李雨含， 李嘉鑫， 張詩銘， 張耀華， 李雨慶， 曾菊梅

1. 口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 四川大學華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）；2. 四川大學華西公共衛(wèi)生學院/華西第四醫(yī)院，四川 成都（610041）

齲病是發(fā)生于牙體硬組織的慢性菌斑性疾病，主要致齲病原體是變異鏈球菌。大量研究表明，噬菌體不僅能有效感染特定的宿主細菌，還可以裂解生物膜，達到傳統(tǒng)抗菌藥物無法實現(xiàn)的穿透生物膜的效果。

近年來，已有多個領域開展噬菌體的臨床應用，在齲病相關方面有數(shù)項實驗室研究的進展。本文將從變異鏈球菌噬菌體與齲病防治方面作一綜述，希望能為齲病防治工作提供一種新的可能性。

1 傳統(tǒng)齲病防治策略面臨的問題

齲病是以細菌為主要病原菌的牙體硬組織慢性進行性破壞的疾病。許多研究表明變異鏈球菌是主要的致齲菌之一，其致齲性主要包括產酸和耐酸力強、能合成細胞內外多糖、對牙體組織粘附力強。值得強調的是，齲病的發(fā)生不是單純的致齲菌導致的，而是牙菌斑生物膜微生態(tài)失衡的結果。牙菌斑生物膜是粘附在牙體組織表面的一種整體生存的微生物生態(tài)群體。當細菌以生物膜形式存在時耐藥性明顯增強，抗菌劑不僅不能有效清除生物膜，還可能誘導耐藥性產生。生物膜參與耐藥形成有多種機制，如物理屏障作用、細菌密度感應系統(tǒng)［1］、生物膜中基因表型改變、氧化應激反應［2］等；但這些機制都不是單獨存在的，不同機制間可能存在協(xié)同作用。

目前臨床上對口腔齲齒的防治方式多是利用機械手段或者化學抗菌劑的方法來抑制消滅這些口腔細菌和菌斑。但由于抗菌劑的作用是非特異的，可將口腔內的致病菌和有益細菌一起清除，最終破壞口腔環(huán)境生態(tài)平衡，并導致新的疾病發(fā)生。近年來，致病菌的耐藥病例日漸增多，耐藥現(xiàn)象給臨床抗感染治療留下了極大挑戰(zhàn)。目前認為致病菌的耐藥性與生物膜形成有關，因為生物膜使得傳統(tǒng)抗菌劑無法有效對致齲細菌發(fā)揮作用［3］。

2 噬菌體及其基本特性

噬菌體是一類由蛋白質外殼和核酸組成的細菌依賴性的病毒，也稱細菌病毒。大多數(shù)噬菌體結構為有尾部結構的二十面體，包括了一個二十面體的頭部，一個中空的針狀結構及外鞘組成的尾部，以及尾絲和尾針組成的基部。對于有尾噬菌體來說，依據(jù)其尾部結構又可以分為長尾噬菌體科、短尾噬菌體科和肌尾噬菌體科。變異鏈球菌噬菌體屬于其中的長尾噬菌體科，頭部為等軸二十面體衣殼，尾部為非收縮性長尾，其衣殼直徑估計為（67 ± 0.4）nm，非收縮尾的長度估計為（283 ± 7）nm，寬（8.3 ± 0.1）nm［4］。

噬菌體通常具有感染特異性、宿主依賴性、指數(shù)增殖等特性。另外，噬菌體能夠產生一種肽聚糖水解酶，即噬菌體裂解酶。裂解酶靶向接觸特定的細菌，導致細菌細胞壁中的肽聚糖快速水解而使細菌迅速裂解死亡［5］。除了浮游細菌，裂解酶還可以破壞生物膜基質，或通過降解細菌之間的交流信號的酶，破壞生物膜中細菌的群體感應，從而有效裂解生物膜［6］。

3 變異鏈球菌特異性噬菌體的發(fā)現(xiàn)

眾多實驗室研究已經證明，噬菌體能有效地殺滅浮游細菌以及裂解生物膜。但是生物膜的特殊結構可能成為噬菌體的完美避難所，使得變異鏈球菌噬菌體難以分離。目前已有的關于變異鏈球菌噬菌體分離及鑒定的研究數(shù)量并不多。

最早Greer 等和Klein 等觀察到幾株變異鏈球菌裂解并釋放出病毒顆粒，表明可能存在原噬菌體。1977 年，Brady 等通過電子顯微鏡從一位患者的牙菌斑樣本中觀察到了噬菌體樣顆粒。這些噬菌體樣顆粒截面為六邊形，直徑約為1 100 nm，中央含有一個高密度的核。1988 年，Armau 等成功地從1 000 多個牙菌斑樣本中分離出了變異鏈球菌的 特 異 性 噬 菌 體M102。1993 年，Delisle 和Rost?kowski 證實并擴展Armau 等的初步觀測結果，從中分離出了三種變異鏈球菌噬菌體，經鑒定均為烈性噬菌體，分別命名為M102、e10 和f1［7］。三者形態(tài)同屬于長尾噬菌體科。三種噬菌體的基因組均由長31～35 kb 的線性雙鏈DNA 組成且具有一些共同序列，表明其可能來自相同的祖先。

2012 年，Delisle 等［4］對來自同一實驗室不同批次的M102 噬菌體再次測序分析，在其中發(fā)現(xiàn)了M102AD。M102AD 同樣為烈性噬菌體，其形態(tài)、尺寸與M102 一致，在核苷酸水平也高度相似。噬菌體M102AD 只能感染少數(shù)血清型c 菌株，與此同時c 特異性抗血清可以阻斷M102AD 的吸附。

2015 年，Dalmasso 等［8］分離出了一種新型變異鏈球菌噬菌體φAPCM01。噬菌體φAPCM01 亦屬于長尾噬菌體科，核苷酸水平與M102、M102AD 相似性達85%，能在數(shù)小時內有效地抑制變異鏈球菌的生長及其生物膜代謝活動。

4 噬菌體在齲病防治中的應用前景

目前齲病防控已經比較成熟，主要有刷牙等機械方法以及潔牙、涂氟、窩溝封閉等臨床預防手段；在某些情況下還可在機械性控制菌斑的基礎上，配合抗菌劑使用。目前常見的防控措施都對公眾的口腔健康意識提出了較高的要求。根據(jù)2017 年第四次全國口腔健康流行病學調查，5 歲兒童患齲率為70.9%，12 歲兒童恒牙患齲率為38.5%，35～44 歲年齡組恒牙患齲率為89.0%，仍有待改善［9］。

目前替代抗生素的優(yōu)選方案有一半是基于噬菌體完成的，噬菌體相關制劑現(xiàn)已應用于皮膚潰瘍、化膿性感染、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染、傷口感染預防、燒傷、呼吸道感染等臨床問題中，以及食品安全、工業(yè)、農業(yè)等領域。對于噬菌體相關制劑的研發(fā)主要包括野生型噬菌體、工程噬菌體和噬菌體裂解酶三個方面。

4.1 經典的活噬菌體制劑

通過分離特異性噬菌體直接用于抗菌治療。活噬菌體制劑在特異性、親和力、安全性方面都表現(xiàn)良好，但由于結構較不穩(wěn)定，通常不能在未冷卻的情況下儲存［10］?，F(xiàn)有的活噬菌體制劑可以通過凍干、噴霧干燥、添加穩(wěn)定性增強劑的方式，或將噬菌體并入軟膏、可生物降解聚合物基質或微粒中加工成較穩(wěn)定的制劑，在一定程度上解決穩(wěn)定性的問題［11］。

4.2 噬菌體裂解酶制劑

噬菌體產生的裂解酶可以消化細菌細胞壁，從而釋放組裝好的噬菌體顆粒，其在裂解生物膜中也同樣表現(xiàn)優(yōu)異。噬菌體裂解酶制劑與活噬菌體制劑相比較而言，其分子量小，穩(wěn)定性更高。Vázquez 等［12］將噬菌體裂解酶用于下呼吸道感染的研究，顯示出其特異性的快速致死能力，并且不會影響目標細菌以外的其他菌群。Delisle 等［4］將多種變異鏈球菌噬菌體（M102、e10 和f1）的裂解酶加入牙膏、漱口水等中來防治齲齒及其他口腔疾病。Yang 等［13］發(fā)現(xiàn)了第一種可對抗變異鏈球菌所有已知的血清型的噬菌體裂解酶，能夠廣譜裂解大多數(shù)鏈球菌，其通過改造裂解酶中與感染宿主有關的結構域，構建出嵌合裂解酶，從而改善裂解活性，擴大宿主譜。

4.3 工程噬菌體

噬菌體展示技術有十多年的歷史，現(xiàn)在已成為公司抗體制備的主要工具，通過將外源基因片段與噬菌體特定蛋白基因在其表面進行融合表達，從而展示出特定的外源肽。

2018 年諾貝爾化學獎得主Gregory P.Winter 和George P.Smith 在噬菌體展示技術的基礎上，將抗體抗原結合位點的遺傳信息插入到噬菌體DNA中，篩選出能與抗體特異性高度結合的噬菌體，為單抗藥物的開發(fā)提供理論基礎［14］。Alam 等［15］利用該技術合成出帶有多種抗原結合片段（Fabs）的噬菌體庫，并篩選出針對主要致齲病原體（變異鏈球菌和遠緣鏈球菌）的抗原結合片段。篩選出的抗原結合片段中，F(xiàn)ab SM?10、Fab SS?2 分別顯示出對變異鏈球菌和遠緣鏈球菌生物膜的較強生長抑制作用。Alam 等［15］再通過動物實驗，將前述兩種抗原結合片段注入提前已感染致齲病原體并長期接受生齲飲食的小鼠體內。動物實驗結果顯示注入抗原結合片段的小鼠與對照組小鼠相比，齲齒總數(shù)明顯減少，提示抗原結合片段具有阻止齲齒形成的能力，這為齲病的防治帶來新的啟發(fā)。

5 噬菌體治療的優(yōu)勢及局限性

5.1 噬菌體治療的優(yōu)勢

首先，特異性是噬菌體治療的關鍵之一，即噬菌體只針對感染的病原體，而不傷害其他共生菌群；其次，噬菌體的親和力通常很高，能快速吸附宿主細菌，從而發(fā)揮功能；最后，因為噬菌體的高度特異性，不攻擊人體細胞，并且目前沒有臨床試驗表明其存在免疫并發(fā)癥的副作用，所以理論上將其開發(fā)成藥物具有較高的安全性。

另外，相比于傳統(tǒng)抗菌藥物，噬菌體還具有很強的生物膜降解能力，這是它獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)抗菌藥物由于無法大量滲透生物膜形成的物理屏障，往往不能有效消滅菌斑生物膜。噬菌體產生的裂解酶不僅可以破壞細菌的細胞壁結構，還能摧毀生物膜基質從而穿透生物膜［16］，所以噬菌體療法作為一種抗生物膜措施，在齲病防治方面有巨大潛力。

5.2 噬菌體治療面臨的困境

目前對于齲病致病菌特異性噬菌體的發(fā)現(xiàn)仍較少，特別是對于變異鏈球菌噬菌體的分離鑒定的研究并不多見；另外由于噬菌體的高度特異性，一種噬菌體只能感染一種細菌，治療疾病時可能需要多種噬菌體共同參與；如果將噬菌體運用到齲病防治工作中，更多的齲病病原菌特異性噬菌體的分離鑒定實驗還有待開展。

噬菌體具有抗原性，一方面可以通過促進人體固有免疫清除細菌，另一方面其免疫原性可誘導特異性體液記憶［17］，可能引起人體免疫合并癥。烈性噬菌體快速溶解細菌導致內毒素和炎癥介質的釋放，也為免疫反應提供條件，但目前沒有臨床試驗表明相關免疫并發(fā)癥的發(fā)生。

另外，細菌可能產生噬菌體感染抗性。有研究顯示細菌中存在CRISPR?Cas 系統(tǒng)［18］，可能作為細菌的抗性機制抵御噬菌體感染；但是在理論上噬菌體有能力與宿主細菌共同進化，進化出克服細菌抗性機制的能力；并且有研究顯示多種噬菌體混合的雞尾酒療法可以避免這種抵御噬菌體感染的機制產生［19?20］。

最后，噬菌體具有復雜的藥效學/藥代動力學，需要大量的臨床試驗探討其作為藥物的給藥途徑、優(yōu)化劑量等［21］，這為噬菌體相關制劑作為正式的治療措施提出挑戰(zhàn)，也是噬菌體應用到臨床防治工作中所要面對的最大難題。

6 結 語

噬菌體具有優(yōu)異的抗生物膜能力，并且只特異性攻擊宿主細菌，因此它理論上適用于齲病防治；但與大多數(shù)感染性疾病不同，齲病與多種細菌定植相關，而噬菌體往往宿主范圍狹窄。因此，在臨床防治工作中可以通過噬菌體聯(lián)合傳統(tǒng)治療或其他藥物使用，或使用多種噬菌體的雞尾酒療法來克服這類問題。

【Author contributions】Li YH wrote the article. Li JX，Zhang SM，Zhang YH，Li YQ collected the references. Zeng JM reviewed the arti?cle. All authors read and approved the final manuscript as submitted.