王馨蕊，湯回花，劉畢琴，陳駿飛，趙 楠，史 巧*，李 宏

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650000；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610000）

發(fā)酵是蔬菜的主要加工方法，中國具有地方特色的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品豐富多樣，年加工量較大。亞硝酸鹽是發(fā)酵蔬菜中主要的有害代謝產(chǎn)物，其引發(fā)的高鐵血紅蛋白癥及在機體內(nèi)形成致癌物亞硝胺會對人體健康造成較大危害。在蔬菜發(fā)酵過程中，有害代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽有逐漸上漲的趨勢，積累量達到最大時稱為亞硝峰，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，亞硝酸鹽又逐步緩慢降低。中國對腌漬蔬菜中的亞硝酸鹽含量已有限量標(biāo)準(zhǔn)，通過延長發(fā)酵周期保證產(chǎn)品中亞硝酸鹽不超過規(guī)定范圍的方法已不能適應(yīng)現(xiàn)代企業(yè)及消費市場需求?，F(xiàn)有發(fā)酵蔬菜加工企業(yè)通過延長發(fā)酵時間來確保產(chǎn)品中亞硝酸鹽在限量范圍內(nèi)的方法，很大程度上加長了企業(yè)的生產(chǎn)周期，不利于加工企業(yè)更加高效的運轉(zhuǎn)。此外，為適應(yīng)消費者需求開發(fā)的快速發(fā)酵蔬菜新產(chǎn)品，由于發(fā)酵時間很短，不能確保產(chǎn)品已越過亞硝峰，快速發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽殘留量問題也不容忽視。為了發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)向更加健康、營養(yǎng)的方向快速發(fā)展，研究發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽控制技術(shù)十分必要。

1 食品中亞硝酸鹽的危害及限量

在蔬菜發(fā)酵初期酸性環(huán)境尚未形成，具有硝酸鹽還原作用的雜菌將蔬菜中大量硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，使產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量急劇升高。亞硝酸鹽是一種強毒性物質(zhì)，成年人一次性攝入3 g即可致死，其對人體造成的危害，主要包括引起高鐵血紅蛋白癥以及在人體內(nèi)形成致癌物質(zhì)亞硝胺[1]。過多攝入的亞硝酸鹽使紅細胞亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，導(dǎo)致全身出現(xiàn)缺氧反應(yīng)，高鐵血紅蛋白在體內(nèi)達到70%以上時將導(dǎo)致死亡。亞硝酸鹽的長期攝入還會引起維生素A缺乏癥[2]。由亞硝酸鹽引起的胎兒和嬰兒組織性缺氧，嚴(yán)重時會危及生命。亞硝酸鹽本身并不會直接引起人體癌變，但在有仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸存在的如胃液等酸性環(huán)境（pH值2～4）中，可生成具有強烈致癌作用的N-亞硝胺類化合物，這類物質(zhì)可導(dǎo)致食道癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生，飲食中存在過量亞硝酸鹽的地區(qū)常常是消化系統(tǒng)癌癥的高發(fā)地[3]。亞硝胺引起的DNA烷化還具有致畸性，母體過量攝入亞硝酸鹽將可能導(dǎo)致胎兒畸形。

食品中的亞硝酸鹽已引起人們足夠的重視，經(jīng)過聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）食品添加劑委員會的數(shù)次修訂，在2002年亞硝酸鹽的每日允許攝入量（ADI）被建議為每千克體重0～0.07 mg。此外，歐共體建議嬰兒食品中不得使用亞硝酸鹽。中國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》GB2762—2017中規(guī)定，腌漬蔬菜亞硝酸鹽（以NaNO2計）不超過20 mg·kg-1。中國《綠色食品 醬腌菜》標(biāo)準(zhǔn)（NY/T437—2012）中規(guī)定亞硝酸鹽（NaNO2計）≤4 mg·kg-1。

2 研究發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽控制技術(shù)的必要性

大多數(shù)發(fā)酵蔬菜企業(yè)通過延長發(fā)酵時間來控制產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量，市場上正規(guī)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品亞硝酸鹽含量基本在限量范圍內(nèi)。但由于加工原料蔬菜不同、發(fā)酵環(huán)境溫度不定等原因，亞硝酸鹽超標(biāo)現(xiàn)象仍然存在。有研究者對20種市售泡菜的亞硝酸鹽含量檢測，發(fā)現(xiàn)55%的樣品存在超標(biāo)問題，其中白菜（74 mg·kg-1）、蘿卜（32 mg·kg-1）及黃瓜（25 mg·kg-1）的亞硝酸鹽平均含量均超過了國家標(biāo)準(zhǔn)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，成都市的發(fā)酵菠菜亞硝酸鹽含量超標(biāo)率達73.3%，含量最高的超過了150 mg·kg-1[1]。不同蔬菜發(fā)酵過程中亞硝峰出現(xiàn)的時間及峰值存在差異，李海麗對發(fā)酵芹菜、萵筍、大白菜及白蘿卜等做了研究，發(fā)現(xiàn)第5 d時除萵筍和芹菜外，亞硝酸鹽殘留量均達到安全標(biāo)準(zhǔn)，芹菜發(fā)酵至第11 d依然高于20 mg·kg-1[5]。張雁等發(fā)現(xiàn)4個品種的芥菜在20℃、4%鹽濃度下自然發(fā)酵，都在第1 d出現(xiàn)亞硝峰，其中3種芥菜均低于國標(biāo)，但水東芥菜峰值達到36.39 mg·kg-1[6]。亞硝峰出現(xiàn)時間跟環(huán)境溫度高低有關(guān)，5%鹽濃度下，35℃、26℃環(huán)境中發(fā)酵的白菜在第3 d出現(xiàn)亞硝峰（約40 mg·kg-1），20℃在第4 d出現(xiàn)亞硝峰（約50 mg·kg-1），10℃下第6 d才出現(xiàn)亞硝峰（約60 mg·kg-1）[1]。由于季節(jié)等原因，發(fā)酵環(huán)境溫度越低，有可能亞硝峰出現(xiàn)越晚，峰值越大，殘留量超標(biāo)的可能性也相應(yīng)增加。受蔬菜品種及氣溫的影響，生產(chǎn)自然發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品的企業(yè)在通過延長發(fā)酵周期來降低亞硝酸鹽殘留量的過程中，大量的資金往往停留在了這一環(huán)節(jié)，對企業(yè)的運轉(zhuǎn)造成了巨大壓力。一些地區(qū)為了追求發(fā)酵蔬菜爽脆的口感，往往在接近亞硝酸鹽峰值的時間食用發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品，對健康造成了一定的風(fēng)險。探索降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的有效方法，將幫助發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)企業(yè)緩解資金周轉(zhuǎn)問題、創(chuàng)造更大效益，同時滿足大眾對發(fā)酵蔬菜口感的需求，降低亞硝酸鹽可能對人體健康造成的傷害。

3 發(fā)酵蔬菜亞硝酸鹽控制技術(shù)

3.1 通過有機酸控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

有機酸具有一定的還原性，發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的降解可能與有機酸的這一特性有關(guān)。蔬菜本身含有一定量的草酸、抗壞血酸及乙酸等多種有機酸，乳酸作為乳酸菌的代謝產(chǎn)物，蔬菜發(fā)酵后也會積累一定的量。有研究表明草酸、酒石酸和乳酸等均能降解泡菜中的亞硝酸鹽，有機酸初始濃度越高，降解率越高，草酸降解亞硝酸鹽的效果最明顯[7]。有機酸降解亞硝酸鹽的途徑也有研究者做了相應(yīng)的研究，抗壞血酸具有一個強還原性的烯二醇基團，其通過減慢硝酸鹽還原和增快亞硝酸鹽脫氮等方式達到減少亞硝酸鹽積累的效果[8]。龐杰等發(fā)現(xiàn)在醬菜中添加0.04%抗壞血酸，即可阻斷72.33%的亞硝酸鹽生成[9]。檸檬酸有2條途徑減少亞硝酸鹽，一條途徑是通過檸檬酸與亞硝酸鹽作用生成HNO2，由于HNO2極不穩(wěn)定，將繼續(xù)分解為NO；另一條途徑是通過檸檬酸解離出的H+，使NO2-還原為NH4+[10]。

3.2 通過酶控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NiRs）能夠?qū)喯跛猁}降解為NO或NH3，是一種存在于高等植物、藻類植物和許多微生物中的胞內(nèi)酶。蔬菜發(fā)酵中的亞硝酸鹽能夠被乳酸菌代謝產(chǎn)生的NiRs還原，理論上將NiRs提純后添加于發(fā)酵蔬菜中即可降低亞硝酸鹽含量。提取和制備活性酶制劑的方法雖然已有一些報道，但NiRs在胞外作用的效果還不夠理想，離實際生產(chǎn)應(yīng)用還需要更深入的研究。JOSE等將衣藻中的鐵氧化還原蛋白-亞硝酸鹽還原酶固定化，發(fā)現(xiàn)這種方法增加了酶體系在溫度和離子強度方面的穩(wěn)定性，但酶活力有所降低[11]。國內(nèi)研究者通過紫外誘變產(chǎn)NiRs菌株、優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法，提高菌株產(chǎn)酶能力，純化后的酶有一定的降低超標(biāo)食品中亞硝酸鹽的效果[12]。這些工作為后續(xù)酶法控制發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量相關(guān)研究做了鋪墊，但酶的穩(wěn)定性、安全性等方面問題還需要更加深入、全面的研究。

3.3 通過其他物質(zhì)控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

發(fā)酵蔬菜中添加的香辛料能一定程度上減少亞硝酸鹽積累，如姜油酮等成分可以阻止硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；大蒜、大蔥和洋蔥中富含的巰基化合物能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成其他化合物，減少亞硝酸鹽積累[13]。植物提取物如茶多酚、二氫楊梅素等，以及一些富含黃酮類、多酚類化合物的真菌提取物，可以通過抗氧化性或協(xié)同作用來降低發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽[5]。如茶多酚可以保護發(fā)酵蔬菜中的抗壞血酸，促進抗壞血酸對亞硝酸鹽的清除[14]。原花青素能夠在有亞硝酸鹽存在的酸性緩沖溶液中，將亞硝酸還原并生成NO[15]。糖類物質(zhì)也有降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的作用，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、杜仲多糖及殼聚糖等均能有效減少亞硝酸鹽含量[16]。

3.4 通過接種乳酸菌控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

利用乳酸菌來控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽主要是通過其代謝產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶、乳酸等有機酸以及乳酸菌素等抑菌物質(zhì)發(fā)揮作用來實現(xiàn)。發(fā)酵初期，pH值在4.5以上時，亞硝酸鹽的降解主要通過乳酸菌的胞內(nèi)亞硝酸鹽還原酶來實現(xiàn)；當(dāng)pH值降至4.0以下，則通過大量積累的乳酸來降解亞硝酸鹽；而乳酸菌素等可以抑制具有硝酸鹽還原酶活性的腐敗菌、病原菌生長，從而減少產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量。在待制作的發(fā)酵蔬菜中人工接種乳酸菌，乳酸菌本身不產(chǎn)生亞硝酸鹽，還能夠有效降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的殘留量[17]。乳酸菌素具有耐酸耐低溫、降解少的特性，適合開發(fā)為生物防腐劑，ADAMS等認(rèn)為乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸菌素、有機酸、雙乙酰及過氧化氫等物質(zhì)能夠起到抑菌作用[18]。純?nèi)樗峋l(fā)酵生產(chǎn)周期快，產(chǎn)品亞硝酸鹽含量低，在賦予發(fā)酵蔬菜風(fēng)味的同時，乳酸菌的益生作用也改善了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，符合現(xiàn)代人們對健康飲食的需求。

3.5 通過原料、工藝控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

原料是影響發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量的主要因素之一，控制好原料蔬菜品質(zhì)，將可有效控制產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量。選擇沒有過度施肥、管理得當(dāng)、抗壞血酸含量高的蔬菜品種是發(fā)酵加工前的良好保障。此外，還需注意蔬菜采后的儲藏、運輸管理，保證原料新鮮、完好[14]。在實際生產(chǎn)中，除了原料外發(fā)酵蔬菜的亞硝酸鹽含量受多種因素影響，通過消毒器皿、調(diào)節(jié)食鹽濃度、發(fā)酵溫度、起始pH值等方法，能一定程度上減少亞硝酸鹽產(chǎn)生。發(fā)酵初期，沒有達到乳酸菌生長最佳環(huán)境條件，乳酸積累較少，主要通過食鹽發(fā)揮抑菌作用，對食鹽耐受力差的微生物在高鹽環(huán)境中生長受到抑制，從而使硝酸鹽還原過程減緩。但鹽濃度增加到一定量后將抑制乳酸菌的活動，所以傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的腌制鹽濃度一般在5%～10%[5]。在25～30℃條件下乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，硝酸鹽還原酶陽性菌的活動在酸性條件下受到抑制，同時大量積累的乳酸能將已生成的亞硝酸鹽分解。由于高酸度環(huán)境能抑制大腸桿菌等有害微生物，同時加速亞硝酸鹽的降解，添加醋酸等物質(zhì)降低發(fā)酵起始pH值，也能夠有效減少亞硝酸鹽含量[19]。由于硝酸鹽還原酶陽性菌生長一般需要氧氣，而乳酸菌偏好厭氧環(huán)境，發(fā)酵過程中減少容器中的氧氣含量也有助于減少亞硝酸鹽，因此加工時需將蔬菜壓實，發(fā)酵液淹沒菜體，壇沿加水隔絕空氣。

4 小結(jié)

中國制作發(fā)酵蔬菜已有幾千年的歷史，在蔬菜加工產(chǎn)業(yè)中占有重要地位?？刂瓢l(fā)酵蔬菜中有害代謝產(chǎn)物，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全，對于該產(chǎn)業(yè)更加健康、長遠發(fā)展非常關(guān)鍵。發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量受原料類型、環(huán)境溫度等因素影響，要控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽不能一概而論。根據(jù)企業(yè)生產(chǎn)實際，綜合運用現(xiàn)有技術(shù)手段，將是規(guī)?；瘶?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)低亞硝酸鹽發(fā)酵蔬菜的可循之徑。