柯璇，洪浩

(中國藥科大學藥學院藥理系，江蘇 南京 210009)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)是哺乳動物基因組中最大的膜蛋白家族，有800多名成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管、視網(wǎng)膜等器官和組織，參與機體的發(fā)育和正常的功能行使。GPCR也是目前成藥性最高的藥物靶標，當今治療性藥物市場中約有30%的藥物以GPCR為作用靶標[1]。當細胞受到外界刺激時，GPCR通過與光、氣味、離子、脂類、多肽以及蛋白等形式的配體結合而激活，繼而觸發(fā)其下游信號事件[2]。過去認為GPCR僅在質膜上發(fā)揮作用，但迄今為止還發(fā)現(xiàn)了超過30種不同的GPCR定位于細胞核[3]，其中一些細胞核GPCR(nuclear GPCR，nGPCR)已顯示出與其相應細胞質膜GPCR(plasma membrane GPCR，mGPCR)不同的生物特性和生理或病理功能。本文就目前對nGPCR的相關研究進展做簡要綜述，并比較其與mGPCR間的異同，最后討論其在疾病發(fā)展及藥物治療中可能的作用。

1 nGPCR的來源及其轉運機制

1.1 細胞表面來源nGPCR的轉運機制 許多GPCR首先被轉運至細胞表面，經(jīng)過激活、內化后再轉運至細胞核。在其中一些GPCR中包含經(jīng)典的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，即一段或兩段富含堿性氨基酸殘基的序列，該信號隨后被核轉運蛋白(karyopherin)超家族的特定成員識別為核內蛋白，而后通過小GTP酶和(或)importin機制經(jīng)核孔復合體進入細胞核。例如凝血因子Ⅱ受體1(又稱蛋白酶激活受體2，coagulation factor Ⅱ receptor-like 1 或 protease activated receptor 2，F(xiàn)2RL1或PAR2)在被配體激活并內化后，其中含有的兩段NLS被importin β1識別，從而允許其在分選蛋白nexin11和動力蛋白dynein的協(xié)助下沿著微管從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞表面轉移到細胞核[4]。與F2RL1相似，激動劑激活催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor，OTR)導致β-arrestin介導其發(fā)生內化，隨后核轉運蛋白transportin-1與受體C端的NLS結合，將其轉運至細胞核[5]。通常，NLS序列中任意氨基酸殘基的突變都會阻礙核蛋白的識別，從而阻止這些GPCR的核定位。

此外，還有一些nGPCR包含特殊的NLS序列，例如代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGlu5)中新確認的靶向序列[6]，該序列對于mGlu5的核定位是充分必要條件，但其結構并不符合NLS序列的一般規(guī)律。有趣的是，mGlu5 C端的這段靶向序列還包含幾個蛋白激酶結構域，包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)[7]。可以推測，這段靶向序列的磷酸化可能影響受體與轉運蛋白的結合。

1.2 非細胞表面來源nGPCR的轉運機制 這部分nGPCR并非由細胞膜內化而來，而是在合成后被直接運送到細胞核?；谕夂四づc內質網(wǎng)相連接，推測這類nGPCR可能通過側向擴散機制到達細胞核，即由內質網(wǎng)合成或逆向運輸?shù)牡鞍踪|可以先沿著外核膜快速擴散至核孔復合體，而后穿過核孔復合物與核膜之間的外周通道[8]，最終通過與核纖層蛋白或染色質的相互作用而被固定于內核膜[9]。神經(jīng)元中有超過90%的mGlu5受體在高爾基體中轉運加工，其中60%～85%的受體逆向運輸返回內質網(wǎng)并經(jīng)由外周通道側向擴散至細胞核[10]，其余15%～40%則直抵細胞表面接收外部信號，這部分受體內化后不再前往細胞核，而是返回細胞表面重新利用[11]。此外，近來發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞核內也存在蛋白質的翻譯過程[12]，這提示nGPCR存在于細胞核內直接合成的可能性。

2 nGPCR的激活途徑

在核膜上發(fā)現(xiàn)的nGPCR被牢牢地錨定于內核膜或外核膜上；在核質中發(fā)現(xiàn)的nGPCR可能位于向核質內凹陷的核膜上，也可能與磷脂分子嵌合從而以膠束的形式分散在核質中。目前已知nGPCR可以通過以下4條途徑被激活：

2.1 在細胞表面與配體結合后激活并內化 細胞表面的GPCR首先在質膜上大量表達，與配體結合后被激活并發(fā)生內化。多數(shù)情況下，內化后的配體-受體復合物或從其中分離出來的配體在早期胞內體中被降解，而未被降解的受體則返回到細胞表面重新敏化，這種可與配體結合的受體數(shù)量暫時或長時間減少的現(xiàn)象也被稱為受體脫敏。但在少數(shù)情況下，內化的配體-受體復合物或從其中分離出來的受體隨后被轉運至細胞核成為nGPCR，這也是上文所述細胞表面來源的nGPCR的主要類型。例如，在乳腺癌細胞和原代成纖維細胞中，熒光標記的催產(chǎn)素受體和碘化催產(chǎn)素相結合并與之內化至核膜[5,13]。細胞表面的F2RL1和PtAFR也以配體-受體復合物的形式轉位到細胞核[4,14]。到達細胞核的nGPCR隨后通過不同的方式啟動其相應的下游信號通路。

2.2 與細胞外配體結合后激活 細胞外配體若要直接激活位于細胞核的nGPCR，必須穿過質膜甚至是核膜。滲透性高的配體(例如內源性大麻素[15])可通過自由擴散穿過此類膜，而大分子或帶電荷的配體則需要借助選擇性轉運蛋白(例如去甲腎上腺素[16])、交換泵(例如谷氨酸[17])等膜蛋白通過主動轉運的過程或借助胞飲過程(例如尿素-Ⅱ[18])進入細胞到達nGPCR。例如mGlu5受體的激活至少需要借助兩個攝取系統(tǒng)負責將谷氨酸轉運到神經(jīng)元中：Na+依賴性谷氨酸轉運體和胱氨酸/谷氨酸轉運體[17]。

2.3 與細胞內配體結合后激活 除了攝取及轉運細胞外配體，細胞還能以“自分泌”的模式，在受體附近自身合成配體來激活nGPCR。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)在質膜及核膜均有分布，在核PLA2的作用下，核膜水解最終生成血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)和溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，從而激活其位于細胞核的同源受體[19]。其他類似的細胞內合成配體還包括前列腺素E2等脂配體[20]及apelin、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)和緩激肽等肽配體[21]。與mGPCR作為啟動者不同，細胞內配體的合成往往由上游事件觸發(fā)，在細胞信號轉導中屬于級聯(lián)放大的中間環(huán)節(jié)。有人認為，細胞外的PAF和LPA似乎引發(fā)了其自身在細胞內的生成，局部產(chǎn)生的核PAF和LPA激活附近的同源核受體，進而誘導促炎基因的表達[22]。

2.4 非配體依賴性激活 除了上述3種配體依賴性激活之外，許多GPCR存在非配體依賴性激活，這意味著nGPCR或可單獨發(fā)揮功能。例如，mGlu5受體在Homer1a蛋白的作用下無激動劑即可激活[23]。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽1受體(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor 1，PAC1)在不存在激動劑的情況下也能被胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)下游的Src信號反式激活[24]。

3 nGPCR與mGPCR的比較

nGPCR通常與mGPCR具有相同的七螺旋結構，但也存在例外，如Frizzled-2受體在細胞表面時為完整的全長形式，但在轉運至細胞核附近時發(fā)生裂解，僅其C端進入細胞核中，而N端被留于核外[25]。此外，在某些情況下，nGPCR和mGPCR可能會經(jīng)歷不同的翻譯后修飾[26]。例如，細胞表面的內皮素受體B(endothelin receptor type B，ETB)經(jīng)歷了N-糖基化作用，而在細胞核中該受體無此修飾[27]。

由于nGPCR與mGPCR所處的位置不同，二者所處的微環(huán)境也不同。大多數(shù)細胞外配體受滲透性的限制不能進入細胞，因此，相較于在細胞表面接收細胞外配體的mGPCR，nGPCR可能更易于被細胞內配體激活，這些細胞內配體可以由位于nGPCR附近的酶在細胞內合成。對于某些半衰期較短的不穩(wěn)定配體，例如PAF及LPA，這樣的空間分配能最大限度地避免配體在尚未發(fā)揮作用前降解，從而也確保了核受體微環(huán)境中配體的生物利用度。

某些nGPCR與其相應的mGPCR可以誘發(fā)相同的效應。例如核mGlu5受體與細胞表面mGlu5受體都能誘導產(chǎn)生Ca2+振蕩，對于突觸可塑性和紋狀體神經(jīng)元的生長和分化具有相同的影響[28]。

更重要的是，nGPCR也能介導與mGPCR不同、甚至是完全相反的效應。例如，激活細胞表面F2RL1促進血管成熟，而激活核F2RL1則誘導血管生成[4]。細胞核前列腺素E2受體3(prostaglandin E2receptor 3，EP3)介導內皮一氧化氮合酶eNOS表達，這恰恰與細胞表面EP3受體介導的血管快速收縮效應相反[29]。在某些細胞中，受體的定位與功能還可能隨著細胞狀態(tài)的改變而發(fā)生動態(tài)變化。在未刺激的T細胞中，絕大多數(shù)鞘氨醇-1-磷酸受體1(sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1)位于細胞膜，參與細胞遷移；而在受刺激的T細胞中，大多數(shù)S1PR1被誘導入核，抑制細胞增殖[30]。

4 nGPCR與疾病治療

越來越多的證據(jù)表明，nGPCR參與了多種疾病的發(fā)生及發(fā)展，這些疾病包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及肝臟和腎臟的相關疾病。例如，脊髓背角神經(jīng)元中約有80%的mGlu5受體位于細胞內，其中大部分(約60%)位于細胞核內，細胞核中的mGlu5受體具有功能活性，并且與神經(jīng)性疼痛相關[31]。在許多疾病中，nGPCR呈現(xiàn)出相應的病理變化，主要表現(xiàn)為分布密度的改變。例如，在腫瘤和心力衰竭等疾病中觀察到nGPCR水平上調，而在高血壓中其水平下調。半胱氨酰白三烯1受體(cysteinyl leukotrienes receptor 1，CysLT1R)在結腸癌中表達上調，并且細胞核中CysLT1R的水平也顯著升高[32]；此外，在神經(jīng)膠質瘤中也發(fā)現(xiàn)了細胞核中血管活性腸肽受體1(vasoactive intestinal peptide receptor 1，VPAC1)的密度升高[33]。腫瘤細胞中nGPCR的水平上調可能是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的機制之一。在心力衰竭模型中，成纖維細胞核血管緊張素Ⅱ受體1(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1)的密度顯著增加，并參與膠原蛋白的表達和分泌以及細胞增殖的調節(jié)[34]。相反，在大鼠高血壓模型中，腎臟細胞核AT1的表達減少，這可能是由于Ang Ⅱ水平升高引起的一種補償機制[35]。盡管已有以上研究基礎，但nGPCR在病理條件下的表現(xiàn)及其作用仍有待于進一步的研究加以闡明，以評估其作為治療靶標的可行性。

nGPCR的發(fā)現(xiàn)也為其靶向藥物的研發(fā)帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。目前臨床上使用的藥物中約有30%靶向GPCR，其中超過80%作用于單胺能受體(包括腎上腺素能受體、膽堿能受體、組胺受體、多巴胺能受體和5-羥色胺受體)和阿片類受體，主要通過G蛋白的Gαi/o亞基(約38%)、Gαq/11亞基(約29%)和Gαs亞基(約24%)向下轉導信號[36]。盡管暫未獲得充分的證據(jù)支持，但可以推測這些藥物的部分療效可能是通過作用于nGPCR而實現(xiàn)的。例如，用于治療哮喘的CysLT1R選擇性拮抗劑(如孟魯司特)以及用于治療高血壓和心力衰竭的AT1受體拮抗劑(如氯沙坦)，這些藥物對nGPCR的作用很可能也是其臨床療效的潛在機制之一。除了直接作用于nGPCR外，藥物也可能通過改變nGPCR周圍微環(huán)境中配體的濃度，從而影響nGPCR對配體的利用，間接影響受體與配體的結合。

5 小結與展望

長久以來，人們普遍認為GPCR只作用于細胞表面，將細胞外刺激轉化為細胞內應答。然而，隨著研究的不斷深入，GPCR在細胞核中的分布得到了證實，這刷新了人們對GPCR的傳統(tǒng)認知，并大大增加了GPCR信號網(wǎng)絡的復雜性。nGPCR可能在其相應mGPCR激活后被繼發(fā)激活，也可能獨立于mGPCR在其特異配體的調控下被單獨激活。因此，GPCR的最終下游效應可能決定于細胞內外信號通路的疊加和整合。

現(xiàn)有的研究使人們對nGPCR及其特異信號在重要生理和病理過程中的參與有了更深的認識。某些nGPCR在病理條件下密度發(fā)生改變，提示它們可能是藥物治療的潛在靶點。目前迫切需要對nGPCR開展更全面的藥理研究，以優(yōu)化GPCR靶向藥物的選擇性，從而獲得更精準的治療效果。此外，還有必要重新審視臨床上現(xiàn)有GPCR靶向藥物的作用機制?？傊瑢GPCR的新認識突出了GPCR藥理學的復雜多樣性，強調不同亞細胞定位的GPCR在生理和(或)病理狀態(tài)下具有不同的功能，GPCR靶向藥物研究將因此迎來新的機遇和挑戰(zhàn)。