王鑫 付海亮

運(yùn)用各種間充質(zhì)干細(xì)胞、生長因子、支架的干細(xì)胞療法是較有前景的組織再生策略之一。越來越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)來源于其分泌的外泌體。外泌體能展現(xiàn)出與其來源細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，且直接應(yīng)用外泌體治療無明顯不良反應(yīng)，還能顯著降低免疫原性、致瘤性、血管堵塞等風(fēng)險(xiǎn)[1]。

1 外泌體構(gòu)成及特點(diǎn)

外泌體是由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，直徑為40～100 nm。外泌體膜表面具有標(biāo)志性膜蛋白如CD9、CD63、CD81等，膜內(nèi)包裹著蛋白、核酸、脂質(zhì)等活性物質(zhì)。外泌體的脂膜能很好地保護(hù)其含有的生物活性物質(zhì)使其不被降解，并將蛋白質(zhì)、DNA、RNA等物質(zhì)從母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。外泌體作為重要的旁分泌效應(yīng)因子在細(xì)胞信息交流中發(fā)揮著重要的作用[2]。外泌體特性隨著細(xì)胞來源不同而不同，且同一細(xì)胞不同時(shí)間段、不同生理病理狀態(tài)下產(chǎn)生的外泌體也具有不同的特點(diǎn)。

2 外泌體治療骨科疾病

2.1 骨關(guān)節(jié)炎

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是常見關(guān)節(jié)炎之一，其病理特征包括軟骨退化、軟骨下骨硬化、形成骨贅、發(fā)生滑膜炎癥和韌帶鈣化等。目前臨床上OA主要治療方式仍是口服非甾體類抗炎藥，然而其治標(biāo)不治本，所以學(xué)者們?nèi)栽趯ふ倚碌闹委煵呗浴＿^往研究集中在干細(xì)胞治療，如關(guān)節(jié)內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞可以阻止軟骨退化，延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程。后續(xù)研究表明，干細(xì)胞治療功能來自于其旁分泌作用，包括其分泌的外泌體和微粒等。

2.1.1 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體

Tao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSC)來源外泌體含有Wnt5a和Wnt5b且能激活Yes相關(guān)蛋白(YAP)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移，但Wnt5a和Wnt5b激活YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)抑制SOX9的表達(dá)，同時(shí)使得軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌明顯減少。而經(jīng)改造后高表達(dá)miR-140-5p的SMSC來源外泌體消除了這一不足，可使外泌體在不影響軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌的情況下促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和遷移，且可阻止大鼠OA發(fā)生。

Wnt5a是一種非典型的Wnt蛋白，關(guān)節(jié)包括軟骨、骨和關(guān)節(jié)腔等發(fā)育都高度依賴于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]。Wnt5a具有雙重功能：在軟骨形成早期，能激活軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞分化；在軟骨形成后期，能激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，減少軟骨形成和成熟軟骨細(xì)胞中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成。

2.1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體

Mao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-92a-3p的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)來源外泌體可靶向作用于Wnt5a mRNA的3′端非翻譯序列，抑制Wnt5a活性，從而抑制OA小鼠軟骨降解。在這項(xiàng)研究中Wnt5a的生物學(xué)作用與Tao等[3]的SMSC來源外泌體研究結(jié)果類似，區(qū)別在于后者通過miR-140-5p抑制了Wnt5a降解軟骨的負(fù)面作用，同時(shí)還保留了Wnt5b對(duì)軟骨的保護(hù)作用。

Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人BMSC來源外泌體含有長鏈非編碼RNA(lncRNA)KLF3-AS1,它能作為內(nèi)源競爭性RNA與miR-206基因進(jìn)行結(jié)合，從而抑制miR-206基因調(diào)控作用，繼而進(jìn)一步提高G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白-1(GIT-1)表達(dá)。研究表明，GIT-1能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡[7]。Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長因子(PDGF)通過上調(diào)GIT-1表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并抑制軟骨細(xì)胞凋亡。而miR-206過表達(dá)和GIT-1基因敲除能逆轉(zhuǎn)BMSC來源外泌體對(duì)OA的治療效果，說明BMSC來源外泌體通過KLF3-AS1調(diào)控miR-206/GIT-1介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖、凋亡并促進(jìn)軟骨修復(fù)[9]。

還有研究比較BMSC來源外泌體與微粒對(duì)OA的治療作用，結(jié)果表明BMSC來源外泌體與微粒具有類似的功能，即兩者皆可重建軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，刺激巨噬細(xì)胞向抗炎表型方向極化，且兩者都可抑制軟骨降解，阻斷小鼠OA發(fā)生[10]。

2.1.3 誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞來源外泌體

Zhu等[11]比較誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞來源外泌體與SMSC來源外泌體對(duì)小鼠OA的治療效果，結(jié)果顯示誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞來源外泌體治療效果更好。

2.1.4 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體

胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對(duì)OA具有良好的治療作用[12]。它通過增加Ⅱ型膠原合成和降低聚蛋白多糖酶降解酶-5表達(dá)維持軟骨細(xì)胞表型，并平衡軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解，阻止軟骨破壞。

2.2 糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死

糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死是一種進(jìn)展性、致殘性關(guān)節(jié)疾病，常由長期口服類固醇激素引起。骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，以及BMSC向脂肪細(xì)胞分化增加和骨形成畸形在這一病理過程中起著關(guān)鍵作用。因此，早期預(yù)防骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖，預(yù)防BMSC向脂肪細(xì)胞分化可能可阻止糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死進(jìn)展。

2.2.1 SMSC來源外泌體

Guo等[13]通過靜脈注射SMSC來源外泌體治療大鼠糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死，結(jié)果顯示治療組大鼠股骨頭軟骨下骨小梁完整且分布均勻，僅有20%的大鼠有非常輕微的骨壞死改變，對(duì)照組大鼠骨小梁厚度、骨體積(組織體積)、骨小梁數(shù)量明顯降低，出現(xiàn)明顯骨壞死，股骨頭松質(zhì)骨稀疏甚至消失。這表明促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖活性、抑制糖皮質(zhì)激素引起的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡可能是SMSC來源外泌體預(yù)防大鼠糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死的潛在機(jī)制。

2.2.2 其他類型外泌體

多項(xiàng)研究分別應(yīng)用了各種不同的外泌體包括突變型低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α修飾的BMSC來源外泌體[14]、誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞來源外泌體[15]、富血小板血漿來源外泌體[16]、BMSC來源外泌體[17]治療糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死，取得了相似且良好的效果。其原理為促進(jìn)BMSC、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)BMSC成骨分化及內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管分化，抵抗高糖皮質(zhì)激素引起的細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞蛋白激酶B(Akt)/Bad/Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些不同的外泌體通過促進(jìn)血管生成及骨生成方式有效阻止糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死發(fā)生和進(jìn)展。

2.3 骨缺損與骨折

目前骨缺損治療金標(biāo)準(zhǔn)是自體或異體骨移植，然而自體骨移植有創(chuàng)、來源有限，異體骨來源受限且有傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)。骨折和骨缺損常迫使患者長期臥床、活動(dòng)受限，可能帶來一系列致死的并發(fā)癥如深靜脈血栓形成、肺栓塞等。

2.3.1 誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞來源外泌體

Qi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞來源外泌體可促進(jìn)去卵巢大鼠BMSC增殖及增加堿性磷酸酶(ALP)活性，上調(diào)成骨細(xì)胞相關(guān)基因RUNX-2、COL1和ALPmRNA和蛋白表達(dá)，以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。外泌體復(fù)合β-磷酸三鈣(β-TCP)支架，可通過促進(jìn)骨缺損區(qū)域血管生成和成骨加速骨缺損修復(fù)。外泌體體內(nèi)外生物學(xué)效應(yīng)隨著其作用濃度增加而增強(qiáng)。

2.3.2 脂肪干細(xì)胞來源外泌體

Chen等[19]通過慢病毒轉(zhuǎn)染使脂肪干細(xì)胞高表達(dá)miR-375并產(chǎn)生富含miR-375的外泌體，將該外泌體裝載在水凝膠中促進(jìn)顱骨缺損模型大鼠骨再生，結(jié)果顯示miR-375能與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-3的 3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制IGFBP-3表達(dá)，從而促進(jìn)骨再生。胰島素樣生長因子(IGF)是具有促生長作用的多肽類物質(zhì)，廣泛分布于人體各種組織，IGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)須先與IGFBP-3解離。

2.3.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體

向大鼠股骨骨折區(qū)域植入結(jié)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的水凝膠能促進(jìn)血管生成和骨折愈合[20]。它不僅能增強(qiáng)成骨分化，還能增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和 HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成血管。HIF-1α能在低氧條件下調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，如使軟骨細(xì)胞適應(yīng)骨骼生長板的低氧環(huán)境，對(duì)胚胎發(fā)育、腫瘤血管生成、傷口上皮組織修復(fù)等具有重要作用。以往研究表明，HIF-1α可促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞分化，改善病變部位血管生成功能，從而促進(jìn)成骨和血管生成。

2.4 骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松的特點(diǎn)之一是骨量減少，其病因包括制動(dòng)、服用類固醇激素、衰老、自身免疫疾病等，主要病理生理過程包括骨形成與骨吸收失衡、血管生成減少等。骨質(zhì)疏松極易導(dǎo)致老年患者骨折并產(chǎn)生一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。

2.4.1 BMSC來源外泌體

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其參與細(xì)胞存活、增殖和分化。成骨細(xì)胞基因表達(dá)和功能與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。這一通路受阻可導(dǎo)致骨密度下降，骨小梁體積減少，長骨皮質(zhì)厚度減少，表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松。這些異常與內(nèi)皮細(xì)胞減少、骨小梁形成率降低及Ⅰ型膠原、ALP、骨橋蛋白和骨鈣素-23表達(dá)減少有關(guān)?？傊?，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生理活動(dòng)的重要通路。

Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BMSC來源外泌體處理的成骨細(xì)胞增殖增加，細(xì)胞周期S期比例增加，同時(shí)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)也增加，說明BMSC來源外泌體可通過激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，BMSC來源外泌體或可用于骨質(zhì)疏松的治療。

系統(tǒng)性硬化病(SSC)是一種自身免疫性疾病，這類患者除了皮膚進(jìn)行性纖維化、內(nèi)臟功能障礙、血管病變外，還常存在脊椎及其他骨骼骨量減少。SSC發(fā)生骨質(zhì)疏松的病理生理機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在TSK/+小鼠(一種伴有股骨骨密度顯著降低和松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)異常的SSC小鼠)中下調(diào)白細(xì)胞介素-4(IL-4)/白細(xì)胞介素-4受體α(IL-4Rα)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可改變小鼠骨量減少情況，說明IL-4參與骨質(zhì)疏松的病理生理過程[22]。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體能將miR-151-5p轉(zhuǎn)移到TSK/+小鼠BMSC內(nèi)，提高BMSC內(nèi)miR-151-5p表達(dá)，繼而抑制IL-4/IL-4Rα信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)BMSC成骨分化，增加礦化結(jié)節(jié)形成，上調(diào)Runx2、ALP和骨鈣素(OCN)等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)，增加體內(nèi)骨形成。

2.4.2 內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體

內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體較BMSC來源外泌體更具有骨靶向性和抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體可被骨髓來源的巨噬細(xì)胞內(nèi)化吸收并改變其形態(tài)，并抑制破骨細(xì)胞分化和活性，降低骨吸收，從而抑制骨質(zhì)疏松發(fā)生。內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體通過其表面高表達(dá)的妊娠帶蛋白(PZP)靶向作用于骨組織，產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)[24]。

3 展望

應(yīng)用各種來源的外泌體治療OA、骨質(zhì)疏松、糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死、骨缺損、骨折等骨科常見疾病已取得了良好的成果。外泌體來源豐富，可來源于BMSC、脂肪間干細(xì)胞、SMSC、內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞、富血小板血漿、樹突狀細(xì)胞、牛乳等。它的治療方式包括局部注射、全身注射、口服等。其作用機(jī)制涉及各種基因表達(dá)調(diào)控及各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，從而調(diào)控軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等生理活動(dòng)。

值得注意的是，學(xué)者們能控制和提高各種細(xì)胞中目標(biāo)miRNA表達(dá)水平，繼而將大量的目標(biāo)miRNA裝載在外泌體中達(dá)到治療疾病模型的效果，充分說明外泌體的可改造性及作為基因治療藥物載體的潛力。未來外泌體研究方向可著重于提高外泌體作用的靶向性，包括利用不同外泌體表面不同膜蛋白使其靶向作用于特定組織。外泌體基礎(chǔ)研究尚需解決的問題包括治療效率、具體機(jī)制、安全性、治療劑量、來源及統(tǒng)一性等。