劉春瑩，謝丹丹，韓鵬飛，遲雪梅，遲乃玉，張慶芳

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

貝類毒素來源于有害藻類，可通過食物鏈在海洋生物中積累，對人類健康構(gòu)成了很大的危害[1]。貝類毒素主要包括麻痹性貝類毒素（Paralytic Shellfish Toxin，PST）、神經(jīng)性貝類毒素（Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP）、腹瀉性貝類毒素（Dirraretic Shellfish Poisoning，DSP）和記憶缺損性貝類毒素（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）四大類[2]。其中，PST因分布廣、衍生物多、毒性最強(qiáng)、對人類危害最大，是目前導(dǎo)致全球貝類毒素中毒的強(qiáng)效神經(jīng)毒素而備受關(guān)注[3-5]。

PST主要是由海洋甲藻產(chǎn)生[6]，甲藻被貝類等海洋生物食入后，經(jīng)食物鏈積累形成一類四氫嘌呤衍生物[7]。研究表明，PST中毒機(jī)制是特異性阻斷可興奮細(xì)胞電壓門控性鈉離子通道，主要作用于神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞，抑制動作電位的形成[5，8]。其在貝類等海洋生物體內(nèi)蓄積可導(dǎo)致海洋生物染毒甚至死亡，這不僅使在我國國民經(jīng)濟(jì)中占重要地位的貝類等海產(chǎn)品行業(yè)受到了巨大的沖擊，還影響了我國海產(chǎn)品在國際市場上的聲譽和競爭力，并使海洋生態(tài)平衡遭到破壞；同時PST容易通過食物鏈傳遞，對人類的身體健康和生命安全也存在著潛在的威脅[9-12]。近年來，世界各地赤潮頻發(fā)，染PST毒的貝類海產(chǎn)品導(dǎo)致人類中毒事件時有發(fā)生，每年有數(shù)千例病例，死亡率達(dá)15%[13-14]。據(jù)報道，2017年6月，我國福建省不同區(qū)域陸續(xù)發(fā)現(xiàn)因食用染PST毒的貝類海產(chǎn)品導(dǎo)致中毒的患者累計490余例[15]。因此，尋找排除貝類毒素的有效辦法迫在眉睫。

目前，利用菌株進(jìn)行毒素的降解或處理的生物防治法多有應(yīng)用。王明清等[16]從土壤中分離篩選出可降解嘔吐毒素的暹羅芽孢桿菌 （Bacillussiamensis），可降解小麥中84.6%的嘔吐毒素。不同的研究人員還分別分離出了應(yīng)用于鹽堿地栽培羊肚菌、降解土壤中重金屬污染物鎘的哈茨木霉菌株及去除花生粕中黃曲霉毒素的枯草芽孢桿菌等等[17-19]。如今，利用微生物降解毒素已成為人們研究的熱點，但以微生物角度進(jìn)行PST毒素生物防治的研究幾乎沒有，菌種資源匱乏。

N-磺酰氨甲酰基類毒素是PST的主要成分[20-21]。因此，本研究利用含N-磺酰氨甲?；惗舅睾Ｉ后w培養(yǎng)基，從野生牡蠣消化腺消化液中分離具有耐N-磺酰氨甲?；惗舅啬芰Φ木?，為進(jìn)一步探索PST的生物降解及生物防治奠定基礎(chǔ)，這對海洋生態(tài)保護(hù)、人類健康以及我國海產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

大連黃海海域的野生牡蠣。

1.2 主要試劑與儀器

CRM-C1&2-b標(biāo)準(zhǔn)品，National Research Council Canada；培養(yǎng)基所需化學(xué)試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠；恒溫?fù)u床（CRY-2112），上海茸研儀器有限公司；生物安全柜（LA2-4A1），新加坡藝思高科技有限公司；自動生長曲線分析儀，OY Growth Curves Ab Ltd；恒溫培養(yǎng)箱（LTI-700），上海愛郎儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

海生菌瓊脂PM0811培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，酵母粉1，檸檬酸鐵0.1，NaCl 19.45，無水氯化鎂5.9，硫酸鈉3.24，氯化鈣1.8，氯化鉀0.55，碳酸氫鈉0.16，溴化鈉0.08，氯化鍶0.034，硼酸0.022，硅酸鈉0.004，氟化鈉0.002 4，硝酸銨0.001 6，磷酸氫二鈉0.008，瓊脂15。

海生菌肉湯PM0811培養(yǎng)基（g/L）：海生菌瓊脂PM0811培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.4 牡蠣消化液的制備

在無菌條件下取牡蠣的消化腺，經(jīng)匯集、稱重和研磨后，用1%無菌蛋白胨水沖洗3次，將其（牡蠣消化腺∶無菌蛋白胨水=1 g∶2 mL）超聲破碎（W∶200W、工作4s、間歇5s、5min）后，3000 r/min、4℃下離心5 min，取上清液過0.45μm濾膜得牡蠣消化腺提取物，并將其分裝，然后置于-20℃保存至需要[22]。

1.5 耐N-磺酰氨甲酰基類毒素菌株的分離

取牡蠣消化溶液100μL置于5 mL海生菌肉湯PM0811液體培養(yǎng)基（含1.5 mol/L CRM-C1&2-b毒素標(biāo)準(zhǔn)品1μL）中，25℃，160 r/min共培養(yǎng)至菌液OD600值為0.4～0.6。將培養(yǎng)后所得菌懸液梯度稀釋，10-4～10-6梯度各取100μL涂布到不含有毒素的海生菌瓊脂PM0811培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行三區(qū)劃線純化并接種于斜面培養(yǎng)基4℃保藏。

將分離得到的4株可能能夠耐N-磺酰氨甲?；惗舅氐木攴謩e接種于海生菌肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6時，2%接種量分別接種于無毒素海生菌肉湯PM0811液體培養(yǎng)基和分別含3μL毒素稀釋倍數(shù)為500倍、200倍、10倍的海生菌肉湯PM0811液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，每2 h取樣，測定菌液OD600值，繪制其生長情況曲線，對比分析CRM-C1&2-b毒素對各菌株生長的影響，分離出能夠耐CRM-C1&2-b毒素的菌株。

1.6 耐N-磺酰氨甲?；惗舅鼐甑某醪借b定

1.6.1 菌落特征

劃線接種于海生菌瓊脂PM0811培養(yǎng)基中，觀察單菌落形狀、顏色、大小等表面特征[23]。

1.6.2 菌體特征

采用簡單染色和革蘭氏染色法進(jìn)行染色，并鏡檢觀察菌體的形態(tài)、大小[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐N-磺酰氨甲?；惗舅鼐甑姆蛛x

將1.5 mol/L CRM-C1&2-b毒素與牡蠣消化腺提取液混合，在海生菌肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6后，梯度稀釋涂布于不含毒素的海生菌瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48 h，共分離得到了4株菌株（X1，X2，X3，X4）。將這4株菌分別接種于有毒素和無毒素的海生菌肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2 h取樣，測定菌液OD600，制作其生長情況曲線對比分析。

X2菌株生長曲線（見圖1）結(jié)果顯示，X2菌株在未添加CRM-C1&2-b毒素的培養(yǎng)基中生長，0～2 h處于延滯期，2～12 h處于指數(shù)期，12 h后進(jìn)入平穩(wěn)期；在添加不同含量CRM-C1&2-b毒素之后，X2菌株的延滯期延長，16 h前的指數(shù)期OD600值小于對照組，說明毒素在菌株生長前期對其有抑制作用，菌株在此時期逐漸適應(yīng)毒素環(huán)境；培養(yǎng)16 h后，與對照組相比，低濃度（稀釋500倍）毒素對該菌株的生長無明顯影響；但高濃度毒素（稀釋200倍和10倍）對該菌株的生長有促進(jìn)作用，X2菌株培養(yǎng)液的OD600值大于對照組且與毒素含量成正比。說明X2菌株可能能夠?qū)RM-C1&2-b毒素作為自身生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠利用CRMC1&2-b毒素或分解CRM-C1&2-b毒素并利用其分解物供應(yīng)自身生長。

圖1 X2菌株在不同含量毒素條件下的生長趨勢圖

X4菌株生長曲線（見第90頁圖2）結(jié)果表明，與對照組相比較，添加稀釋了500倍、200倍、10倍CRM-C1&2-b毒素標(biāo)準(zhǔn)品的X4菌株的生長曲線無明顯差異，說明不同濃度的CRM-C1&2-b毒素對X4菌株的生長基本沒有影響，X4菌株可在有CRM-C1&2-b毒素的條件下正常生長。

圖2 X4菌株在不同含量毒素條件下生長趨勢圖

X1和X3菌株生長曲線結(jié)果表明，在添加稀釋了500倍、200倍CRM-C1&2-b毒素標(biāo)準(zhǔn)品時，菌株的生長情況與未加毒素的對照組相近；但當(dāng)毒素稀釋倍數(shù)為10時，X1和X3菌株在培養(yǎng)0～14 h時均未生長；14 h后菌株開始逐漸生長；X1菌株培養(yǎng)30 h時，OD600達(dá)到最大值（0.405），小于對照組的OD600（0.9）；X3菌株培養(yǎng)28 h時，OD600最大值為0.634，小于對照組的OD600（1.048）。說明X1和X3菌株對CRM-C1&2-b毒素也具有一定的耐毒能力，但耐毒能力較弱，高濃度CRM-C1&2-b毒素對X1和X3菌株生長具有明顯抑制作用。

綜上，可初步判斷X2菌株可能具有分解利用CRM-C1&2-b毒素的能力；X4具有較強(qiáng)的耐CRM-C1&2-b毒素的能力，這兩株菌可作為今后麻痹性貝類毒素污染防治及降解措施研究的菌種資源，具有研究價值。

2.2 耐N-磺酰氨甲?；惗舅鼐甑某醪借b定

形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果：將菌株X2，X4分別劃線在海生菌瓊脂PM0811培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)。X2菌株單個菌落呈乳白色、不透明、表面光滑；挑取單菌落簡單染色和革蘭氏染色后鏡檢觀察，為短桿狀、革蘭氏陰性菌，見圖3。X4菌株單個菌落呈白色、不透明、表面光滑、邊緣整齊；挑取單菌落簡單染色和革蘭氏染色后鏡檢觀察，為球狀、革蘭氏陰性菌，見圖4。X2，X4菌株具體種屬的判定還需要做進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定。

圖3 菌株X2的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)

圖4 菌株X4的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)

3 結(jié)論與討論

本研究通過將牡蠣消化腺提取液在含有CRMC1&2-b毒素的條件下共培養(yǎng)后得到的菌液進(jìn)行平板涂布，分離出4株菌株，分別將其接種于有、無毒素標(biāo)準(zhǔn)品海生菌肉湯PM0811液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，繪制其生長曲線，對比分析CRM-C1&2-b毒素對菌株生長趨勢的影響。最終在牡蠣消化腺中分離得到可能具有分解利用CRM-C1&2-b毒素能力的X2菌株和具有耐CRM-C1&2-b毒素能力的X4菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察，判斷均為革蘭氏陰性細(xì)菌，X2為桿菌，X4為球菌。

麻痹性貝類毒素對海洋生物及海產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展、海洋生態(tài)平衡和人類健康具有巨大的危害，世界各國都在尋求對毒素的污染防治及降解措施。從生物法降解毒素的角度出發(fā)，本研究分離得到的這兩株耐麻痹性貝毒CRM-C1&2-b或可降解該毒素的菌株，為麻痹性貝類毒素的生物降解或生物防治研究提供研究基礎(chǔ)和菌種資源。今后若通過基因工程等方法將菌株耐毒和降解毒素能力進(jìn)一步提高，可用于開發(fā)降解麻痹性貝毒的菌劑，減少海洋養(yǎng)殖生物的死亡和麻痹性貝毒的蓄積，在海洋養(yǎng)殖生物的飼養(yǎng)及海洋生態(tài)保護(hù)中具有潛在的應(yīng)用價值。