常 凱，劉晨霞，許宏宣，王艷艷，江忠勇

隨著檢驗水平、數(shù)字化治療設(shè)備和多系統(tǒng)聯(lián)合治療等技術(shù)的發(fā)展，人們對疾病的認知程度越加深入，為了給每位患者提供最合適和理想化的治療措施，精準醫(yī)療的概念應(yīng)運而生[1]。精準醫(yī)療高度依賴于對患者的遺傳學和其他分子生物學或影像數(shù)據(jù)分析，使臨床預(yù)防、診斷和治療更具特異性，能提高預(yù)后水平，降低藥物毒副作用等不良后果發(fā)生。在精準醫(yī)療的大環(huán)境下，基因測序技術(shù)經(jīng)歷了多次換代，成為精準醫(yī)療時代的中堅力量[2]。

基因組攜帶了生物個體的全部遺傳信息，在臨床檢驗學中，基因測序技術(shù)彌補了細胞形態(tài)學、生物化學、微生物與免疫學的短板，能夠直接對人體或病原微生物進行檢測、定量及突變位點分析[3]。

1 基因測序技術(shù)的發(fā)展

基因測序技術(shù)發(fā)明于1977 年，經(jīng)過40 余年的發(fā)展和進化，該技術(shù)已經(jīng)具有了里程碑式的飛躍。

1.1 第一代測序技術(shù) 1977年，TSIATIS A C[4]提出了雙脫氧鏈末端終止法測序，其原理為將ddNTP（缺乏3’-羥基）插入到新和成的DNA 鏈中，使之不能與下一位脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵，迫使DNA合成反應(yīng)停滯。通過電泳分離不同長度的片段，并檢測所測片段的末端堿基，拼接好即為完整DNA序列。在此后近30 年間，隨著標記技術(shù)與工業(yè)水平的提高，同位素標記、熒光標記和毛細管電泳技術(shù)逐漸進行加持，測序通量和自動化均得到了大幅提升[5]。由于一代測序具有操作門檻低、讀取長度長、準確率高（接近100%）等優(yōu)點，目前臨床中多用于單基因病和突變位點的基因檢測，其演變出的毛細管電泳法一直作為基因診斷的標準。然而其缺點也體現(xiàn)在通量小、成本高和檢測速度慢等方面。

1.2 第二代測序技術(shù) 二代測序（Next-generation Sequencing,NGS）技術(shù)是繼一代測序后的一次全新?lián)Q代。大多數(shù)NGS基于邊合成邊測序技術(shù)，將每個DNA片段螯合或連接到一個芯片上，隨后將被標記的核苷酸加入體系使DNA鏈延伸，在成像系統(tǒng)捕獲后通過計算機推演出核酸序列[6]。目前常見的NGS平臺多為基于焦磷酸法的454 平臺、基于可逆染料標記法的Illu?mina 平臺和基于四色熒光標記寡核苷酸法的SOLiD平臺[7]。NGS 相比上一代測序其數(shù)據(jù)量提高了約5 個數(shù)量級，具有通量高、準確度高、靈敏度高和自動化程度高等特點，臨床檢驗中常用于突變位點檢測、病原微生物菌種檢測等方面[8]。

1.3 第三代測序技術(shù) 第三代測序又稱單分子測序技術(shù)，以Pacific Biosciences公司的SMRT（single molec?ular real-time,SMRT）測序和Oxford NanoPore Technol?ogies 公司的納米孔測序為代表。其原理為不同熒光標記的dNTP，與模板鏈互補后熒光基團被DNA 聚合酶剪切，作用時間較長的熒光能夠被捕獲。而沒有與模板配對的堿基停留時間很短，不能被檢測[9]。三代測序在測序數(shù)據(jù)量和準確度上較二代測序并無明顯提高，但其擁有超長的讀取長度（10 kb-15 kb）和運行時間短等優(yōu)點，可作為二代測序的有益補充。臨床多用于病毒基因組檢測分析[10]。

2 基因測序在精準醫(yī)療的應(yīng)用

2.1 病原微生物的檢驗分析 現(xiàn)今，國內(nèi)大部分臨床微生物實驗室采用基于微生物對底物產(chǎn)生的生化反應(yīng)進行自動化菌種鑒定，而藥敏實驗分析系統(tǒng)多是將抗生素微量稀釋在條孔板中加入菌懸液自動孵育并比色分析。對于病毒等不能或難以體外培養(yǎng)的病原微生物常采用抗原抗體檢測等方法[11]?；驕y序技術(shù)基于對微生物遺傳物質(zhì)的特異性能夠?qū)Σ≡⑸锏木N、毒力及耐藥性等進行有效鑒定[12]。

2.1.1 病原微生物的診斷 病原微生物感染導(dǎo)致的疾病往往具有起病急、危害大和具有傳染性強等特點，這就對臨床診斷的準確性和時效性提出了較高的要求?；驕y序針對微生物的檢測技術(shù)應(yīng)運而生并能有效滿足上述需求。對已知參考序列的病原微生物，通過NGS 技術(shù)能夠快速進行鑒別診斷，并能通過序列差異發(fā)現(xiàn)新的變種[13]。在2019 年底爆發(fā)的新型冠狀病毒確診與溯源工作中，NGS技術(shù)扮演了至關(guān)重要的作用。

2.1.2 病原體耐藥基因檢測 病原體耐藥性檢測的傳統(tǒng)方法基于培養(yǎng)與藥敏，其固有缺陷為培養(yǎng)周期長和環(huán)境因素干擾。雖有PCR 和基因芯片方法可以選用，但對于未知突變類型或未證實位點仍不能進行檢測[14]。隨著生物信息學與基因數(shù)據(jù)庫的高速發(fā)展，全基因組測序（whole-genome sequencing, WGS）技術(shù)能夠高效便捷地檢測出獲得性耐藥基因，如乙型肝炎病毒耐藥檢測、人結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測等，均能夠為精準診療提供有益參考[15]。

2.1.3 病原體毒力檢測 病原體毒力評估對于預(yù)防和控制疾病的早期風險至關(guān)重要。WGS 能夠通過數(shù)據(jù)庫對毒力的遺傳標記進行檢測。在精準診療過程中，臨床醫(yī)生可以選擇性地參考數(shù)據(jù)庫中的背景資料指導(dǎo)和評估用藥情況[16]。

2.2 腫瘤診治中的作用

2.2.1 基因測序在腫瘤診療中的應(yīng)用 不斷積累的基因組變化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移特性使得通過影像和病理的方法很難確定腫瘤原發(fā)灶的來源[17]。應(yīng)用NGS 技術(shù)對腫瘤細胞基因組測序并通過數(shù)據(jù)庫比對關(guān)聯(lián)腫瘤與特定基因，對腫瘤的診治具有重要價值。由于不同個體對同一種藥物的敏感性不同，定向殺傷腫瘤細胞的靶向藥物成為個體化治療的焦點。而通過NGS 檢測單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）在指導(dǎo)個體靶向藥物療效中作用顯著，分子靶向治療策略也表現(xiàn)出更加細化和精準化。例如表皮生長因子受體（epider?mal growth factor receptor,EGFR）突變陽性肺癌患者可從酪氨酸激酶抑制劑的治療中獲益[18]；人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）基因受體陽性患者經(jīng)干擾性單克隆抗體曲妥珠單抗在早期和晚期（轉(zhuǎn)移性）乳腺癌的治療中具有療效等[19]。隨著靶藥治療的愈發(fā)精細化，腫瘤個體化治療的“同病異治，異病同治”概念被提出，即針對相同腫瘤的差異化用藥和針對不同腫瘤相同突變型的相同靶藥治療，目前已在臨床中有所應(yīng)用。

2.2.2 遺傳性腫瘤的篩查 在家族聚集性腫瘤中，環(huán)境因素雖有一定作用，但遺傳因素仍然是家族腫瘤高發(fā)的主要原因。腫瘤發(fā)生機制中分為單基因突變和多基因突變，目前明確的單基因遺傳引起的腫瘤包括遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、Wilm 瘤等；而多基因遺傳導(dǎo)致的腫瘤則有鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。NGS技術(shù)對高風險基因進行檢測分析，綜合評估后給出患癌風險[20]。由于不是所有的基因突變都有明確的意義，所以此方法仍存在一些質(zhì)疑。但隨著信息生物學與相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫的愈加完善，將更為準確地預(yù)測腫瘤風險，實現(xiàn)腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防。

2.3 產(chǎn)前篩查與診斷 單基因遺傳病經(jīng)OMIM 收錄的已有8000余種，部分發(fā)病率高且危害較大的常見單基因病已進入臨床檢測目錄，例如遺傳性耳聾、地中海貧血、杜氏進行性肌營養(yǎng)不良、血友病等。NGS 技術(shù)能通過檢測孕婦外周血樣本中的游離DNA（cellfree fetal DNA，cffDNA）確定胎兒染色體是否存在異常[21]。目前，無創(chuàng)產(chǎn)前檢查（noninvasive prenatal test?ing,NIPT）已在國內(nèi)逐漸普及，對于產(chǎn)前篩查高風險、年齡≥35 歲的高齡孕婦以及影像學懷疑胎兒有微缺失微重復(fù)綜合征的人群建議檢測[22]。近年來，NIPT Plus 作為常規(guī)NIPT 的升級版，通過PCR-free 建庫，將檢測疾病種類由3 種擴展到100 多種，其中包含染色體非整倍體、染色體大片段缺失∕重復(fù)、染色體微缺失∕微重復(fù)等。將染色體異常綜合征的篩查覆蓋率提高近4倍。

3 展 望

近十年來，基因組學及基因測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床，并在個體化醫(yī)療中優(yōu)勢明顯。經(jīng)過測序技術(shù)的三代發(fā)展，其成本已大幅降低，但對于病患而言近乎萬元的自費檢查仍然顯得價格高昂。由于檢測平臺的準入成本高、經(jīng)驗及人才的缺乏，測序大多在參考實驗室實行。如果下一代測序技術(shù)能在標準化、低成本、短周期的方向有所提高，必將輔佐精準診療造福于全民。