溫松，李慎柯，姜東亮

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003； 2.濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 濮陽(yáng) 457001)

肺癌是導(dǎo)致人類癌癥死亡的最常見(jiàn)原因之一[1]。國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示：2015年我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬(wàn)人，死亡約233.8萬(wàn)人，其中肺癌是我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病及死亡的首要因素[2]。扼制我國(guó)肺癌持續(xù)上升的發(fā)病率及死亡率，是減輕癌癥負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵，而提升肺癌的三級(jí)預(yù)防水平是有效降低肺癌發(fā)病率及死亡率的重要手段。癌癥的發(fā)生發(fā)展是由遺傳、表觀遺傳、環(huán)境等因素相互作用的多步驟、異常累積的結(jié)果。1942年Waddington首次確立表觀遺傳學(xué)的概念[3]，而隨著研究的深入，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為表觀遺傳學(xué)是指在基因DNA序列不變的情況下能與基因相互作用且在有絲分裂中可遺傳的變化[4]。表觀遺傳主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、調(diào)控RNA等表觀遺傳修飾，其中DNA甲基化則是基因表達(dá)調(diào)控最主要、最常見(jiàn)且最具有特征性的表觀遺傳修飾方式[5]。目前大量研究已證實(shí)DNA甲基化模式與肺組織癌變及肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]?，F(xiàn)就DNA甲基化與肺癌三級(jí)預(yù)防及預(yù)后的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為肺癌的防治策略提供參考。

1 DNA甲基化

人類基因組中普遍存在DNA甲基化現(xiàn)象，且DNA正常的甲基化狀態(tài)對(duì)機(jī)體細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[7]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基(多以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體)與基因組CpG二核苷酸胞嘧啶的第五位碳原子共價(jià)結(jié)合的表觀遺傳修飾[8]。人類的基因組中CpG存在兩種普遍狀態(tài)：一種是無(wú)規(guī)律的散落于全DNA鏈；另一種則多位于各基因的順式作用元件，呈高度聚集狀態(tài)。這種高度聚集的CpG鏈稱為CpG島，CpG島外的CpG 70%～80%是甲基化的，而CpG島內(nèi)絕大多數(shù)是非甲基化狀態(tài)，這種DNA甲基化模式使各基因的表達(dá)調(diào)控精確有序。人們通過(guò)分析體內(nèi)外細(xì)胞DNA甲基化發(fā)現(xiàn)，DNA的高甲基化狀態(tài)表明基因表達(dá)的抑制/沉默/失活，而低甲基化表明基因表達(dá)的活躍/活化/激活[9-11]。DNA甲基化不僅參與正常哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，還在癌癥形成過(guò)程中起重要作用。有研究證實(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與DNA異常的甲基化密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中DNA的異常甲基化具體表現(xiàn)為全基因組水平的低甲基化及順式作用元件內(nèi)啟動(dòng)子等處CpG島的普遍高甲基化狀態(tài)[12-14]。腫瘤細(xì)胞基因組的這種甲基化現(xiàn)象致使腫瘤細(xì)胞的基因及染色體穩(wěn)定性降低，全基因組原癌基因普遍活化，抑癌基因、DNA修復(fù)基因表達(dá)受抑制或失活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞惡性程度越高，細(xì)胞全基因組的低甲基化程度愈顯著[15-16]?，F(xiàn)有的研究表明肺部細(xì)胞基因組異常的甲基化模式可主動(dòng)或被動(dòng)地促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展[4-6]，但目前DNA異常甲基化與肺癌的確切關(guān)系尚無(wú)廣泛共識(shí)，DNA的異常甲基化可能是肺癌形成的一種誘因，也可能是肺組織細(xì)胞癌變的主要原因或肺組織細(xì)胞癌變中的某一環(huán)節(jié)，仍需進(jìn)一步研究。

2 DNA甲基化與肺癌的一級(jí)預(yù)防

當(dāng)肺部組織細(xì)胞暴露于吸煙、顆粒物、石棉、藥物或慢性炎癥等危險(xiǎn)因素，常發(fā)生包括DNA異常甲基化在內(nèi)的異常表觀遺傳修飾[17-18]。

從1991年至今，美國(guó)癌癥總死亡率下降29%，減少了約290萬(wàn)癌癥死亡人數(shù)，這一良好的成果主要?dú)w功于吸煙人群的減少[19]。吸煙是我國(guó)癌癥總負(fù)擔(dān)的主要構(gòu)成因素，研究顯示吸煙者和從未吸煙者體內(nèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由不同的分子和表觀遺傳機(jī)制驅(qū)動(dòng)[20]，如Baglietto等[21]將吸煙者與非吸煙者進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)僅吸煙者中的半乳糖凝集素-4基因有顯著的高甲基化和表達(dá)下調(diào)；Tam等[22]研究表明細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因的高甲基化與吸煙量和吸煙時(shí)間呈正相關(guān)，與戒煙時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，且在非吸煙者的肺部組織中CDKN2A基因并未出現(xiàn)高甲基化。另有研究表明，吸煙者體內(nèi)F2R樣凝血酶/胰蛋白酶受體3、芳香烴受體、脆性組氨酸三聯(lián)體、CDKN2A、芳香烴受體抑制因子、miR-487b、DPH6(diphthamine biosynthesis 6)和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ信使RNA結(jié)合蛋白3基因的異常甲基化均與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其中DPH6和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ信使RNA結(jié)合蛋白3基因的異常甲基化與非小細(xì)胞肺癌顯著相關(guān)[23]。Stidley等[24]研究發(fā)現(xiàn)，多種維生素、葉酸和綠色蔬菜可預(yù)防吸煙人群氣道組織細(xì)胞基因啟動(dòng)子的異常甲基化，降低肺癌的發(fā)病率。

流行病學(xué)研究表明，空氣污染特別是顆粒物質(zhì)暴露，是獨(dú)立于吸煙外與肺癌發(fā)生和死亡相關(guān)的危險(xiǎn)因素[25]。Tantoh等[26]通過(guò)對(duì)比具有PM2.5差異的中國(guó)臺(tái)灣北部和中部/南部地區(qū)的非吸煙成年人的SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2(SRY-box transcription factor 2,SOX2)基因啟動(dòng)子甲基化狀況發(fā)現(xiàn)，SOX2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可作為工業(yè)空氣污染暴露的潛在生物標(biāo)志物。此外，SOX2啟動(dòng)子的甲基化程度可能反映癌癥發(fā)生的傾向，從而可以早期篩查健康非吸煙者是否處于癌前病變階段。

不同于空氣污染，盡管吸煙相關(guān)的CpG和石棉暴露狀態(tài)相關(guān)的CpG平均甲基化率不同，但這兩種暴露方式的基因組DNA甲基化譜可能有重疊，表明職業(yè)暴露(石棉)與吸煙在肺癌風(fēng)險(xiǎn)方面的相互作用介于相加性與倍增性之間。Kettunen等[27]研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中骨形成蛋白4、G蛋白偶聯(lián)受體135、ZSCAN31(zinc finger and SCAN domain containing 31)、細(xì)胞黏附分子和信號(hào)受體、硝酸鹽調(diào)控基因2、甲狀腺過(guò)氧化物酶和瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道3甲基化的變化與患者癌前的石棉暴露梯度有關(guān)，表明石棉暴露可能與肺癌相關(guān)。另外，鉻及其化合物在焊接、電鍍、顏料、合金制造等化工行業(yè)被廣泛應(yīng)用，研究表明鉻酸鹽暴露可引起肺癌錯(cuò)配修復(fù)基因錯(cuò)配修復(fù)基因1的DNA甲基化累積[28]。

綜上所述，某些基因或基因啟動(dòng)子的異常甲基化可作為肺癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因素及肺癌癌前病變的預(yù)測(cè)指標(biāo)，將DNA甲基化的監(jiān)測(cè)運(yùn)用于肺癌一級(jí)預(yù)防，可為肺癌的一級(jí)預(yù)防提供表觀遺傳學(xué)的理論依據(jù)，從而降低我國(guó)肺癌發(fā)生率，改變肺癌防治“重治輕防”的現(xiàn)狀，促進(jìn)肺癌一級(jí)預(yù)防工作的實(shí)施。

3 DNA甲基化與肺癌的二級(jí)預(yù)防

目前臨床確診的局限期肺癌的5年生存率為57%[19]，轉(zhuǎn)移性肺癌的5年相對(duì)生存率為5%，而大部分患者(57%)在診斷時(shí)已經(jīng)處于疾病晚期[29]。臨床上主要通過(guò)CT和血清腫瘤標(biāo)志物相結(jié)合的方法進(jìn)行肺癌診斷。CT篩查早期肺癌易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，而臨床開(kāi)展的肺癌相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的敏感性及特異性有待提高。即使兩者聯(lián)合也無(wú)法達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)、精準(zhǔn)診斷的目的。

隨著分子診斷技術(shù)的不斷革新，通過(guò)檢測(cè)DNA異常甲基化，特別是基因啟動(dòng)子內(nèi)CpG島的高甲基化檢測(cè)成為目前腫瘤診斷檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。相較于DNA低甲基化，高甲基化異常往往較先出現(xiàn)，具有更高的敏感性[4]。與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras association domain family member 1A,RASSF1A)、CDKN2A，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的腺瘤性結(jié)腸息肉病基因、矮小同源盒基因(short stature homeobox 2,SHOX2)，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的死亡相關(guān)蛋白激酶及與DNA修復(fù)相關(guān)的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶均是研究相對(duì)較多的高甲基化位點(diǎn)。有研究表明，支氣管抽吸物內(nèi)SHOX2的DNA甲基化狀態(tài)可用于肺癌的早期診斷[30]。Kneip等[31]在400多個(gè)血漿樣本中研究了SHOX2甲基化與肺癌早期診斷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其具有較高的靈敏度(60%)和特異度(90%)?；谏鲜鲅芯?，2012年生物標(biāo)志物SHOX2甲基化開(kāi)始應(yīng)用于臨床。有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)肺泡灌洗液中SHOX2與RASSF1A的甲基化狀態(tài)診斷肺癌的靈敏度為71.5%～83.2%，特異度為90.0%～97.4%[32]。Hulbert等[33]通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)早期肺癌患者痰液中速激肽前體1、SOX17和同源盒A簇17基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，對(duì)肺癌早期診斷的特異度為98%。Liang等[34]以循環(huán)腫瘤DNA作為DNA甲基化的檢測(cè)樣本，開(kāi)發(fā)了一種高度敏感的非侵入式診斷檢測(cè)方法，可以區(qū)分肺癌與良性肺結(jié)節(jié)，在實(shí)驗(yàn)階段實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺癌的早期診斷。

綜上，某些特定基因的異常甲基化特異性高，且多發(fā)生于癌前病變或(和)癌變?cè)缙?，是腫瘤早期診斷較為理想的潛在標(biāo)志物，通過(guò)對(duì)其實(shí)驗(yàn)研究有望形成成熟的無(wú)創(chuàng)性肺癌早期診斷技術(shù)，提高肺癌早期診斷率，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診治的目的，對(duì)于肺癌的二級(jí)預(yù)防具有重要意義。

4 DNA甲基化與肺癌的三級(jí)預(yù)防

DNA甲基化可以通過(guò)被動(dòng)和主動(dòng)的方式去除，表明DNA的表觀遺傳修飾是一種動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程[35]，這為從DNA甲基化著手治療肺癌提供了理論上的可能性。但是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在單藥治療肺癌的臨床試驗(yàn)測(cè)試中僅顯示出低活性和低毒性[8]。早期探討的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與化療或與其他靶向治療結(jié)合的療效研究絕大部分無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[36-37]。一項(xiàng)關(guān)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(SGI-110)和組蛋白去乙?；敢种苿┒魈嬷Z特聯(lián)合治療肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，該方案可減輕肺癌的腫瘤負(fù)荷，并對(duì)表觀基因組進(jìn)行重新編程[38]。而Shieh等[39]研究發(fā)現(xiàn)，TMU-35435和5-氮雜-2′-脫氧胞苷在體內(nèi)外可通過(guò)對(duì)抑癌基因和Wnt信號(hào)通路負(fù)調(diào)控基因的再激活，達(dá)到協(xié)同抗腫瘤作用且無(wú)明顯不良反應(yīng)。Niu等[40]通過(guò)甲基化敏感酶切計(jì)數(shù)測(cè)序法對(duì)全基因組DNA甲基化進(jìn)行分析，篩選出60個(gè)異常甲基化基因并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，揭示了γ氨基丁酸B2受體是表皮生長(zhǎng)因子受體19缺失性肺腺癌誘導(dǎo)治療的新表觀遺傳學(xué)靶點(diǎn)。

此外，DNA甲基化不僅可以作為肺癌的治療靶點(diǎn)，還有助于選擇與評(píng)估治療藥物和手段。例如，T-BOX轉(zhuǎn)錄因子2亞家族的甲基化狀態(tài)可以作為非小細(xì)胞肺癌對(duì)抗腫瘤藥物5氮雜胞苷反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)[41]；軸抑制蛋白基因甲基化狀態(tài)可能是預(yù)測(cè)腫瘤放射敏感性的重要因素之一[42]；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的miR-9啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可反映非小細(xì)胞肺癌的放射敏感性[43]。Grasse等[44]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)評(píng)價(jià)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白12 DNA甲基化狀態(tài)可以預(yù)測(cè)肺癌對(duì)卡鉑的耐藥狀況。而Zhang等[45]的研究則發(fā)現(xiàn)去甲基化藥物阿扎胞苷與組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹的小劑量聯(lián)合應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥?？钩绦蛐约?xì)胞死亡受體1/程序性細(xì)胞死亡配體1單抗是非小細(xì)胞肺癌治療的一個(gè)重大突破，而DNA甲基化異常是腫瘤對(duì)宿主免疫活性反應(yīng)的重要決定因素[46]。通過(guò)測(cè)試甲基化抑制劑是否能減少全基因組低甲基化的腫瘤中CpG島的高甲基化狀態(tài)或松動(dòng)異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以恢復(fù)α/β干擾素反應(yīng)和其他免疫調(diào)節(jié)途徑，可以決定是否將表觀遺傳療法與免疫療法相結(jié)合，以進(jìn)一步提升抗程序性細(xì)胞死亡受體1/程序性細(xì)胞死亡配體1單抗藥物對(duì)肺癌的療效[47]。目前最先進(jìn)的表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物是O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基化狀態(tài)，可以預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺和卡莫司汀的反應(yīng)，并已在臨床上成功運(yùn)用[16]，但在肺癌中尚未見(jiàn)報(bào)道。

綜上，特定基因的甲基化有望作為肺癌治療的生物靶點(diǎn)，對(duì)肺癌的治療藥物及治療方案進(jìn)行選擇評(píng)估，改善患者的5年生存率。同時(shí)，針對(duì)肺癌患者DNA異常甲基化的治療方式也將改變肺癌治療的現(xiàn)有模式。DNA甲基化過(guò)程的動(dòng)態(tài)可逆為從DNA甲基化入手治療肺癌提供理論上的可能性。

5 DNA甲基化與肺癌的預(yù)后

肺癌患者的不良預(yù)后與諸多基因的異常甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，這些基因作用于肺癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)方面，包括信息傳遞[跨膜蛋白(transmembrane protein,TMEM)196、TMEM88、軸抑制蛋白、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因]，DNA修復(fù)(人類錯(cuò)配修復(fù)基因1、O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)，細(xì)胞凋亡[死亡相關(guān)蛋白激酶、PCED1B(PC-esterase domain containing 1B)、RASSF1A]，細(xì)胞分化(SOX2、Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶、同源盒A9)，細(xì)胞分裂(CDKN2A)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)基因、組織蛋白酶抑制劑3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5、上皮鈣黏素、肺癌食管癌缺失基因1、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3、F2R樣凝血酶/胰蛋白酶受體3、跨膜絲氨酸蛋白酶4、Egl 9同源物2、黏蛋白4)等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同基因的甲基化狀態(tài)可以揭示相同組織學(xué)類型肺癌患者的預(yù)后，而相同基因的甲基化狀態(tài)也可以評(píng)價(jià)多種類型肺癌患者的預(yù)后[48]。例如，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)、RASSF1A啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)、同源域蛋白同源盒基因的甲基化狀態(tài)均是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[49-51]；TMEM196的甲基化狀態(tài)則是肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌患者共同的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[52]；跨膜絲氨酸蛋白酶4啟動(dòng)子的低甲基化狀態(tài)是早期鱗狀細(xì)胞肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[53]；TMEM88啟動(dòng)子的高甲基化、長(zhǎng)散在核重復(fù)序列1低甲基化是早期非小細(xì)胞肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[16,54]；Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1的甲基化狀態(tài)則與絕大多數(shù)肺癌的預(yù)后相關(guān)[55]。

肺癌患者的預(yù)后與基因甲基化作用相對(duì)應(yīng)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的改變密切相關(guān)。Lin等[56]研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1過(guò)表達(dá)可引起多個(gè)抑癌基因的遺傳改變，而這些抑癌基因的遺傳改變與肺部腫瘤的發(fā)生及其不良預(yù)后密切相關(guān)。Teneng等[57]的研究則表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b過(guò)表達(dá)可加速致癌物質(zhì)在細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)化，并與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

甲基化評(píng)分是預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)。Jeschke等[58]研究表明腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的甲基化評(píng)分獨(dú)立于肺鱗狀細(xì)胞癌患者的其他預(yù)后變量，可以預(yù)測(cè)不同甲基化評(píng)分患者的存活率。而Liu等[59]的研究表明基因組的低甲基化評(píng)分是影響肺癌患者總生存期的獨(dú)立因素。

綜上，DNA甲基化與肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，某些特定基因的甲基化是肺癌患者可靠的預(yù)后指標(biāo)，可以揭示及預(yù)測(cè)肺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性，指導(dǎo)患者的臨床治療，從而延長(zhǎng)肺癌患者的總生存期，具有重要的臨床價(jià)值。

6 展 望

隨著探索的深入，人們對(duì)甲基化與肺癌相關(guān)性的認(rèn)識(shí)越發(fā)完善，但DNA甲基化與肺癌三級(jí)預(yù)防及預(yù)后的研究仍存在有待解決的問(wèn)題：①DNA甲基化與肺癌治療的研究多集中于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑藥物方向，而肺癌的抗低甲基化藥物以及甲基化雙向調(diào)節(jié)藥物相關(guān)研究較少[60]；②現(xiàn)有的DNA甲基化與肺癌患者預(yù)后的研究多為小樣本單中心研究，缺乏綜合性涵蓋所有肺癌類型的大樣本多位點(diǎn)研究，尚未形成系統(tǒng)的預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；③雖然DNA甲基化測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，DNA甲基化的檢測(cè)樣本來(lái)源從組織細(xì)胞、肺泡灌洗液、痰液、血液發(fā)展到呼出氣冷凝液，但各種檢測(cè)樣本和檢測(cè)技術(shù)均有各自的優(yōu)劣，暫無(wú)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方案；④肺癌與DNA甲基化的研究多處于理論研究階段，將DNA甲基化落實(shí)到肺癌三級(jí)預(yù)防及預(yù)后的各個(gè)方面還需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究及臨床論證。總之，DNA甲基化與肺癌三級(jí)預(yù)防及預(yù)后的研究尚處于起步階段，但也不能忽視DNA甲基化在肺癌三級(jí)預(yù)防及預(yù)后方面的重要研究?jī)r(jià)值及良好的應(yīng)用前景。