姬名碩，王曉東，帕麗達(dá)·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830054)

近年來，隨著腫瘤大劑量化療以及造血干細(xì)胞和實(shí)體器官移植的發(fā)展，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)患者逐年增多，目前已成為許多疾病致病和致死的重要病因[1-2]。雖然IFI的診療技術(shù)取得了一定進(jìn)展，但I(xiàn)FI的真菌譜也隨之發(fā)生了變化[3]。以往常見的白色念珠菌感染呈降低趨勢(shì)，而以往并不常見的曲霉菌感染比例上升至第二位[4]。另外，還出現(xiàn)了許多新的真菌致病菌種，這些菌種的毒力和致病機(jī)制目前尚不明確。生物模型作為生命科學(xué)的研究工具，對(duì)于許多學(xué)科的發(fā)展和進(jìn)步至關(guān)重要。蠟螟動(dòng)物感染模型最初用于細(xì)菌病原體的毒力和發(fā)病機(jī)制的研究[5-7]，近年開始應(yīng)用于真菌感染模型。蠟螟作為新的真菌動(dòng)物感染模型，雖然缺乏統(tǒng)一的健康評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)、繁殖條件不統(tǒng)一等會(huì)造成實(shí)驗(yàn)的偏差，但蠟螟動(dòng)物感染模型相較于傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物感染模型生命周期短、價(jià)格低廉、操作簡單且無倫理學(xué)限制，同時(shí)還可以了解真菌感染的全過程和免疫應(yīng)答反應(yīng)，為真菌毒力差異的初步研究、感染后的動(dòng)態(tài)病理變化及體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)的研究提供了一個(gè)可靠的動(dòng)物感染模型。現(xiàn)就蠟螟在真菌感染模型中的應(yīng)用價(jià)值予以綜述。

1 蠟螟模型的建立

蠟螟分布廣泛，隸屬于鱗翅目草螟科蠟螟亞科蠟螟屬[8]。蠟螟的幼蟲越來越多地用于細(xì)菌和真菌感染模型，研究真菌及細(xì)菌感染宿主后的毒力因子和發(fā)病機(jī)制。與傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物模型宿主相比，無脊椎動(dòng)物感染模型的建立和維護(hù)成本更低，更適合大樣本的研究；且蠟螟是蜜蜂的重要害蟲，主要以幼蟲蛀食巢脾，破壞貯藏的巢脾，進(jìn)而侵害蜂群，直接影響蜂蜜的產(chǎn)量和質(zhì)量[8]，因此，蠟螟用于感染模型并不受倫理學(xué)限制。此外，蠟螟還適用于真菌感染模型的研究，其具有如下特征：①蠟螟體積相對(duì)較大(15～30 mm)[8]，易于操作、精確劑量的注射以及收集組織、淋巴血，用于下游的實(shí)驗(yàn)分析；②蠟螟的免疫系統(tǒng)與脊椎動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度同源性，因此具有細(xì)胞和體液免疫功能[9-10]，其體液免疫反應(yīng)包括黑化、血淋巴凝結(jié)以及產(chǎn)生抗微生物肽，而細(xì)胞反應(yīng)則包括吞噬作用和產(chǎn)生大量包囊[11-12]；③蠟螟可以在37 ℃恒溫條件下生長繁殖，這是真菌感染體內(nèi)研究的重要因素[5]。基于以上特點(diǎn)，蠟螟真菌感染模型已初步建立并被科學(xué)界廣泛接受，且已在煙曲霉、白念珠菌、隱性球菌等真菌感染模型的研究中取得了初步成果。

2 蠟螟模型與真菌感染

2.1煙曲霉 煙曲霉是一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，是侵襲性曲霉病的主要致病物種，而IFI是一種與高病死率相關(guān)的全身性疾病[4]。IFI的治療依賴于數(shù)量非常有限的抗真菌藥物。為了擴(kuò)大抗真菌藥物的范圍，確定某種藥物的療效，必須有體外動(dòng)物感染藥物治療的評(píng)估。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯可通過抑制煙曲霉的活性、升高蠟螟淋巴細(xì)胞的自噬水平，以增強(qiáng)蠟螟對(duì)抗煙曲霉的感染，這項(xiàng)研究不僅證明了蠟螟可用于真菌藥物的體外實(shí)驗(yàn)，也為臨床藥物評(píng)估提供了可靠依據(jù)[13-14]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)(endoplasmic reticulum-mitochondria encounter structure，ERMES)是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)，他們借助蠟螟感染模型發(fā)現(xiàn)，ERMES有助于增強(qiáng)煙曲霉的毒力，且抑制ERMES可以減弱煙曲霉病原體的活性[15]。因此，蠟螟感染模型可用于體外真菌感染發(fā)病機(jī)制的研究，為臨床治療提供理論支持。這些研究結(jié)果表明，蠟螟幼蟲可能是研究侵襲性曲霉菌病發(fā)展階段的一個(gè)方便模型。然而，由于哺乳動(dòng)物中的呼吸系統(tǒng)在蠟螟中并不存在，使用蠟螟模型模擬真菌感染肺部后的免疫反應(yīng)無法實(shí)現(xiàn)[15-16]?？梢?，由于蠟螟與哺乳動(dòng)物存在結(jié)構(gòu)上的差異，蠟螟在一定程度上可以取代哺乳動(dòng)物作為體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究模型，但蠟螟作為體外動(dòng)物感染模型還存在一定的局限性。

2.2念珠菌屬 念珠菌屬是免疫功能低下時(shí)IFI的主要病原體，是血液感染的第四大常見原因，其感染的病死率可達(dá)35%以上[17-18]，且不斷有新的變異菌株出現(xiàn)。為了檢測新菌株的毒力和藥物敏感性，需要建立適當(dāng)?shù)哪Ｐ瓦M(jìn)行評(píng)估，這對(duì)于臨床藥物治療至關(guān)重要。有研究通過構(gòu)建白色念珠菌大蠟螟動(dòng)物感染模型成功證實(shí)了白念珠菌不同菌株的毒力和對(duì)感染的免疫反應(yīng)，該研究證實(shí)了大蠟螟可以被白念珠菌感染，且可用于測試不同菌株間毒力的差異[19-20]。此外，白色念珠菌感染大蠟螟藥物的體外實(shí)驗(yàn)也取得了一定進(jìn)展。有研究通過白色念珠菌蠟螟模型證實(shí)，光動(dòng)力療法治療可以延長被白色念珠菌感染的幼蟲壽命[21]。有學(xué)者利用真菌感染蠟螟的淋巴細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中加入活性氧類探針和溶酶體探針，觀察真菌刺激細(xì)胞時(shí)自噬水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性氧類水平升高、溶酶體和菌共定位，說明蠟螟細(xì)胞的自噬性在抗真菌感染中發(fā)揮保護(hù)作用[19]。可見，在念珠菌屬中，無脊椎動(dòng)物模型同樣也可用于初步探討不同菌種的毒力、抗真菌藥物的療效以及宿主感染真菌后的作用機(jī)制。

2.3新生隱球菌 新型隱球菌是一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，在免疫抑制患者中，尤其在人類免疫缺陷病毒感染者和移植受者中可傳播或侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致致命的腦膜炎[22]，并造成每年約60萬人死亡[23]。莢膜是新生隱球菌的重要毒力因子，可維護(hù)菌體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及抵御宿主細(xì)胞免疫的吞噬作用，其他的毒力因子還包括黑色素、分泌性酶等，這些毒力因子可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)[24-25]。此外，新生隱球菌為細(xì)胞內(nèi)的真菌病原體，可在吞噬病原體的細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制。新生隱球菌感染哺乳動(dòng)物后可產(chǎn)生抗微生物肽并誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞發(fā)揮抗菌作用，這些免疫反應(yīng)同樣也存在于無脊椎動(dòng)物中，蠟螟作為無脊椎動(dòng)物，在感染新生隱球菌后可在血淋巴細(xì)胞中裂解并繁殖，這種在哺乳動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中類似的免疫反應(yīng)是蠟螟感染模型用于研究微生物發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)[26]。近年來，有研究通過開發(fā)蠟螟動(dòng)物感染模型研究隱球菌的毒力、宿主感染后的免疫反應(yīng)以及抗真菌化合物的作用發(fā)現(xiàn)，所有隱球菌的菌種在注入蠟螟體內(nèi)后均會(huì)被血細(xì)胞吞噬，但仍會(huì)在宿主體內(nèi)增殖，并將蠟螟殺死，殺滅的速度和程度取決于新生隱球菌菌株以及注射的真菌孢子的數(shù)量；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，無論在新生隱球菌感染前還是感染后，給予復(fù)合抗真菌療法(兩性霉素B+氟胞嘧啶)均較單一療法更能延長蠟螟的存活時(shí)間并減少血細(xì)胞中隱球菌的數(shù)量[27-28]。

有研究將蠟螟作為新生隱球菌的感染模型，通過觀察蠟螟的致死率并研究其毒力，最終得到的結(jié)果與使用鼠類模型研究隱球菌毒力的結(jié)果一致[27]，表明蠟螟模型作為真菌感染模型研究菌毒力是準(zhǔn)確且具有潛力的。由此證明，蠟螟動(dòng)物感染模型在研究新生隱球菌毒力方面可一定程度上替代哺乳動(dòng)物模型，且有助于研究體內(nèi)抗真菌治療的效果，為臨床抗真菌藥物試驗(yàn)提供基礎(chǔ)研究。

2.4馬爾尼菲籃狀菌 馬爾尼菲籃狀菌是一種熱雙態(tài)真菌病原體，在獲得性免疫缺陷綜合征患者中更易導(dǎo)致嚴(yán)重感染[29-30]。有研究在24 ℃環(huán)境下用馬爾尼菲籃狀菌感染蠟螟模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種24 h后，馬爾尼菲籃狀菌轉(zhuǎn)變?yōu)榱阎辰湍感螒B(tài)[31]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，吞噬作用需要在識(shí)別病原體后進(jìn)行，且主要通過來源于骨髓細(xì)胞系的吞噬細(xì)胞進(jìn)行。吞噬作用需要連續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致吞噬細(xì)胞募集到感染部位，然后將真菌顆粒識(shí)別為外來物并吞噬、攝取，雖然目前對(duì)昆蟲吞噬作用的過程尚不完全清楚，但血淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞表面的受體與哺乳動(dòng)物吞噬細(xì)胞上的受體相似[32]。研究顯示，蠟螟在感染2 h后血淋巴細(xì)胞密度開始增加，通過冷凍成像和熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，6 h時(shí)幼蟲體內(nèi)的真菌在組織中形成明顯的結(jié)節(jié)，24 h時(shí)在感染部位及較遠(yuǎn)的其他部位均可見一系列結(jié)節(jié)，表明真菌已侵入蠟螟組織內(nèi)[33]。由于脊椎動(dòng)物與昆蟲感染的先天免疫反應(yīng)具有相似性，昆蟲在體內(nèi)評(píng)估微生物致病性方面具有潛在用途。

另有研究證實(shí)，馬爾尼菲菌接種劑量的增加可導(dǎo)致幼蟲死亡率增加，同時(shí)幼蟲死亡率也取決于感染蠟螟動(dòng)物模型后的培養(yǎng)溫度；此外，血淋巴細(xì)胞是蠟螟幼蟲免疫防御的關(guān)鍵組成部分，蠟螟體內(nèi)血淋巴細(xì)胞對(duì)馬爾尼菲氏菌有吞噬作用，且在真菌感染期吞噬作用增強(qiáng)[30]。上述研究均表明，蠟螟感染模型可有效應(yīng)用于機(jī)體感染馬爾尼菲籃狀菌后相互作用機(jī)制的研究。可見，蠟螟動(dòng)物感染模型在研究馬爾尼菲籃狀菌的毒力、免疫反應(yīng)以及菌體與宿主的相互反應(yīng)中具有潛在價(jià)值。

2.5鐮刀菌 鐮刀菌是在環(huán)境中常見的絲狀真菌，可在動(dòng)物和植物中引起真菌病。人類感染包括真菌病、角膜炎和甲真菌病，免疫功能降低的患者會(huì)發(fā)生深部真菌感染[34-35]。為了更好地了解真菌與宿主之間的相互作用，有研究開發(fā)了大蠟蛾幼蟲作為新的感染宿主模型，將鐮刀菌分生孢子注入大蠟蛾幼蟲的血細(xì)胞后，可在37 ℃時(shí)殺死幼蟲，且在30 ℃溫育時(shí)幼蟲死亡的速度更快，但大蠟蛾幼蟲死亡的影響因素除溫度外，還包括鐮刀菌菌株分生孢子的數(shù)目及形態(tài)等，該研究通過蠟螟動(dòng)物感染模型進(jìn)一步證實(shí)了大分生孢子較小分生孢子更具毒性，同時(shí)從側(cè)面證實(shí)了蠟螟模型在鐮刀菌毒力研究中具有一定的研究價(jià)值[36]。

鐮刀菌對(duì)大多數(shù)抗真菌藥耐受，抗真菌藥物耐藥性頻繁發(fā)生，推動(dòng)了利用動(dòng)物感染模型來確定新的耐藥靶點(diǎn)以及對(duì)藥物療效評(píng)價(jià)的研究。有研究用蠟螟作為感染模型發(fā)現(xiàn)，兩性霉素B能顯著增加鐮刀菌感染的幼蟲存活率[37]。鐮刀菌感染蠟螟模型不僅揭示了鐮刀菌毒力的影響因素，也為哺乳動(dòng)物模型提供了一種合適的替代方案[38]，以研究宿主與該真菌病原體之間的相互作用，同時(shí)在抗真菌藥物療效的研究中也具有一定價(jià)值。

2.6暗色真菌 暗色真菌是引起暗色絲孢霉病的主要原因，從創(chuàng)傷引起的局部感染到免疫功能降低患者均可感染暗色絲孢霉病，嚴(yán)重時(shí)可危及中樞神經(jīng)系統(tǒng)并導(dǎo)致死亡。暗色絲孢霉病單獨(dú)切除可以治愈局部感染，而全身性疾病通常難以治療[39]，且任何菌種及濃度均可激活體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中卡氏枝孢霉在暗色真菌中最具毒性[40]。傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物模型由于基因組與人類高度同源且臟器與人類相似，可高度模擬人類感染真菌后的臨床特點(diǎn)及病理機(jī)制[32]，但在傳統(tǒng)動(dòng)物模型中真菌感染的毒力過程不容易觀察，而蠟螟表面在病原體感染后可發(fā)生黑色素化，故解決了這一難題。有研究利用蠟螟感染模型替代哺乳動(dòng)物模型分析了不同暗色真菌菌株的毒力和宿主對(duì)暗色真菌不同菌株的免疫應(yīng)答，結(jié)果通過血淋巴細(xì)胞濃度的改變和體表黑色素反應(yīng)的變化發(fā)現(xiàn)了不同菌株毒力的差異[33,38,41]。蠟螟動(dòng)物感染模型作為一種新的無脊椎動(dòng)物宿主模型，可用于評(píng)估暗色真菌的毒力，為進(jìn)一步克服目前體外研究暗色真菌病的局限性提供了可能。

3 小 結(jié)

蠟螟動(dòng)物感染模型已受到廣泛關(guān)注。蠟螟動(dòng)物感染模型具有簡單、易操作的優(yōu)點(diǎn)[12,42]，在不同菌種間毒力的比較、感染真菌后的免疫機(jī)制以及抗真菌藥物的初步療效中已取得了相關(guān)進(jìn)展[19,27,39,41]。與秀麗隱桿線蟲、果蠅等成熟無脊椎動(dòng)物模型相比，蠟螟模型目前還處于起步階段，未建立動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，蠟螟基因庫也未完全建立[43]。蠟螟的局限性在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，未來應(yīng)盡早建立蠟螟基因庫，解決蠟螟健康評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化等問題，以有助于蠟螟模型發(fā)展為更加可靠的動(dòng)物感染模型。