付志斌王鵬志張秀琴

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）通常是由于股骨頭部位血液供應(yīng)障礙，局部微循環(huán)障礙，致使骨髓細(xì)胞和骨細(xì)胞死亡，導(dǎo)致骨壞死，隨之壞死部分塌陷，引起關(guān)節(jié)功能障礙，影響患者生活質(zhì)量。隨著物質(zhì)生活的持續(xù)豐富，飲酒、吸煙、長期高劑量使用激素在日常生活中，這些不良生活習(xí)慣導(dǎo)致NONFH的發(fā)病率逐年升高，15歲以上人群中大約有800萬NONFH患者［1］。目前認(rèn)為，NONFH與血管內(nèi)皮損傷、微循環(huán)障礙和骨代謝紊亂致使成骨細(xì)胞減少與凋亡相關(guān)［2，3］，其作用機(jī)制與Wnt信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）多向分化有密切聯(lián)系，本文就Wnt信號通路與BMSCs分化的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述，并探討其與NONFH發(fā)病的相關(guān)性，以期為NONFH的防治提供新的思路。

1 BMSCs生物學(xué)特性

BMSCs存在于大多數(shù)胎兒和成人組織中，可在骨髓、臍帶血、胎盤、牙髓、脂肪組織和滑膜等組織中廣泛獲取。一方面，它是一種多能干細(xì)胞，可在體外增殖并向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多向分化［4，5］；另一方面，其分化潛能、體外擴(kuò)增、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、易獲性等，使BMSCs成為各種先天性和后天性疾病的理想治療方法［6］。雖然BMSCs存在體外復(fù)制衰老，從而限制了細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量，但就其在再生醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的前景，仍讓眾多醫(yī)療工作者對其治療早中期NONFH充滿新的希望。

2 Wnt信號通路

Wnt信號通路是由配體蛋白Wnt、膜蛋白受體、胞內(nèi)信號傳遞成分、胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分組成，包括經(jīng)典Wnt信號通路（Wnt/β-catenin信號通路）和非經(jīng)典Wnt信號通路（平面細(xì)胞極性通路、Wnt/Ca+通路等）。Wnt配體蛋白通過激活細(xì)胞表面相應(yīng)受體，誘導(dǎo)細(xì)胞極化，并激活其譜系特異性信號通路，進(jìn)而對下游信號通路產(chǎn)生調(diào)控作用［7］。該信號通路廣泛存在于多細(xì)胞生物進(jìn)化過程中且極具高度保守性與細(xì)胞依賴性，對細(xì)胞增殖、生長有較為重要的調(diào)控作用。有研究證明，其對骨細(xì)胞的增殖和分化、新生血管形成、炎癥反應(yīng)也具有一定的調(diào)控作用［8］。

3 影響Wnt信號通路與BMSCs分化的因素

3.1 蛋白與基因的調(diào)節(jié)

3.1.1 脂聯(lián)素。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）主要是由脂肪細(xì)胞合成并向血液中分泌的多功能激素蛋白［9］。研究表明，APN可通過自分泌或旁分泌途徑、內(nèi)分泌途徑影響胰島素信號通路作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)而影響骨代謝［10］。Wang Y等［11］在BMSCs分化過程中檢測到AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)，重組了含有人APN基因的腺病毒，然后在體外將該腺病毒轉(zhuǎn)染到BMSCs或?qū)⑵渥⑷雱游锬Ｐ偷墓侨睋p區(qū)域，最后通過實(shí)時熒光定量PCR，免疫印跡與熒光，HE染色和顯微CT檢測到Wnt/β-catenin信號通路激活、成骨相關(guān)基因/蛋白表達(dá)增加和新骨形成，從而證明APN可以通過Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)BMSCs成骨分化和骨形成。

3.1.2 基因。MicroRNA（miRNA）是由多個核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在真核生物中可調(diào)節(jié)30%的基因表達(dá)。其通過靶定到mRNA3’非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，提示miRNA可為基因表達(dá)提供一種快速準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)機(jī)制，因此，miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的錯亂，將引起多種疾患，如免疫性疾病、心血管疾病、癌癥、骨關(guān)節(jié)疾病等難治愈性疾病［12-15］。最近研究表明，miRNA是誘發(fā)NONFH最重要的影響因子之一，其表達(dá)量改變能造成嚴(yán)重的病理狀態(tài)［16］。而miRNA密切參與控制BMSCs成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵步驟，這為治療NONFH提供了新的方向［17］。miR-30e表達(dá)抑制可促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx、Ocn、ALP和BSP的表達(dá)，同時抑制脂肪細(xì)胞的分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化。LRP6是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵輔助受體和miR-30e的直接靶標(biāo)，miR-30e通過抑制LPR6的表達(dá)來阻斷Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)，從而抑制BMSCs的多向分化［18］。Wang H等［19］在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證明miR-101通過靶向ezh2（mir-101的靶基因）激活了Wnt/β-catenin信號通路，而β-catenin抑制劑ICG-001抑制了β-catenin的表達(dá)。阻斷Wnt/β-catenin信號通路的傳導(dǎo)，從而逆轉(zhuǎn)了miR-101的促進(jìn)作用，抑制BMSCs成骨分化，最終影響體內(nèi)骨形成。因此，可證明miR-101可通過靶向ezh2/wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)成骨分化。Long H等［20］探討miR-139-5P和ALP在BMSCs成骨分化中的作用，通過檢測成骨基因的表達(dá)和ALP活性發(fā)現(xiàn)抑制miR-139-5P能顯著促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，其作用機(jī)制可能是通過miR-139-5P靶向Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵因子CTNNB1和Frizzled4（FZD4）在BMSCs成骨中發(fā)揮作用。

3.2 藥物有效成分與激素調(diào)節(jié)

3.2.1 小檗堿。中藥黃連的主要有效成分為小檗堿（Berberine，BBR），在臨床中常作為抗炎、抑菌、調(diào)脂等藥物［21］。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，BBR可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞生成、骨吸收以及抑制脂肪生成而廣泛用于骨關(guān)節(jié)疾病。在諸多信號通路當(dāng)中，Wnt信號通路在NONFH中研究頗多，參與調(diào)控骨代謝紊亂，維持成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞含量比，β-catenin、Runx2、DKK-1、β-catenin SiRNA等是Wnt信號通路的關(guān)鍵組成成分［22］。Tao K等［23］通過研究發(fā)現(xiàn)，BBR可激活Wnt/β-catenin信號通路，促使β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與Runx2啟動子上的TCF1形成復(fù)合物，隨后上調(diào)Runx2靶基因OPN和OCN表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨分化，抑制成脂作用，最終增強(qiáng)BMSCs的成骨分化。

3.2.2 黃酮類化合物。黃酮類化合物是植物新陳代謝重要的次生代謝產(chǎn)物，包括黃酮、黃酮醇、黃烷醇、異黃酮和花色素等，具有影響血液流變、抗氧化、改善微循環(huán)、抗缺氧、抗炎、降低血管脆性等多種藥理作用［24］。黃酮類化合物可通過雌激素受體（ER）信號通路、BMP-2/Smads/Runx2/osterix信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路、NF-κB信號通路等影響成骨細(xì)胞分化［25］，其中Wnt/β-catenin信號通路可通過促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化、減少成脂細(xì)胞分化，增加新骨生成量，從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)早中期NONFH。Gu Q等［26］在體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用傳統(tǒng)中藥銀杏葉（GBE）刺激BMSCs分化，通過檢測BMP4、Runx2、β-catenin和細(xì)胞周期蛋白D1含量，發(fā)現(xiàn)這些檢測指標(biāo)在GBE促進(jìn)BMSCs成骨過程中顯著增加。同時，使用信號抑制劑進(jìn)行功能喪失試驗(yàn)，證實(shí)了BMP和Wnt/β-catenin信號通路在骨形成過程中至關(guān)重要。這表明，GBE可通過激活BMP和Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化以提升骨形成量。Ying X等［27］探討楊梅黃酮類化合物對體外培養(yǎng)的BMSCs成骨分化的影響，使用MTT比色法、茜素紅S染料、堿性磷酸酶（ALP）活性測定、實(shí)時熒光定量PCR和Western blot分析評價成骨分化情況，發(fā)現(xiàn)楊梅黃酮類化合物能增強(qiáng)BMSCs分化過程中ALP活性、Runx2的mRNA表達(dá)和礦化作用。同時，楊梅素可激活Wnt/β-catenin信號通路，增加下游靶基因Runx2的表達(dá)，進(jìn)而說明楊梅黃酮類化合物通過激活Wnt/β-catenin信號通路來增強(qiáng)BMSCs的成骨分化。

3.2.3 神經(jīng)激素。神經(jīng)激素是確保骨吸收和骨形成平衡的因素之一，其對骨代謝的影響是雙向的，取決于體內(nèi)激素含量的高低，當(dāng)下丘腦β1和β2腎上腺素能系統(tǒng)激活時，骨組織中的β2受體激活骨形成并增加骨吸收；但是當(dāng)外周β2受體慢性刺激時，可加快骨丟失并改變骨骼硬度。對骨代謝具有確切調(diào)控作用的神經(jīng)激素有神經(jīng)肽Y（NPY）和神經(jīng)酰胺U等［28，29］。NPY作為一種調(diào)節(jié)信號功能的激素，可在部分細(xì)胞和組織中促進(jìn)BMSCs向成骨和成血管化分化。Wu J等［30］在誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抗凋亡過程中，發(fā)現(xiàn)NPY可激活Wnt/βcatenin信號通路，提高β-catenin和c-myc蛋白的基因和蛋白表達(dá)水平；同時，發(fā)現(xiàn)DKK1可抑制NPY的增殖和抗凋亡活性，DKK1還可阻斷β-catenin、PGSK-3β和c-myc蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)。因此，此研究的結(jié)果表明，NPY在體外以適宜劑量通過Y1受體介導(dǎo)，并參與Wnt/β-catenin信號通路的激活，發(fā)揮對BMSCs增殖和保護(hù)作用。總之，神經(jīng)肽物質(zhì)可以通過促進(jìn)β-catenin和c-myc等蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)以及促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位來激活Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，提高BMSCs的存活率，進(jìn)而發(fā)揮BMSCs成骨分化潛能［31］。

3.3 其他Sirtuin 1（sirt1）是調(diào)節(jié)BMSCs成脂和成骨分化的關(guān)鍵因子，其過度表達(dá)可抑制sfrp1、sfrp2和dact1的mRNA表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制BMSCs成脂細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄，從而減少成脂細(xì)胞分化，增加成骨細(xì)胞分化［32］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（pparγ），是配體誘導(dǎo)核受體的核激素家族成員之一，參與諸多細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，與骨代謝密切相關(guān)的BMP和Wnt，通過Wnt/β-catenin信號通路抑制pparγmRNA的表達(dá)，而其余Wnt信號通路通過激活組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，抑制pparγ的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化［33，34］。

4 小結(jié)

BMSCs具備多向分化，易獲得，快速增殖，低免疫原性和高便攜性的能力，可以作為治療NONFH的理想種子細(xì)胞。因此，通過研究Wnt信號通路調(diào)控BMSCs多向分化的不同誘導(dǎo)因素，從而充分發(fā)揮BMSCs向成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，有研究發(fā)現(xiàn)，上述的多種蛋白及基因在NONFH的發(fā)病中也具有一定的調(diào)控作用［13］，所以二者存在一定的相關(guān)性。但是，同時也存在亟待解決的新問題：由于股骨頭壞死部位血液供應(yīng)不足，細(xì)胞存活缺失營養(yǎng)和自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致移植的BMSCs活力降低；存在許多與骨代謝相關(guān)的信號通路，彼此之間相互作用、錯綜復(fù)雜，故還需進(jìn)一步研究各種誘導(dǎo)因素如何通過Wnt信號通路促使BMSCs向成骨分化的分子信號機(jī)制，對其機(jī)制的明確闡述有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NONFH的發(fā)病機(jī)制，從而為股骨壞死的防治發(fā)揮關(guān)鍵作用。為再生醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)開辟新的領(lǐng)域，為科學(xué)研究和臨床醫(yī)生提供治療NONFH的新思路，為NONFH患者帶來減輕疾病疼痛的新希望。