朱昱潤 張春林

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性高度惡性骨腫瘤，以增殖的腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生骨或骨樣組織為特點，局部侵襲性強(qiáng)且早期即可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率為50%～60%[1]。該病好發(fā)于15～25歲或青少年長骨干骺端，發(fā)生在脊柱和骨盆部位者預(yù)后通常不佳。腫瘤早期診斷是確保治療效果的關(guān)鍵，但因骨肉瘤早期缺乏特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時病情往往已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)展。延誤治療時機(jī)、早期轉(zhuǎn)移和化療耐藥等是骨肉瘤患者生存期短、預(yù)后不佳的主要原因。

盡快尋找到骨肉瘤生物標(biāo)志物不僅可以協(xié)助其早期篩查和診斷，而且可以為判斷其化療敏感性和預(yù)后提供依據(jù)，對提升骨肉瘤的臨床治療效果具有重要意義。

1 RNA標(biāo)志物

1.1 微小RNA

微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、非編碼且高度保守的核糖核酸分子，長度較短，由20～25個核苷酸組成，可在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA表達(dá)失調(diào)可影響惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，如血清miR-21高表達(dá)與腫瘤分期、化療耐藥性和不良預(yù)后均顯著相關(guān)[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者血清miR-375水平明顯低于健康人，且血清miR-375水平越低，骨肉瘤患者總生存期越短[3]，這可能與miR-375對骨肉瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用有關(guān)。Shi等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)途徑抑制骨肉瘤生長。在骨肉瘤組織中miR-214表達(dá)顯著上調(diào)，這可能與骨肉瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，miR-214高表達(dá)患者腫瘤更大，化療效果也更差，故其可以作為預(yù)測骨肉瘤預(yù)后的潛在因素[5]。此外，骨肉瘤患者血清miR-194水平明顯降低，且在不同組織學(xué)亞型之間并無顯著差異。手術(shù)治療后骨肉瘤患者miR-194表達(dá)可上調(diào)，而miR-194高表達(dá)患者預(yù)后較好[6]。

1.2 環(huán)狀RNA

環(huán)狀RNA(circRNA)具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，可穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中而不被降解，故其可作為腫瘤早期篩查和評價預(yù)后的標(biāo)志物以及新的有效治療靶點，對闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制具有重要意義。

circRNA-0008717是一種在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)的環(huán)狀核糖核酸，其在骨肉瘤中過表達(dá)可提高Bmi-1的表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，骨肉瘤患者生存期因此縮短[7]。在骨肉瘤中過表達(dá)的還有circRNA-100876，其高表達(dá)患者腫瘤體積更大，分化程度較低，生存期較短。敲除circRNA-100876基因可抑制體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長。miR-136作為circRNA-100876的下游基因，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[8]，而miR-136可作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用，這也證實了circRNA-100876下調(diào)可抑制腫瘤生長。Zhu等[9]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ RNA_0081001在化療耐藥和肺轉(zhuǎn)移患者血清和組織中高表達(dá)，而其在化療期間無明顯升高且術(shù)后維持在較低水平則提示患者預(yù)后較好。由此可見，hsa_circRNA_0081001可以動態(tài)、準(zhǔn)確地反映骨肉瘤患者的病情變化，尤其在轉(zhuǎn)移和化療耐受方面具有預(yù)測骨肉瘤進(jìn)展和預(yù)后的臨床價值。

1.3 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、干細(xì)胞全能性和神經(jīng)生長分化等方面具有重要作用。與正常骨細(xì)胞系相比，骨肉瘤細(xì)胞系lncRNA HNF1A-AS1、lncRNA CRNDE和lncRNA Linc00511表達(dá)均上調(diào)。lncRNA CRNDE介導(dǎo)的骨肉瘤進(jìn)展可能與notch1信號和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換失調(diào)有關(guān)[10],而lncRNA HNF1A-AS1則通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和抑制細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[11]。lncRNA Linc00511高表達(dá)可抑制miR-765表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成和遷移[12]。上述lncRNA對判斷骨肉瘤預(yù)后和尋找治療靶點均具有潛在價值。

lncRNA MEG3對多種腫瘤均有抑制作用，因此低水平lncRNA MEG3是骨肉瘤患者預(yù)后不良的標(biāo)志，患者生存時間會明顯縮短，且可能發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13]。張鴻程等[14]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXA11-AS在骨肉瘤中表達(dá)明顯下調(diào)，而其過表達(dá)可抑制裸鼠體內(nèi)骨肉瘤生長，因此有望成為生物治療靶點。但目前該作用的分子機(jī)制尚不明確，lncRNA HOXA11-AS可能通過影響表觀調(diào)控因子活性發(fā)揮腫瘤抑制作用。

化療耐藥一直是骨肉瘤治療的難點。lncRNA LUCAT1在甲氨蝶呤耐藥的骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)，提示其可能是影響耐藥的關(guān)鍵分子。體內(nèi)和體外實驗研究均發(fā)現(xiàn)，敲除LUCAT1基因可抑制腫瘤細(xì)胞對甲氨蝶呤的抗藥性，作用機(jī)制可能是通過miR-200c上調(diào)相關(guān)多藥耐藥蛋白表達(dá)[15]。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥骨肉瘤細(xì)胞lncRNA FOXC2-AS1表達(dá)水平明顯高于阿霉素敏感骨肉瘤細(xì)胞，lncRNA FOXC2-AS1可能參與耐藥機(jī)制，且與預(yù)后不良相關(guān)。

2 骨肉瘤相關(guān)基因異常

p53是一種抑癌基因，可對細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和合成及細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。一項薈萃分析結(jié)果顯示，p53上調(diào)與骨肉瘤患者3年總生存率降低有關(guān)[17]。相關(guān)耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，p53高表達(dá)可提升多藥耐藥的骨肉瘤細(xì)胞系對紫杉醇、順鉑和阿霉素的化療敏感性，其作用方式可能是通過抑制胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)表達(dá)或增加促凋亡蛋白p21和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)實現(xiàn)[18]。

Rb基因?qū)刂萍?xì)胞周期至關(guān)重要，其發(fā)生遺傳突變不僅可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤綜合征，也可使患者更易患骨肉瘤，散發(fā)性骨肉瘤患者常存在Rb基因改變[19]。Rb基因可通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，Rb缺失或無功能表型骨肉瘤患者可因Rb基因不能與轉(zhuǎn)錄因子E2F形成穩(wěn)定復(fù)合物導(dǎo)致預(yù)后較差[20]。研究報道，Rb基因雜合性缺失是骨肉瘤患者預(yù)后不良的危險因素[21]。

先天性血管萎縮性皮膚異色癥(RTS)是一種常染色體隱性遺傳疾病，這種染色體突變疾病與骨肉瘤易感性增加有關(guān)，攜帶RECQL4基因節(jié)段突變的RTS患者患骨肉瘤風(fēng)險明顯增加[22]。RECQL4可編碼修復(fù)DNA損傷和維持基因組穩(wěn)定性所需的解旋酶，因此RECQL4在骨肉瘤中過表達(dá)可能與基因組不穩(wěn)定有關(guān)，從而導(dǎo)致骨肉瘤化療耐藥及預(yù)后不良[23]。Martin等[24]發(fā)現(xiàn)，在化療不敏感的骨肉瘤病例中RECQL4表達(dá)上調(diào)，提示RECQL4差異表達(dá)可能與化療反應(yīng)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3 胰島素樣生長因子-1與IGF-1R

胰島素樣生長因子(IGF)-1可在抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和血管生成以及各種腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，IGF-1可與IGF-1R結(jié)合，激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該途徑失調(diào)可影響多種病理過程，如骨肉瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。抑制IGF-1R可降低骨肉瘤增殖與侵襲，并提高骨肉瘤對多西他賽、順鉑或阿霉素的敏感性[26]。另一項多變量Cox回歸分析結(jié)果表明，IGF-1R水平是預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后的獨立因素，IGF-1R過表達(dá)與骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[27]。

4 基質(zhì)金屬蛋白酶

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族是依賴鋅離子和鈣離子維持活性的一類蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9是該家族的主要成員，通常以酶原的形式分泌。經(jīng)水解活化后，MMP-2和MMP-9可降解基底膜Ⅳ型膠原，使基底膜阻止腫瘤細(xì)胞移動的能力下降[28]。大部分腫瘤都會出現(xiàn)1種或幾種MMP上調(diào)的情況，且MMP高表達(dá)常與患者存活率低有關(guān)[29]。MMP通過切割多種底物發(fā)揮作用，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成。這些底物既包括細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，也包括生長因子結(jié)合蛋白、生長因子前體、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞粘附分子和其他蛋白酶等。抑制MMP分泌可抑制骨肉瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[30]。Kunz等[31]研究MMP與化療反應(yīng)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MMP-9活性降低和MMP-2活性升高均會導(dǎo)致患者對化療反應(yīng)不良，MMP-2/MMP-9活性的比率可能是對化療反應(yīng)有價值的預(yù)后標(biāo)志物。

5 蛋白標(biāo)志物

研究證實，許多蛋白可參與腫瘤調(diào)控和表達(dá)。對正常和腫瘤組織的蛋白表達(dá)圖譜分別進(jìn)行研究，可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并篩選出可靠的生物標(biāo)志物。

細(xì)胞色素(CY)C1在骨肉瘤組織中過表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，沉默CYC1基因可以增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用，這一過程主要由線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)[32]。miR-661過表達(dá)通過下調(diào)CYC1提高骨肉瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[33]。

骨膜素過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)。骨膜素過表達(dá)可使患者血管內(nèi)皮生長因子水平增高，微血管密度變大，不僅與患者存活率呈負(fù)相關(guān)[34]，還與腫瘤Enneking分期、大小和病理分型有關(guān)[35]。

微小染色體維持蛋白(MCM)是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子，可在DNA復(fù)制啟動和延伸環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，MCM蛋白表達(dá)顯示細(xì)胞具有增殖能力。有研究證實，MCM2和MCM3高表達(dá)與骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)，敲除MCM2或MCM3基因可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長[36]，但其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

6 結(jié)語

發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物是將分子和基因組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為臨床成果的重要途徑，轉(zhuǎn)移和化療耐藥是目前骨肉瘤治療面臨的最大挑戰(zhàn)。有關(guān)研究可以聚焦于能夠確定化療敏感性及監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，從而為患者提供個體化治療方案。

目前，雖然某些潛在的生物標(biāo)志物已得到大量研究證實，但尚無法應(yīng)用于臨床。其關(guān)鍵在于這些生物標(biāo)志物特異度和敏感度均較低，無法滿足臨床需求[37]。腫瘤的異質(zhì)性也是問題之一，骨肉瘤的基因組具有多樣性，故少數(shù)腫瘤樣本不能反映疾病整體情況。目前多數(shù)研究對象均為小規(guī)模樣本，其研究結(jié)果存在不確定性。經(jīng)濟(jì)和商業(yè)因素也是影響因素，在生物標(biāo)志物影響臨床決策之前，其有效性需要經(jīng)過大規(guī)模、高成本的隨機(jī)臨床試驗證實，才能得到監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可和批準(zhǔn)，權(quán)衡風(fēng)險與收益則使很多后續(xù)研究難以進(jìn)一步開展[38]。