姬名碩，王曉東，帕麗達(dá)·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830054)

近年來(lái)，隨著腫瘤大劑量化療以及造血干細(xì)胞和實(shí)體器官移植的發(fā)展，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)患者逐年增多，目前已成為許多疾病致病和致死的重要病因[1-2]。雖然IFI的診療技術(shù)取得了一定進(jìn)展，但I(xiàn)FI的真菌譜也隨之發(fā)生了變化[3]。以往常見(jiàn)的白色念珠菌感染呈降低趨勢(shì)，而以往并不常見(jiàn)的曲霉菌感染比例上升至第二位[4]。另外，還出現(xiàn)了許多新的真菌致病菌種，這些菌種的毒力和致病機(jī)制目前尚不明確。生物模型作為生命科學(xué)的研究工具，對(duì)于許多學(xué)科的發(fā)展和進(jìn)步至關(guān)重要。蠟螟動(dòng)物感染模型最初用于細(xì)菌病原體的毒力和發(fā)病機(jī)制的研究[5-7]，近年開(kāi)始應(yīng)用于真菌感染模型。蠟螟作為新的真菌動(dòng)物感染模型，雖然缺乏統(tǒng)一的健康評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)、繁殖條件不統(tǒng)一等會(huì)造成實(shí)驗(yàn)的偏差，但蠟螟動(dòng)物感染模型相較于傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物感染模型生命周期短、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單且無(wú)倫理學(xué)限制，同時(shí)還可以了解真菌感染的全過(guò)程和免疫應(yīng)答反應(yīng)，為真菌毒力差異的初步研究、感染后的動(dòng)態(tài)病理變化及體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)的研究提供了一個(gè)可靠的動(dòng)物感染模型。現(xiàn)就蠟螟在真菌感染模型中的應(yīng)用價(jià)值予以綜述。

1 蠟螟模型的建立

蠟螟分布廣泛，隸屬于鱗翅目草螟科蠟螟亞科蠟螟屬[8]。蠟螟的幼蟲(chóng)越來(lái)越多地用于細(xì)菌和真菌感染模型，研究真菌及細(xì)菌感染宿主后的毒力因子和發(fā)病機(jī)制。與傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物模型宿主相比，無(wú)脊椎動(dòng)物感染模型的建立和維護(hù)成本更低，更適合大樣本的研究；且蠟螟是蜜蜂的重要害蟲(chóng)，主要以幼蟲(chóng)蛀食巢脾，破壞貯藏的巢脾，進(jìn)而侵害蜂群，直接影響蜂蜜的產(chǎn)量和質(zhì)量[8]，因此，蠟螟用于感染模型并不受倫理學(xué)限制。此外，蠟螟還適用于真菌感染模型的研究，其具有如下特征：①蠟螟體積相對(duì)較大(15～30 mm)[8]，易于操作、精確劑量的注射以及收集組織、淋巴血，用于下游的實(shí)驗(yàn)分析；②蠟螟的免疫系統(tǒng)與脊椎動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度同源性，因此具有細(xì)胞和體液免疫功能[9-10]，其體液免疫反應(yīng)包括黑化、血淋巴凝結(jié)以及產(chǎn)生抗微生物肽，而細(xì)胞反應(yīng)則包括吞噬作用和產(chǎn)生大量包囊[11-12]；③蠟螟可以在37 ℃恒溫條件下生長(zhǎng)繁殖，這是真菌感染體內(nèi)研究的重要因素[5]?；谝陨咸攸c(diǎn)，蠟螟真菌感染模型已初步建立并被科學(xué)界廣泛接受，且已在煙曲霉、白念珠菌、隱性球菌等真菌感染模型的研究中取得了初步成果。

2 蠟螟模型與真菌感染

2.1煙曲霉 煙曲霉是一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，是侵襲性曲霉病的主要致病物種，而IFI是一種與高病死率相關(guān)的全身性疾病[4]。IFI的治療依賴(lài)于數(shù)量非常有限的抗真菌藥物。為了擴(kuò)大抗真菌藥物的范圍，確定某種藥物的療效，必須有體外動(dòng)物感染藥物治療的評(píng)估。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯可通過(guò)抑制煙曲霉的活性、升高蠟螟淋巴細(xì)胞的自噬水平，以增強(qiáng)蠟螟對(duì)抗煙曲霉的感染，這項(xiàng)研究不僅證明了蠟螟可用于真菌藥物的體外實(shí)驗(yàn)，也為臨床藥物評(píng)估提供了可靠依據(jù)[13-14]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)(endoplasmic reticulum-mitochondria encounter structure，ERMES)是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)，他們借助蠟螟感染模型發(fā)現(xiàn)，ERMES有助于增強(qiáng)煙曲霉的毒力，且抑制ERMES可以減弱煙曲霉病原體的活性[15]。因此，蠟螟感染模型可用于體外真菌感染發(fā)病機(jī)制的研究，為臨床治療提供理論支持。這些研究結(jié)果表明，蠟螟幼蟲(chóng)可能是研究侵襲性曲霉菌病發(fā)展階段的一個(gè)方便模型。然而，由于哺乳動(dòng)物中的呼吸系統(tǒng)在蠟螟中并不存在，使用蠟螟模型模擬真菌感染肺部后的免疫反應(yīng)無(wú)法實(shí)現(xiàn)[15-16]?？梢?jiàn)，由于蠟螟與哺乳動(dòng)物存在結(jié)構(gòu)上的差異，蠟螟在一定程度上可以取代哺乳動(dòng)物作為體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究模型，但蠟螟作為體外動(dòng)物感染模型還存在一定的局限性。

2.2念珠菌屬 念珠菌屬是免疫功能低下時(shí)IFI的主要病原體，是血液感染的第四大常見(jiàn)原因，其感染的病死率可達(dá)35%以上[17-18]，且不斷有新的變異菌株出現(xiàn)。為了檢測(cè)新菌株的毒力和藥物敏感性，需要建立適當(dāng)?shù)哪Ｐ瓦M(jìn)行評(píng)估，這對(duì)于臨床藥物治療至關(guān)重要。有研究通過(guò)構(gòu)建白色念珠菌大蠟螟動(dòng)物感染模型成功證實(shí)了白念珠菌不同菌株的毒力和對(duì)感染的免疫反應(yīng)，該研究證實(shí)了大蠟螟可以被白念珠菌感染，且可用于測(cè)試不同菌株間毒力的差異[19-20]。此外，白色念珠菌感染大蠟螟藥物的體外實(shí)驗(yàn)也取得了一定進(jìn)展。有研究通過(guò)白色念珠菌蠟螟模型證實(shí)，光動(dòng)力療法治療可以延長(zhǎng)被白色念珠菌感染的幼蟲(chóng)壽命[21]。有學(xué)者利用真菌感染蠟螟的淋巴細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中加入活性氧類(lèi)探針和溶酶體探針，觀(guān)察真菌刺激細(xì)胞時(shí)自噬水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性氧類(lèi)水平升高、溶酶體和菌共定位，說(shuō)明蠟螟細(xì)胞的自噬性在抗真菌感染中發(fā)揮保護(hù)作用[19]。可見(jiàn)，在念珠菌屬中，無(wú)脊椎動(dòng)物模型同樣也可用于初步探討不同菌種的毒力、抗真菌藥物的療效以及宿主感染真菌后的作用機(jī)制。

2.3新生隱球菌 新型隱球菌是一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，在免疫抑制患者中，尤其在人類(lèi)免疫缺陷病毒感染者和移植受者中可傳播或侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致致命的腦膜炎[22]，并造成每年約60萬(wàn)人死亡[23]。莢膜是新生隱球菌的重要毒力因子，可維護(hù)菌體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及抵御宿主細(xì)胞免疫的吞噬作用，其他的毒力因子還包括黑色素、分泌性酶等，這些毒力因子可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)[24-25]。此外，新生隱球菌為細(xì)胞內(nèi)的真菌病原體，可在吞噬病原體的細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制。新生隱球菌感染哺乳動(dòng)物后可產(chǎn)生抗微生物肽并誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞發(fā)揮抗菌作用，這些免疫反應(yīng)同樣也存在于無(wú)脊椎動(dòng)物中，蠟螟作為無(wú)脊椎動(dòng)物，在感染新生隱球菌后可在血淋巴細(xì)胞中裂解并繁殖，這種在哺乳動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中類(lèi)似的免疫反應(yīng)是蠟螟感染模型用于研究微生物發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)[26]。近年來(lái)，有研究通過(guò)開(kāi)發(fā)蠟螟動(dòng)物感染模型研究隱球菌的毒力、宿主感染后的免疫反應(yīng)以及抗真菌化合物的作用發(fā)現(xiàn)，所有隱球菌的菌種在注入蠟螟體內(nèi)后均會(huì)被血細(xì)胞吞噬，但仍會(huì)在宿主體內(nèi)增殖，并將蠟螟殺死，殺滅的速度和程度取決于新生隱球菌菌株以及注射的真菌孢子的數(shù)量；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在新生隱球菌感染前還是感染后，給予復(fù)合抗真菌療法(兩性霉素B+氟胞嘧啶)均較單一療法更能延長(zhǎng)蠟螟的存活時(shí)間并減少血細(xì)胞中隱球菌的數(shù)量[27-28]。

有研究將蠟螟作為新生隱球菌的感染模型，通過(guò)觀(guān)察蠟螟的致死率并研究其毒力，最終得到的結(jié)果與使用鼠類(lèi)模型研究隱球菌毒力的結(jié)果一致[27]，表明蠟螟模型作為真菌感染模型研究菌毒力是準(zhǔn)確且具有潛力的。由此證明，蠟螟動(dòng)物感染模型在研究新生隱球菌毒力方面可一定程度上替代哺乳動(dòng)物模型，且有助于研究體內(nèi)抗真菌治療的效果，為臨床抗真菌藥物試驗(yàn)提供基礎(chǔ)研究。

2.4馬爾尼菲籃狀菌 馬爾尼菲籃狀菌是一種熱雙態(tài)真菌病原體，在獲得性免疫缺陷綜合征患者中更易導(dǎo)致嚴(yán)重感染[29-30]。有研究在24 ℃環(huán)境下用馬爾尼菲籃狀菌感染蠟螟模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種24 h后，馬爾尼菲籃狀菌轉(zhuǎn)變?yōu)榱阎辰湍感螒B(tài)[31]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，吞噬作用需要在識(shí)別病原體后進(jìn)行，且主要通過(guò)來(lái)源于骨髓細(xì)胞系的吞噬細(xì)胞進(jìn)行。吞噬作用需要連續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致吞噬細(xì)胞募集到感染部位，然后將真菌顆粒識(shí)別為外來(lái)物并吞噬、攝取，雖然目前對(duì)昆蟲(chóng)吞噬作用的過(guò)程尚不完全清楚，但血淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞表面的受體與哺乳動(dòng)物吞噬細(xì)胞上的受體相似[32]。研究顯示，蠟螟在感染2 h后血淋巴細(xì)胞密度開(kāi)始增加，通過(guò)冷凍成像和熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，6 h時(shí)幼蟲(chóng)體內(nèi)的真菌在組織中形成明顯的結(jié)節(jié)，24 h時(shí)在感染部位及較遠(yuǎn)的其他部位均可見(jiàn)一系列結(jié)節(jié)，表明真菌已侵入蠟螟組織內(nèi)[33]。由于脊椎動(dòng)物與昆蟲(chóng)感染的先天免疫反應(yīng)具有相似性，昆蟲(chóng)在體內(nèi)評(píng)估微生物致病性方面具有潛在用途。

另有研究證實(shí)，馬爾尼菲菌接種劑量的增加可導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡率增加，同時(shí)幼蟲(chóng)死亡率也取決于感染蠟螟動(dòng)物模型后的培養(yǎng)溫度；此外，血淋巴細(xì)胞是蠟螟幼蟲(chóng)免疫防御的關(guān)鍵組成部分，蠟螟體內(nèi)血淋巴細(xì)胞對(duì)馬爾尼菲氏菌有吞噬作用，且在真菌感染期吞噬作用增強(qiáng)[30]。上述研究均表明，蠟螟感染模型可有效應(yīng)用于機(jī)體感染馬爾尼菲籃狀菌后相互作用機(jī)制的研究。可見(jiàn)，蠟螟動(dòng)物感染模型在研究馬爾尼菲籃狀菌的毒力、免疫反應(yīng)以及菌體與宿主的相互反應(yīng)中具有潛在價(jià)值。

2.5鐮刀菌 鐮刀菌是在環(huán)境中常見(jiàn)的絲狀真菌，可在動(dòng)物和植物中引起真菌病。人類(lèi)感染包括真菌病、角膜炎和甲真菌病，免疫功能降低的患者會(huì)發(fā)生深部真菌感染[34-35]。為了更好地了解真菌與宿主之間的相互作用，有研究開(kāi)發(fā)了大蠟蛾幼蟲(chóng)作為新的感染宿主模型，將鐮刀菌分生孢子注入大蠟蛾幼蟲(chóng)的血細(xì)胞后，可在37 ℃時(shí)殺死幼蟲(chóng)，且在30 ℃溫育時(shí)幼蟲(chóng)死亡的速度更快，但大蠟蛾幼蟲(chóng)死亡的影響因素除溫度外，還包括鐮刀菌菌株分生孢子的數(shù)目及形態(tài)等，該研究通過(guò)蠟螟動(dòng)物感染模型進(jìn)一步證實(shí)了大分生孢子較小分生孢子更具毒性，同時(shí)從側(cè)面證實(shí)了蠟螟模型在鐮刀菌毒力研究中具有一定的研究?jī)r(jià)值[36]。

鐮刀菌對(duì)大多數(shù)抗真菌藥耐受，抗真菌藥物耐藥性頻繁發(fā)生，推動(dòng)了利用動(dòng)物感染模型來(lái)確定新的耐藥靶點(diǎn)以及對(duì)藥物療效評(píng)價(jià)的研究。有研究用蠟螟作為感染模型發(fā)現(xiàn)，兩性霉素B能顯著增加鐮刀菌感染的幼蟲(chóng)存活率[37]。鐮刀菌感染蠟螟模型不僅揭示了鐮刀菌毒力的影響因素，也為哺乳動(dòng)物模型提供了一種合適的替代方案[38]，以研究宿主與該真菌病原體之間的相互作用，同時(shí)在抗真菌藥物療效的研究中也具有一定價(jià)值。

2.6暗色真菌 暗色真菌是引起暗色絲孢霉病的主要原因，從創(chuàng)傷引起的局部感染到免疫功能降低患者均可感染暗色絲孢霉病，嚴(yán)重時(shí)可危及中樞神經(jīng)系統(tǒng)并導(dǎo)致死亡。暗色絲孢霉病單獨(dú)切除可以治愈局部感染，而全身性疾病通常難以治療[39]，且任何菌種及濃度均可激活體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中卡氏枝孢霉在暗色真菌中最具毒性[40]。傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物模型由于基因組與人類(lèi)高度同源且臟器與人類(lèi)相似，可高度模擬人類(lèi)感染真菌后的臨床特點(diǎn)及病理機(jī)制[32]，但在傳統(tǒng)動(dòng)物模型中真菌感染的毒力過(guò)程不容易觀(guān)察，而蠟螟表面在病原體感染后可發(fā)生黑色素化，故解決了這一難題。有研究利用蠟螟感染模型替代哺乳動(dòng)物模型分析了不同暗色真菌菌株的毒力和宿主對(duì)暗色真菌不同菌株的免疫應(yīng)答，結(jié)果通過(guò)血淋巴細(xì)胞濃度的改變和體表黑色素反應(yīng)的變化發(fā)現(xiàn)了不同菌株毒力的差異[33,38,41]。蠟螟動(dòng)物感染模型作為一種新的無(wú)脊椎動(dòng)物宿主模型，可用于評(píng)估暗色真菌的毒力，為進(jìn)一步克服目前體外研究暗色真菌病的局限性提供了可能。

3 小 結(jié)

蠟螟動(dòng)物感染模型已受到廣泛關(guān)注。蠟螟動(dòng)物感染模型具有簡(jiǎn)單、易操作的優(yōu)點(diǎn)[12,42]，在不同菌種間毒力的比較、感染真菌后的免疫機(jī)制以及抗真菌藥物的初步療效中已取得了相關(guān)進(jìn)展[19,27,39,41]。與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅等成熟無(wú)脊椎動(dòng)物模型相比，蠟螟模型目前還處于起步階段，未建立動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，蠟螟基因庫(kù)也未完全建立[43]。蠟螟的局限性在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，未來(lái)應(yīng)盡早建立蠟螟基因庫(kù)，解決蠟螟健康評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題，以有助于蠟螟模型發(fā)展為更加可靠的動(dòng)物感染模型。