張. 瑜. 趙. 軍. 喻文立. 曹君利. 胡. 南. 杜洪印△

（1 天津醫(yī)科大學一中心臨床學院麻醉科，天津 300192；2 徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應用技術重點實驗室，徐州 221004；3 天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，天津 300060）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織成員國數(shù)據(jù)統(tǒng)計，每年有接近2.4 億人接受各種類型的手術，其中接近86%的病人術后出現(xiàn)中到重度疼痛，其對術后免疫系統(tǒng)的干擾受到廣泛關注[1]。研究證實，疼痛作為強烈的傷害性刺激通過應激反應顯著抑制免疫功能，進而影響術后病人預后和轉歸[2]。因此，術后疼痛作為重要的免疫抑制因素應進行深入和系統(tǒng)的研究。

干擾素-γ (interferon, IFN-γ) 是激活的NK 細胞和T 細胞產(chǎn)生的免疫活性因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS) 還有部分由小膠質(zhì)細胞分泌[3]。血漿中IFN-γ 在細胞免疫以及腫瘤免疫反應中起關鍵作用[4]，而在CNS 中，特別是海馬，IFN-γ 與許多腦功能紊亂的發(fā)生發(fā)展密切相關，其可誘導CNS 小膠質(zhì)細胞過度反應[5]并參與認知功能障礙的發(fā)展[6]。因而，IFN-γ 是機體免疫狀態(tài)的重要評估指標。一項慢性疼痛研究顯示，關節(jié)痛病人血漿IFN-γ 水平下降，而有效鎮(zhèn)痛后IFN-γ 水平顯著提升，提示慢性疼痛存在免疫抑制作用[7]。而術后急性疼痛對IFN-γ 表達的影響尚未見報道。

納洛酮作為經(jīng)典阿片受體拮抗劑，主要通過拮抗mu 受體逆轉阿片物質(zhì)的鎮(zhèn)痛并參與解毒作用。很多研究也顯示，納洛酮的生物學作用與劑量相關，小劑量納洛酮不抑制阿片藥物鎮(zhèn)痛作用，并可增強其鎮(zhèn)痛效果，且具有穩(wěn)定胃腸功能及降低呼吸抑制的積極作用[8,9]。然而，不同劑量納洛酮鞘內(nèi)單獨應用對術后痛介導的免疫抑制影響及其機制尚未見報道。本研究觀察不同劑量納洛酮鞘內(nèi)給藥對術后痛大鼠海馬和血漿IFN-γ 表達的影響，從中樞及外周整體評估免疫狀態(tài)并揭示其內(nèi)在機制，為改善術后痛介導的免疫抑制提供研究依據(jù)。

方 法

1.實驗材料

本實驗動物進行的研究行為均嚴格遵守相關動物保護及使用規(guī)定。SPF 級健康雄性SD 大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，每籠5 只飼養(yǎng)，自然照明，自由攝食、飲水。參照St?rkson 等[10]的方法，對152 只大鼠行L5～6間隙鞘內(nèi)置管，置入PE10 導管（寧波安來軟件科技有限公司）。大鼠蘇醒后24 h 觀察其活動情況，剔除8 只運動功能障礙大鼠，隨后鞘內(nèi)注射2%利多卡因20 μl，大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹為置管造模成功共144 只，采用隨機數(shù)字表法分為6 組：生理鹽水組（C 組）、術后痛組（P 組）、小劑量納洛酮組（N1 組，1 ng/kg）、大劑量納洛酮組（N2 組，100 ng/kg）、術后痛 + 小劑量納洛酮組（PN1 組，1 ng/kg）、術后痛 + 大劑量納洛酮組（PN2 組，100 ng/kg），每組24 只。

2.方法

術后痛組（P 組）于右足跖肌切口制備術后痛模型。于鞘內(nèi)置管后7 天，參照Brennan 等[11]的方法制備術后痛模型。吸入七氟醚麻醉后右足底近端0.5 cm處向趾部作一長約1 cm切口，切開皮膚筋膜，用眼科鑷挑起足底跖肌并縱向切割，但保持肌肉起止及附著完整，皮膚縫合，切口以青霉素藥液沖洗。制備術后痛模型前20 min 時，N1 組、PN1 組鞘內(nèi)給予納洛酮（批號：h20093199，國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司）1 ng/kg，N2 組、PN2 組鞘內(nèi)給予納洛酮100 ng/kg，各組所用藥液均以生理鹽水稀釋至50 μl，C 組和P 組給予等容量生理鹽水。各組于造模前24 h (T0)、術后1 h (T1)、6 h (T2)、24 h (T3)、48 h (T4)、72 h (T5) 檢測機械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 和熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，各組在T0、T2、T3、T5分別取6 只大鼠即刻斷頭處死，取海馬、外周血（血漿），以ELISA 法檢測IFN-γ 表達。

3. MWT 的測定

將一透明有機玻璃箱 (22 cm×22 cm×12 cm)置于30 cm 高的金屬篩網(wǎng) (1 cm × 1 cm) 上，待大鼠在箱中適應30 min 后，采用電子vonFrey 纖維絲（IITC 公司，美國），垂直刺激大鼠右后足與附近第3、4 趾間皮膚，每次持續(xù)4～6 s。大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應，并記錄此時的刺激強度，每次間隔15 s 以上，共刺激5 次，計算其平均值為MWT。

4. TWL 的測定

將有機玻璃箱置于3 mm 厚玻璃板上，大鼠在箱中自由活動30 min 以適應測試環(huán)境和溫度。室溫穩(wěn)定在24～26℃。采用Model 390 Heated Base 熱痛刺激儀（IITC 公司，美國）照射大鼠足底緊貼玻璃板部位，具體同MWT 測定部位。記錄照射開始至大鼠出現(xiàn)抬足或舔足時間，照射時間不超過20 s，以防止組織損傷。測定5 次，每次間隔至少5 min，取最后3 次刺激的平均值為TWL。

5. IFN-γ 含量測定

取大鼠海馬或外周血（血漿），置于含1 ml濃度為0.2 mol/L 的醋酸溶液勻漿器中勻漿。煮沸10 min，4℃、3500 rpm 離心半徑13.5 cm，離心10 min。取上清放入試管中冰凍、干燥、濃縮后PBS 等容，待測液-80℃保存，采用ELISA 法（試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司提供，檢測限20 pg/ml～480 pg/ml）測定IFN-γ 含量，ELX800酶標儀由美國Bio-Tek 公司提供。

6.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±SD)表示，組間和組內(nèi)比較采用雙因素方差分析，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 鞘內(nèi)給予小劑量納洛酮可提高大鼠MWT，大劑量納洛酮可降低大鼠MWT

術前各組MWT 比較差異無統(tǒng)計學意義。與C組相比，P 組術后1～72 h MWT 降低 (P< 0.05)，表明術后痛模型建立后72 h 內(nèi)大鼠始終處于機械痛致敏狀態(tài)；N1 組術后1、6 h MWT 升高 (P< 0.05)，表明單獨給予納洛酮可升高大鼠機械痛閾值，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；與C 組相比，PN1 組6～72 h MWT 降低 (P< 0.05)，術后1 h 差異無統(tǒng)計學意義，而與P組相比，PN1 組術后1、6 h MWT 升高 (P< 0.05)，表明小劑量納洛酮可在術后6 h 內(nèi)有效升高術后痛大鼠機械痛閾值，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；與C 組相比，N2組術后1、6 h MWT 降低，表明大劑量納洛酮可降低大鼠機械痛閾值，產(chǎn)生痛敏，但N2 組MWT 始終顯著高于P 組，表明此作用遠低于術后痛產(chǎn)生的致敏程度。與P 組相比，PN2 組在術后24 h 的機械痛閾更低，表明給予大劑量納洛酮可能加重術后急性切口疼痛（見圖1A）。

2. 鞘內(nèi)給予小劑量納洛酮可提高大鼠TWL，大劑量納洛酮可降低大鼠TWL

術前各組TWL 比較差異無統(tǒng)計學意義。與C 組相比，P 組術后1～72 h TWL 縮短 (P< 0.05)，表明術后痛模型建立后72 h 內(nèi)大鼠始終處于熱痛致敏狀態(tài)；N1 組TWL 術后1～6 h 延長 (P< 0.05)，表明單獨給予小劑量納洛酮即可產(chǎn)生針對熱輻射的鎮(zhèn)痛作用；與P 組相比，PN1 組術后1～6 h TWL延長 (P< 0.05)，表明在術后6 h 內(nèi)小劑量納洛酮具有鎮(zhèn)痛效果；與C 組相比，N2 組術后1～6 h TWL縮短，表明大劑量納洛酮可降低大鼠熱輻射痛閾值，產(chǎn)生痛敏，但N2 組TWL 始終顯著高于P 組，表明此作用遠低于術后痛產(chǎn)生的致敏程度。與P 組相比，PN2 組在術后24 h 的熱輻射痛閾更低，表明大劑量納洛酮造成急性術后痛模型大鼠更強的痛敏狀態(tài)（見圖1B）。

圖1 大鼠各時點MWT 和TWL 比較 (n = 6,±SD)(A)各時點MWT；(B)各時點TWL*P<0.05, 與C組相比；#P <0.05,與P 組相比Fig. 1 Comparison of MWT and TWL at different time points in 6 groups of rats (n = 6,±SD)(A) MWT level at different time points; (B) TWL level at differenttimepoints*P<0.05,comparedwith group C, #P < 0.05, compared with group P.

3.術后痛模型鞘內(nèi)給予納洛酮對中樞海馬IFN-γ 表達無顯著影響

各組組內(nèi)、組間各時點海馬IFN-γ 表達比較差異均無統(tǒng)計學意義（見圖2），表明術后痛模型、鞘內(nèi)給予納洛酮對中樞海馬IFN-γ 表達無顯著影響。

圖2 大鼠各時點海馬INF-γ 比較 (n = 6,±SD)Fig. 2 Hippocampal INF-γ expression at different time points in 6 groups of rats (n = 6,±SD)

4.術后痛模型鞘內(nèi)給予納洛酮對血漿IFN-γ 產(chǎn)生影響

術前各組IFN-γ比較差異無統(tǒng)計學意義 (P> 0.05)。與C 組相比，P 組術后各時點血漿IFN-γ 表達下調(diào)，6 h 為下調(diào)程度最低點，72 h 為下調(diào)幅度最低點，提示術后痛模型可使大鼠72 h 內(nèi)血漿IFN-γ 表達下調(diào)，隨著時間的延長，IFN-γ 水平逐漸接近生理狀態(tài)。與C 組相比，N1 組在鞘內(nèi)給藥后6 h，血漿IFN-γ 水平升高，提示小劑量納洛酮注射后6 h 內(nèi)可促進IFN-γ表達上調(diào)。與C 組相比，N2 組在鞘內(nèi)給藥后24 h 內(nèi)，血漿IFN-γ 表達下調(diào)，提示大劑量納洛酮在給藥后24 h 內(nèi)，可抑制IFN-γ 表達；與C 組相比，PN1 組術后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達下調(diào)，但與P 組相比，PN1 組術后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達上調(diào)，提示術后痛模型 + 小劑量納洛酮也可使IFN-γ水平降低，但下降幅度明顯低于術后痛模型組。與C 組相比，PN2 組術后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達下調(diào)，但與P 組相比，PN2 組術后72 h 內(nèi)各時點血漿IFN-γ 表達也下調(diào)，提示術后痛模型+大劑量納洛酮顯著抑制IFN-γ 表達，下降幅度顯著高于術后痛模型組。以上結果表明，兩種劑量納洛酮都參與了生理狀態(tài)及術后痛模型大鼠IFN-γ水平的調(diào)節(jié)，但作用相反，鞘內(nèi)小劑量納洛酮可上調(diào)血漿IFN-γ水平，而大劑量納洛酮則產(chǎn)生相反結果（見圖3）。

圖3 大鼠各時點血漿IFN-γ 表達比較(n=6,±SD)*P<0.05，與C 組相比；#P<0.05，與P組相比Fig. 3 Plasma IFN-γ expression at different time points in 6 groupsof rats(n= 6,x±SD)*P <0.05, compared withgroupC; #P < 0.05, compared with group P.

討 論

有報道小劑量納洛酮及其類似物納曲酮[12]可興奮內(nèi)源性阿片生長因子，增加內(nèi)源性阿片釋放[13]，如腦啡肽等，增強阿片類藥物鎮(zhèn)痛作用[14,15]。本研究結果表明，鞘內(nèi)注射1 ng/kg 納洛酮可使切口痛大鼠術后6 h 內(nèi)MWT 升高、TWL 延長，產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效果。小劑量納洛酮可能通過局部下調(diào)TNF-α、IL-1β 及IL-6 等促炎因子表達及上調(diào)抗炎標志物IL-10 的表達抑制神經(jīng)炎癥反應參與疼痛緩解[13]。本研究與既往報道不同的是，小劑量納洛酮不依賴外源性阿片類藥物，單獨應用即可對術后痛大鼠產(chǎn)生顯著鎮(zhèn)痛效果。另外，本研究單純鞘內(nèi)注射小劑量納洛酮，與生理鹽水組相比也表現(xiàn)出了提升痛閾的積極作用，再次證實這一點。然而，單純鞘內(nèi)注射大劑量納洛酮后，顯著降低了術后1～6 h 大鼠疼痛閾值，而術后痛模型大鼠術前給予100 ng/kg 納洛酮后，大鼠出現(xiàn)持續(xù)大于24 h 的疼痛加劇，提示高劑量納洛酮給藥存在致痛敏作用，這與Brennum等和Corder 等[16,17]研究結論一致。有研究顯示高劑量納洛酮可通過抑制內(nèi)源性阿片系統(tǒng)，導致痛覺過敏的再次出現(xiàn)[17,18]。手術損傷后中樞敏化可被傷害性疼痛刺激所誘發(fā)的μ-opioid 受體固有活性物質(zhì)所掩蓋，可長達數(shù)月。但此時的中樞敏化仍然存在，由于MORCA的抑制而形成動態(tài)平衡，故稱為潛在高敏。術后晚期炎癥消退階段，給予高劑量μ 阿片受體拮抗劑（納洛酮/納曲酮）可通過抑制MORCA的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛機制，導致傷害性刺激的潛在高敏復現(xiàn)，從而出現(xiàn)痛敏的臨床表現(xiàn)。潛在高敏的存在可能是慢性術后疼痛的激痛點，需引起重視[17]。本研究結果提示鞘內(nèi)高劑量納洛酮可引發(fā)術后疼痛加劇，而鞘內(nèi)小劑量納洛酮則可以緩解術后疼痛，提高痛閾。

本研究還探討了術后痛模型不同劑量納洛酮，對中樞海馬及外周血漿IFN-γ 表達水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)，術后痛模型、鞘內(nèi)不同劑量納洛酮對中樞海馬的IFN-γ 水平均未產(chǎn)生顯著影響。其可能原因為CNS 具有完整的血腦屏障，可使CNS 免于外界環(huán)境損傷因素的傷害。CNS 內(nèi)完善的免疫抗炎機制，例如細胞水平T，B 調(diào)節(jié)細胞和M2 型少突膠質(zhì)細胞的免疫調(diào)節(jié)作用[19～21]；以及分子水平IL-10和miR124 和基因水平等一系列調(diào)節(jié)機制，是維持CNS 免疫穩(wěn)態(tài)的關鍵因素[22]。因此，本研究認為在術后痛模型、鞘內(nèi)給予不同劑量納洛酮，海馬IFN-γ水平始終維持生理水平，可能受上述中樞免疫平衡機制的自主調(diào)節(jié)，但具體機制尚需進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，術后疼痛顯著抑制血漿IFN-γ表達，隨疼痛閾值降低而下降；術后72 h 疼痛自然緩解，痛閾提升，IFN-γ 水平回升。本研究證實，鞘內(nèi)納洛酮對血漿IFN-γ 可產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)，鞘內(nèi)小劑量納洛酮可改善術后痛大鼠的疼痛程度，明顯上調(diào)術后痛對IFN-γ 的抑制；單純鞘內(nèi)注射小劑量納洛酮與對照組比較也可提高痛閾并增加外周IFN-γ的表達，而后隨著痛閾回降IFN-γ 的表達也逐漸向生理值降低。有報道稱小劑量納曲酮可促進NK 細胞分泌IFN-γ，增強免疫[13]，與本實驗鞘內(nèi)小劑量納洛酮的結果一致。可能原因為，疼痛作為不愉快傷害性刺激感受會增加機體應激引發(fā)免疫細胞的抑制，本課題組前期研究證實[23]術后痛引發(fā)疼痛閾值下降，外周血中NK 細胞數(shù)量也隨之下降，并且NK 細胞是IFN-γ 的重要細胞來源，這可能是本研究術后痛IFN-γ 表達下降的原因之一。有文獻報道術后合理鎮(zhèn)痛可加速NK 細胞活性恢復[24]，另外，腔鏡手術后小劑量納洛酮可增加術后NK 細胞水平和CD4+/CD8+T-cell ratio[25]。本研究術后痛大鼠通過給予鞘內(nèi)小劑量納洛酮很可能通過顯著改善疼痛，提升疼痛閾值，進而降低疼痛介導的應激負荷，改善NK 和T 細胞數(shù)量和活性發(fā)揮上調(diào)IFN-γ 表達和提高機體免疫的作用。其次，文獻證實小劑量阿片受體拮抗劑引發(fā)反射性CNS 內(nèi)源性阿片物質(zhì)增加（如β-內(nèi)啡肽[26]和腦啡肽[27]等），后者在CNS通過阿片受體介導應激反應降低和外周免疫細胞功能增強。

然而，鞘內(nèi)大劑量納洛酮則使大鼠術后疼痛明顯加劇，痛閾下降，增強術后痛介導的IFN-γ 的表達抑制。單純鞘內(nèi)給予大劑量納洛酮也明顯下調(diào)生理狀態(tài)疼痛閾值和IFN-γ 表達。此結果與小劑量納洛酮在本實驗中的作用完全相反。有文獻支持大劑量靜脈應用納曲酮（納洛酮類似物）可引發(fā)多方位的免疫抑制[21]，其中包括免疫因子的表達不足，支持本實驗結果。既往研究提示，疼痛作為強應激因子是免疫抑制的獨立因素，CNS 內(nèi)源阿片系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮積極作用。結合本研究結果認為，大劑量納洛酮加劇疼痛，降低疼痛閾值，進而通過增加應激負荷和CNS 內(nèi)阿片系統(tǒng)相關免疫調(diào)控機制[26,27]，抑制外周IFN-r 表達。

本研究的不足之處在于，血漿中IFN-γ 表達可來自體內(nèi)多種器官，但具體來源無法確定，血漿與全身各器官IFN-γ 表達的相互調(diào)控機制研究還需近一步研究證實。

綜上所述，從本研究結果綜合分析得出，鞘內(nèi)注射不同劑量納洛酮可影響術后痛大鼠血漿IFN-γ的表達，進而參與機體免疫調(diào)節(jié)，而海馬IFN-γ 水平在上述干預條件下始終維持穩(wěn)定。疼痛閾值的調(diào)節(jié)涉及復雜的中樞痛覺整合和神經(jīng)調(diào)控機制，后續(xù)實驗可以增加中樞阿片系統(tǒng)作用部位（如海馬、下丘腦[26,27]等處）的內(nèi)源性阿片肽表達水平檢測，以及外周IFN-γ 產(chǎn)生細胞如NK 細胞和T 細胞數(shù)量和功能狀態(tài)檢測等實驗內(nèi)容，進一步探討不同劑量納洛酮對術后痛免疫狀態(tài)影響的機制。本研究通過檢測中樞海馬及外周血的IFN-γ 表達，從整體水平揭示術后痛和鞘內(nèi)納洛酮干預下中樞和外周免疫狀態(tài)的不同。外周IFN-γ 在術后痛和鞘內(nèi)納洛酮應用后所表現(xiàn)出的變化規(guī)律提示，應盡量避免應用大劑量納洛酮鑒于其增加痛敏和抑制免疫的作用；而可以考慮應用小劑量納洛酮作為術后鎮(zhèn)痛和提升外周免疫水平的輔助用藥，其臨床價值有待大樣本臨床研究證實。