pmTOR，提示大黃酸對(duì)神經(jīng)炎性介質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)可能是通過激活PI3K/AKT/mTOR通路完成的。

綜上所述，本研究提示，大黃酸在體內(nèi)和體外有效地減弱了CIRI，其潛在機(jī)制可能與PI3K/AKT/mTOR通路參與抗炎作用有關(guān)。這些結(jié)果表明，大黃酸可能可作為腦缺血再灌注損傷的潛在治療藥物。