林萍萍 黃驊港海關(guān) 河北渤海新區(qū)黃驊港（河北，黃驊，061600）

近年來，隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，改良品種、優(yōu)化牛類種群遺傳性能的需求日益增加，境外引種就成了重要途徑，其促進我國養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟貿(mào)易發(fā)展的同時，也增加了疫病傳入的風險［1-2］。 加強進境種牛檢驗檢疫和監(jiān)管已成口岸動物檢疫面臨的重要課題， 實驗室疫病檢疫發(fā)揮著重要的作用。酶聯(lián)免疫 （Enzyme-linked immunosorbnet assay，ELISA） 是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，原理是抗原或抗體吸附于固相載體進行免疫酶反應(yīng)，經(jīng)底物顯色后用酶標儀進行檢測，由于待測譜物的含量與呈色物質(zhì)的顏色具有相關(guān)性，因此可以通過顏色的不同來達到定性定量分析待測樣品的目的。 由于ELISA 方法具有操作簡單、 靈敏度高和特異性高等特點，并且適合批量樣品檢測，因此廣泛應(yīng)用于口岸進境種牛疫病檢測［3-6］。但實驗室在實驗操作過程中因諸多因素影響檢測結(jié)果的準確性，即會出現(xiàn)一些假陽性或假陰性，因此，有必要深入分析其影響因素，并優(yōu)化方法、規(guī)范實驗操作，確保實驗結(jié)果準確有效，把好國門生物安全，也為動物疫病檢測工作的開展提供依據(jù)。 本文就種牛疫病ELISA 檢測的影響因素從“人、機、料、法、環(huán)”等多個方面進行分析。

1 人的因素

實驗室專業(yè)技術(shù)人員是開展動物疫病檢測的中心人員， 是影響實驗結(jié)果準確性的重要因素，因此要求從事相關(guān)工作的實驗室人員要求必須具備較強的專業(yè)知識和熟練的操作技能。 在種牛疫病ELISA 檢測實驗中， 血清樣品處理、 移液器使用不當、酶標洗板的徹底程度等都會對結(jié)果造成直接的影響。 為此，應(yīng)對實驗人員定期組織開展業(yè)務(wù)培訓考核、能力驗證和人員比對等，持續(xù)保證實驗人員熟悉實驗操作流程和儀器設(shè)備的操作能力，以便保質(zhì)保量地完成動物疫病檢測工作。

2 機的因素

儀器設(shè)備的準確度是進行實驗檢測最基本的要求，是影響檢測結(jié)果的直接因素之一。 不同廠家儀器設(shè)備存在檢測性能的差異，如洗板機，進口的性能要高于國產(chǎn)，在洗板時洗出的徹底。 為了確保檢測結(jié)果真實有效，實驗室應(yīng)定期對檢測儀器進行計量檢定、維護，使用前進行校準，確保儀器可以正常運行。

3 料的因素

3.1 樣品因素

待檢樣品的質(zhì)量是確保實驗結(jié)果準確性的重要因素，因此樣品要求新鮮和純凈。種牛疫病ELISA實驗一般采用種牛血清進行檢測。

3.1.1 樣品采集及送檢

在采集樣品時，應(yīng)使用無菌采集針管，盡量避免反復顛倒，嚴防樣品溶血的產(chǎn)生，因樣品的溶血血紅蛋白中含有類過氧化物酶活性的亞鐵血紅素，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA 實驗中，會增加非特異性顯色造成假陽性結(jié)果的產(chǎn)生［7］，因此，應(yīng)盡量避免溶血，對于嚴重溶血樣品需重新采樣。 工作人員需要對采集的樣本進行檢查，包括樣品質(zhì)量、數(shù)量、標識、記錄等，避免出現(xiàn)樣品采集錯誤。及時將樣品送往實驗室檢測，血清樣品放置時間過長， 易受細菌污染， 而細菌體內(nèi)可能有內(nèi)源性HRP，出現(xiàn)非特異性顯色，造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.1.2 樣品處理

分離血清需要注意幾點問題：分離血清時核對好樣品編號，樣品一式兩份，一份待檢樣品，一份留樣保存，血清可冷藏自然析出，也可離心析出，但需控制離心的速度和時間，過度離心會造成紅細胞破裂，影響實驗結(jié)果。

3.1.3 樣品保存

如不能及時檢測， 應(yīng)將樣品冷藏或冷凍保存，盡量避免反復凍融，反復凍融會破壞樣品中的蛋白分子如抗體，造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。 一般來說，一周之內(nèi)進行檢測，將樣品存放在2-8 ℃即可，如因特殊原因需延時檢測， 可將樣品及時分裝后放置于-20 ℃或-80 ℃冷凍保存。

3.2 試劑因素

3.2.1 試劑盒的選擇

選擇合適的試劑盒是保證實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素。 目前口岸種牛疫病檢測常用進口試劑盒如IDVET、BIOVET、kernel 等，實驗結(jié)果表明不同廠家的試劑盒由于采用的方法（競爭ELISA、阻斷ELISA、夾心ELISA 等）不同，檢測結(jié)果存在差異性。 因此選購試劑盒時，需全面了解其技術(shù)參數(shù)、性能指標，使用時注意試劑盒的有效期及保存溫度，如果保存不當或使用過期試劑盒均會影響實驗結(jié)果。另外，同一廠家試劑盒不同批次之間不能混用， 因其制作過程很難保證質(zhì)量完全一致，容易造成結(jié)果差異現(xiàn)象。

3.2.2 試劑盒的回溫

在實驗過程中對試劑的準備考慮不周，經(jīng)常會出現(xiàn)試劑盒從冰箱剛拿出來就開始實驗，會出現(xiàn)陽性對照、洗滌液等試劑沒有化開的現(xiàn)象，從而影響實驗反應(yīng)時間，其直接后果會導致對一些弱陽性樣品的檢測出現(xiàn)假陰性。 因此在ELISA 實驗開始前，最為關(guān)鍵的是將試劑盒提前從冰箱里拿出來，按說明書要求在室溫放置30 min 至與室溫平衡，并避免陽光直射，其目的是使微孔內(nèi)的溫度能較快地達到后面測定的需求溫度。

4 法的因素

檢測方法、標準規(guī)范和質(zhì)量控制程序及其相關(guān)計劃是也是影響實驗結(jié)果的直接因素之一。 檢測方法嚴格按照標準和相關(guān)技術(shù)規(guī)范進行選擇，種牛疫病ELISA 檢測時應(yīng)遵循標準選擇相適宜的試劑盒，并定期對檢測流程和標準進行修訂，避免在檢測過程中使用已作廢的方法，從而影響實驗結(jié)果的準確性。 實驗室的質(zhì)量控制及其相關(guān)計劃是監(jiān)控檢測過程最有效的手段，按計劃進行實驗人員比對、留樣再測、測量審核等質(zhì)量控制，確保檢測數(shù)據(jù)的準確性，在此過程中如出現(xiàn)異常，及時找出原因，并提出改進的相關(guān)措施。 適宜的檢測方法和標準能夠為實驗人員提供較好的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導。

5 環(huán)的因素

實驗室的環(huán)境是影響實驗結(jié)果的先決條件，即檢測過程所在的環(huán)境溫度、濕度及純潔度等，必須滿足國家相關(guān)的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)范或標準的要求［8］。室溫對ELISA 實驗結(jié)果有影響，室溫偏低會對樣品和試劑產(chǎn)生影響，導致反應(yīng)速度慢，進而影響實驗結(jié)果。 實驗過程中所用的物品及周邊環(huán)境受到污染，也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。 對此，應(yīng)每周對實驗室的溫濕度等相關(guān)記錄進行查巡并實時記錄，定期對實驗室進行清潔消毒，保證實驗室環(huán)境滿足實驗要求，消除其對實驗室結(jié)果帶來的影響。

6 實驗關(guān)鍵環(huán)節(jié)的因素

6.1 加樣

加樣是影響ELISA 結(jié)果的最常見的因素，樣品稀釋，嚴格按照不同試劑盒對樣品稀釋倍數(shù)的規(guī)定進行操作，其目的是減少非特異性反應(yīng)，所以在檢測過程中一定是先加稀釋液再加樣品。 需要引起注意的是加樣后要在微量振蕩器上震蕩混勻30 s，防止溢出。

在種牛疫病ELISA 初篩實驗中，由于檢測量比較大，一般采用多通道微量移液器，使用多通道微量移液器需要注意幾點：正確使用，使用前調(diào)整移液器的加樣量；加樣速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準確度和均一性；避免將樣品加到反應(yīng)孔壁上，因為孔壁上部是非包被區(qū)，易導致非特異性吸附，造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；避免產(chǎn)生氣泡和濺出，氣泡會引起反應(yīng)界面差異，濺出會造成相鄰孔污染；避免槍頭碰觸到孔底部，并保持孔外底部潔凈，有利于酶標儀檢測。 移液器長時間使用會出現(xiàn)磨損， 或內(nèi)部附著血痂等原因造成加樣不準確，因此有必要定期對移液器進行維護和計量校準。 此外，樣品較多時應(yīng)分批檢測，避免加樣后溫育前等待時間超時。

6.2 溫育

溫育是ELISA 檢測中最關(guān)鍵、也是最容易出現(xiàn)問題的環(huán)節(jié)。 ELISA 實驗中抗原抗體反應(yīng)必須保證一定時間的溫育，且溫育所需要的時間一般與溫度成反比。 種牛疫病檢測中最常用的溫度是37℃和室溫，溫度過高或溫育時間不夠，易造成弱陽性樣品漏檢情況。 因此，在日常檢測過程中，要嚴格按試劑盒說明書控制溫育的時間和溫度，不能人為延長或縮短溫育時間，應(yīng)根據(jù)不同的室溫條件及時調(diào)整溫箱的溫度， 在溫箱放置溫濕度計來測量觀察即可。溫育時，需在酶標板表面貼粘膜，防止孔內(nèi)液體蒸發(fā)或水珠等異物掉入孔內(nèi)引起污染。 切記封板膜不能重復使用，以免引起交叉污染。

6.3 洗板

洗板是ELISA 實驗中操作次數(shù)最多的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)引起實驗人員的重視。 洗板次數(shù)減少、洗板不徹底造成殘留，可能引起假陽性結(jié)果的產(chǎn)生；洗板次數(shù)過多，可能會洗脫掉抗原抗體結(jié)合物，引起假陰性結(jié)果。 無論是手工洗板還是洗板機洗板，要嚴格按照試劑盒說明書規(guī)定的洗滌次數(shù)、 洗滌體積、洗滌時間進行操作，不能人為改變洗板要求。 在洗板的過程中，盡量保證操作標準，如避免洗板液過多溢出孔外，甩板要快速干凈，使用干凈的濾紙不在同一地方重復拍板等，操作的準確與否直接影響檢測結(jié)果的重復性和準確性。

7 結(jié)語

口岸進境動物檢驗檢疫的核心任務(wù)就是防止危險性疫病疫情傳入國內(nèi)，控制動物疫病跨境傳播和擴散［9］，保障我國養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動物生命和人民的身體健康，因此做好口岸動物疫病檢驗檢疫工作尤為重要。ELISA 自建立以來，由于其自身的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于海關(guān)、獸醫(yī)實驗室、科研單位等，但實驗過程中有諸多因素影響檢測結(jié)果的準確性，應(yīng)對其原因進行深入分析，并及時進行整改。 首先要保證實驗室環(huán)境設(shè)施和儀器設(shè)備處于良好狀態(tài)；其次，實驗涉及的試劑及檢測方法必須標準化，及時更新檢測標準和技術(shù)規(guī)范； 另外實驗技術(shù)人員需定期培訓，加強業(yè)務(wù)學習，提高專業(yè)技能，嚴格按照實驗室規(guī)章要求進行樣品的檢測，在一次又一次的實踐中對這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行探索和優(yōu)化，認真避免或減少影響因素， 盡量避免假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提升口岸動物疫病的檢驗檢疫技術(shù)水平，確保數(shù)據(jù)準確可靠，從而保障國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。